Strukturell mekanism för ergosterolreglering genom svampens steroltranskriptionsfaktor Upc2

Upc2 är en specifik receptor för ergosterol

Upc2 och Ecm22 har en hög grad av sekvenslikhet i de N-terminala DNA-bindande domänerna, som kännetecknas av ett bevarat Zn(II)2-Cys6-zinkknivmotiv21. Den C-terminala bevarade regionen med cirka 300 aminosyrarester innehåller en transkriptionsaktiveringsdomän (fig. 1a). Eftersom Upc2:s transkriptionsaktivitet är beroende av ergosterolnivåerna i cellen, antog vi att CTD:n kan fungera som en LBD för ergosterol och reglera Upc2:s transkriptionsaktivitet. Dehydroergosterol (DHE) är en naturlig sterol med inneboende fluorescerande egenskaper som finns i låga mängder i S. cerevisiae22,23. DHE är mycket lik ergosterol när det gäller strukturella och kemiska egenskaper med endast en enda dubbelbindningsskillnad och kan ersätta ergosterol i jäst utan någon funktionell störning24. För att testa om Upc2 binder direkt till jäststeroler utförde vi den fluorescerande DHE-bindningsanalysen med hjälp av renade CTD:er av rekombinant Upc2 (rest 598-913). Tryptofanrester av Upc2 exciterades vid 285 nm och fluorescensspektrumet av DHE övervakades. Spektralanalysen visade att tryptofanavdödning vid 340 nm åtföljdes av tre emissionstoppar vid 354, 373 och 393 nm (fig. 1b). Dessa toppar är karakteristiska för DHE, vilket tyder på fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) från Upc2 LBD till bunden DHE25,26. Upc2 LBD binder fritt DHE med nanomolär affinitet, vilket uppmättes genom jämviktsbindningsexperiment (fig. 1b). Upc2 LBD extraherar och binder också DHE som är inbäddad i DOPC-liposomer (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), vilket övervakas av ökningen av fluorescensemissionen vid 375 nm när Upc2 LBD tillsattes till DOPC:DHE-liposomer (fig. 1c, d). När icke-fluorescerande ergosterol tillsattes till blandningen som innehöll DHE-bunden Upc2 minskade fluorescensemissionen, vilket tyder på att ergosterol konkurrerar med DHE om bindningen till Upc2. Tillsats av kolesterol påverkade dock inte DHE-bindningen, vilket tyder på att Upc2 inte binder kolesterol. Andra steroler som 20-hydroxikolesterol, 25-hydroxikolesterol, hydrokortison och β-estradiol konkurrerade inte med DHE, vilket tyder på att Upc2 LBD är en specifik receptor för svampsteroler som ergosterol och DHE (fig. 1e). För att undersöka Upc2:s extraktionsegenskaper för DHE och ergosterol från liposomerna med en fysiologisk lipidsammansättning av jästplasmamembran27 övervakade vi dessutom extraktionen av DHE från liposomerna med fosfatidylkolin/fosfatidyletanolamin/fosfatidylinositol/fosfatidylserin/DHE (40:40:10:8:2, mol %) och den kompetitiva bindningen av ergosterol med efterföljande tillsats av liposomerna med fosfatidylkolin/fosfatidyletanolamin/fosfatidylinositol/fosfatidylserin/ergosterol (25:25:10:10:10:30, mol %) vid 6.5 μM och 23 nM liposomer respektive protein (kompletterande figur 1). Upc2 binder DHE och ergosterol på ett liknande sätt som DOPC/DHE-liposomer. Ecm22, den nära homologen till Upc2, binder också till fritt DHE på samma sätt som Upc2 (fig. 1f).

(a) Schematisk presentation av domänstrukturerna för Upc2 och Ecm22 i S. cerevisia (S.c.) och C. albicans (C.a.). (b) Bindningskurvor för DHE för Upc2 LBD av vildtyp och den C-terminala trunkeringsmutanten av Upc2 LBD (Δ878-913). Intensiteten av fluorescensemission vid 375 nm för proverna (λex=285 nm) plottades med ökande mängder DHE-koncentrationer. Varje datapunkt som visas är medelvärdet av tre mätningar med felmarker som representerar s.d. Anpassningskurvor till datapunkterna beräknades baserat på modellen för en platsbindning. En uppsättning fluorescensemissionsspektra för Upc2 LBD av vildtyp visades i den högra panelen. Fem tryptofanrester som ligger inom 15 Å från bindningsfickan indikerades med röda sfärer i den högra panelen. (c) Realtidsmätning av DHE-extraktion av Upc2 LBD från stora DOPC-liposomer. Liposomerna innehöll totalt 124 μM fosfatidylkolin och DHE i ett 98:2 molförhållande. Upc2 LBD tillsattes till liposomerna med en slutlig koncentration på 0,73 μM i början av den kinetiska mätningen. Icke-fluorescerande ergosterol eller kolesterol tillsattes till slutkoncentrationen 2,5 μM vid 40 minuter för kompetitiv bindning till DHE. (d) Fluorescensemissionsspektra (λex=285 nm) av proverna under och i slutet av kinetiken visas för c. (e) Fluorescensemissionsspektra (λex=285 nm) av olika steroler för konkurrenskraftig bindning till DHE. Upc2 LBD 0,6 μM laddades med 2,5 μM fri DHE. Tre olika linjer i varje experiment representerar olika koncentrationer av konkurrerande ligander (25-hydroxykolesterol, 20-hydroxykolesterol, hydrokortison och β-estradiol) med 2,5, 4 och 10 μM respektive. β-estradiol är en naturligt fluorescerande förening. Asterisk anger β-estradiols inneboende fluorescensemission vid 310 nm (λex=285 nm). (f) Fluorescensemissionsspektra av Ecm22 LBD vid DHE-bindning.

För att jämföra de sterolligander som identifierats genom in vitro-experiment med den naturliga ligand som fångats upp av Upc2 från jästcellslysat karakteriserade vi den ligand som extraherats av Upc2 med hjälp av omvänd fas-högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och vätskekromatografi-massaspektroskopianalyser (fig. 2). Den fångade liganden var uteslutande ergosterol utan några påvisbara arter av andra lipider. Med tanke på likheterna i strukturella och kemiska egenskaper mellan ergosterol och DHE, och att ergosterol är mycket rikligare än DHE i jästceller, drog vi slutsatsen att ergosterol är en fysiologisk ligand för Upc2.

(a) HPLC-elutionsprofil i omvänd fas av ren ergosterolstandard (Sigma 45480) och den ligand som extraherats från Upc2 LBD. (b) Masspektroskopisk analys av ergosterolstandard och liganden som extraherats från Upc2 LBD. Identifiering av den ligand som fångades upp av Upc2 uppnåddes genom jämförelse av kromatografiska egenskaper och masspektroskopi med referensstandarden och litteraturdata56. AMU, atomic mass unit; UV, ultraviolett.

Upc2 LBD uppvisar ett nytt α-helikalt veck

För att undersöka strukturen hos Upc2:s C-terminala LBD utförde vi kristallografiska studier på olika C-terminala konstruktioner. Kristallerna av apo Upc2 LBD och ergosterolbunden Upc2 LBD kristalliserades men de diffrakterade inte vid synkrotronstrålning. För att förbättra diffraktionskvaliteten hos Upc2 LBD-kristaller konstruerade vi ett fusionsprotein (Upc2 LBD-T4L) där T4-lysozym ersätter den variabla slingan (rester 715-725) i Upc2 (ref. 28). Upc2-T4L-fusionsprotein uttrycktes stabilt och uppvisade goda DHE-bindningsegenskaper (fig. 3a), vilket tyder på att T4-lysozymfusionen inte stör ligandbindningen och proteinveckningen. Strukturen av den C-terminala LBD av apo Upc2 (rester 598-878)-T4L som saknar de C-terminala 35 resterna bestämdes med en upplösning på 2,9 Å med hjälp av metoden för enkel anomal dispersion med hjälp av selenometheionin-märkta kristaller. Den slutliga strukturen som innehåller två molekyler av Upc2-T4L och 29 vattenmolekyler i den asymmetriska enheten förfinades till en R-faktor på 24,9 % (tabell 1).

(a) Fluorescensemissionsspektra av Upc2 LBD-T4L fusionskonstrukt (rester 598-913) vid DHE-bindning. (b) Total struktur för Upc2 LBD. Strukturen färgades med rött till blått baserat på sekundärstrukturens succession. T4-lysozym fusionerat i α5-α6-slingan visades inte för tydlighetens skull. (c) Övergripande struktur av Upc2 LBD-T4L dimer med cylindrisk representation. Placeringen av den djupa hydrofoba fickan i en av Upc2-protomererna anges med en svart cirkel. (d) Ytlig representation av Upc2 LBD-monomer. Resterna som utgör väggen i den hydrofoba fickan visas med pinnar. Den hydrofoba fickan visas i en grå ytrepresentation. Conc., koncentration; C-term, C-terminal; N-term, N-terminal.

Strukturen av apo Upc2 LBD uppvisar ett klotformigt α-helikalt veck med en oval form (fig. 3b). Upc2 LBD består av 11 α-helixer och anslutande slingor. Det finns en liten predikterad α-helix (α12, rester 889-896) i den C-terminala loopregionen som inte ingick i den kristalliserade konstruktionen. De 11 α-helixerna är arrangerade så att de bildar en sluten klämma som skapar en djup ficka i proteinets kärna. De tre första α-helikerna utgör de N-terminala fingrarna och helikerna α8-α9, α7 och α11 utgör de övriga fingrarna i klämman. De fyra spiralerna α3-α6 komponerar den centrala handflatan som ett spiralformigt buntband. Slingan α7-α8 (rester 760-799) omger spiralerna α8-α9 som den längsta slumpmässiga spiralen i strukturen. T4-lysozym som ersätter nio rester i α5-α6-slingan är nära placerad på ytan av Upc2 LBD (fig. 3c).

Strukturen av Upc2 LBD avslöjar en central hydrofob ficka omgiven av α-helixer (fig. 3d). Den djupa hydrofoba fickan har en volym på 287 Å3. Helikerna α5 och α6 utgör fickans botten och helikerna α1-α2, α7, α9 och α11 utgör väggen i den hydrofoba bindningsfickan. Fickan är tillgänglig för ett lösningsmedel med en liten por på ytan. Närvaron av en hydrofob ficka föreslog för oss att den kan fungera som en bindningsplats för små lipofila molekyler. Vid strukturell jämförelse av Upc2 med kända strukturer i PDB med hjälp av DALI-servern hittades inga relaterade strukturer med Z-poäng >7, vilket tyder på att Upc2 LBD representerar en ny veckning av en LBD.

Upc2 LBD bildar en konstitutiv homodimer

Size-exclusion chromatography (SEC)-analys visade att den rekombinanta Upc2 LBD eller Upc2 LBD-T4L är en homogen dimer utan en påvisbar monomer art, vilket tyder på att dimer Upc2 är en biologiskt relevant form. Dimern av Upc2 LBD innehåller två sterolbindningsställen och ligandbindningen påverkade inte Upc2:s oligomeriska tillstånd som analyserats med SEC (fig. 4a). Det fanns två molekyler av Upc2 LBD-T4L som var förbundna med varandra genom en icke-kristallografisk tvåfaldig axel i den asymmetriska enheten i kristallerna. Upc2 LBD dimeriseras genom att spiralerna α1 och α2 bildar ett fyrhelixbunt i dimergränssnittet (fig. 4b). N-terminerna i Upc2 LBD-dimeren är exponerade på samma sida nära mitten av dimergränssnittet. Dimergränssnittet består huvudsakligen av hydrofoba rester som begraver 1 562 Å2 av ytan vid gränssnittet (fig. 4c). Met610 är placerad i mitten av dimergränssnittet. M610R-mutanten är en monomer i lösning som analyserats med SEC, vilket tyder på att den dimer som observerats i kristallstrukturen stämmer överens med den som observerats i lösning (fig. 4a). LBD:erna hos C. albicans Upc2 och S. cerevisiae Ecm22 är också dimerer i lösning och M506R-mutationen hos C. albicans Upc2 ledde till monomerisering av LBD:en. Bevarandet av de rester som utgör dimergränssnittet i Upc2-homologer tyder på att homodimeriseringen av LBD:er är ett generellt kännetecken för dessa proteiner (kompletterande fig. 2).

(a) Profiler av SEC för LBD:er från S. cerevisiae (S.c.) Upc2, C. albicans (C.a.) Upc2 och S. cerevisiae Ecm22. Profiler för vildtyp och dimergränssnittsmutanter (M610R i S. cerevisiae Upc2 och L506R i C. albicans Upc2) visas i blått respektive grönt. Profilerna för ergosterolbundna Upc2- och Ecm22 LBD:er visas med röda linjer. Ergosterolbundna LBD:er framställdes genom att blanda renade LBD:er och ergosterol i ett molärt förhållande 1:5 och blandningen inkuberades över natten före SEC-analys. (b) Sidovy av Upc2 LBD-dimer. (c) Detaljerad bild av Upc2-dimergränssnittet. En protomer visas i regnbågsfärg och den andra i vitt.

Den C-terminala slingan är väsentlig för ligandbindning

Majoriteten av de konstitutiva aktiveringsmutationerna i S. cerevisiae Upc2 och C. albicans Upc2 är grupperade i den C-terminala slingan mellan helix α11 och den förutsagda α12-helixen21,29. Kristallstrukturen omfattar inte denna C-terminala aktiveringsslinga på 35 rester. För att undersöka den funktionella betydelsen av denna C-terminala slinga utförde vi ligandbindningsanalyser på de C-terminala deletionsmutanterna av Upc2 LBD (fig. 5a). Trunkering av de C-terminala 14 resterna (Δ900-913) påverkade inte ligandbindningen. Däremot upphävde deletion av de C-terminala 35 resterna (Δ879-913), inklusive den förutsagda α12, DHE-bindningen, vilket tyder på att den C-terminala glycinrika slingan och helixen α12 är väsentliga för ligandbindning (fig. 5b). Dessutom inhiberade G888D, en konstitutiv aktiveringsmutation i α11-α12-slingan DHE-bindning signifikant.

(a) Fluorescensemissionsspektra för olika mutanter vid DHE-bindning. Emissionsspektren vid flera tidpunkter visades i olika färger. (b) Bandrepresentation av den hydrofoba fickan. Den hydrofoba fickan visas i grå ytrepresentation. Det spekulativa spåret av den C-terminala aktiveringsslingan som inte ingick i den kristalliserade konstruktionen visas med röda prickar.

Kristallstrukturen av Upc2 LBD visar en djup hydrofob ficka som kan rymma en enda sterolmolekyl. Storleken på bindningsfickan i apo Upc2 LBD som saknar den C-terminala aktiveringsslingan är dock något mindre än dimensionerna på ergosterol vilket innebär att Upc2 LBD måste genomgå en konformationsförändring vid ligandbindning. För att identifiera de strukturella determinanterna för Upc2:s sterolbindning försökte vi samkristallisera Upc2 LBD med ergosterol. På grund av den dåliga diffraktionen av sterolbundna Upc2-kristaller var det dock inte möjligt att strukturellt bestämma ligandkomplexet. Alternativt testade vi effekten av flera mutationer i den hydrofoba fickan på sterolbindningen. Mutationen av rester distalt från fickan, V699Y och R752A, påverkade inte ligandbindningen. Mutation av rester i den hydrofoba bindningsfickan till skrymmande rester (L703F och L820W) minskade DHE-bindningen betydligt, vilket bekräftar att den hydrofoba fickan rymmer sterol (fig. 5b). Dessutom upphävde M610R-mutationen helt sterolbindningen, vilket innebär att dimeriseringen av Upc2 LBD krävs för sterolbindning. LBD:erna hos alla Upc2-homologer i svamparter uppvisar en hög grad av sekvenskonservering (kompletterande figur 2). Specifikt är de rester som ligger i dimeriseringsgränssnittet, ligandbindningsfickan och den C-terminala aktiveringsslingan strikt konserverade.

Cytosolisk Upc2 relokaliserar till kärnan vid aktivering

De unika strukturella och ligandbindande egenskaperna hos Upc2 föreslog för oss att Upc2 kan relokaliseras till kärnan vid ligandbindning i cytosol. Vi undersökte den cellulära lokaliseringen av Upc2 i full längd och dess mutanter under ergosterolrika eller ergosterolfattiga förhållanden. Tidigare fanns det flera motstridiga rapporter om lokaliseringen av Upc2 i kärnan, cytoplasman och perinukleära foci med hjälp av C-terminal grön fluorescerande protein (GFP)-fusion30,31,32. De viktigaste bestämningsfaktorerna för Upc2:s lokalisering har dock inte definierats experimentellt. I den här studien, för att undvika den funktionella interferensen av GFP med den C-terminala aktiveringsslingan och ligandbindning, märktes GFP till Upc2:s N-terminus. Upc2 av vildtyp finns mestadels i cytosolen med en svag nukleär lokalisering i 30 % av cellpopulationen. När jästcellerna odlades i närvaro av 5 mM ergosterol lokaliserades Upc2 nästan uteslutande till cytoplasman. Tillsats av 4 μg ml-1 flukonazol till odlingsmedierna, som hämmar biosyntesen av ergosterol, flyttade dock lokaliseringen av Upc2 till kärnan i en hel cellpopulation (fig. 6). Upc2 innehåller en tvådelad kärnlokaliseringssignal (NLS) uppströms dess Zn2-Cys6 klustersekvens som ger en inneboende kärnlokaliseringsegenskap. Genom borttagning av NLS (rester 2-43) blev Upc2 helt cytosolisk. Dessutom var den isolerade LBD (rester 598-913) eller konstruktionen som saknade NLS-DBD (konstruktionsrester 283-913) helt cytosolisk oavsett sterolnivåer. Däremot visade deletion av den C-terminala LBD (ΔLBD, konstruktionsrester 1-559) stark nukleär lokalisering oberoende av sterolnivåerna. Dessa data tyder på att den ergosterolbundna C-terminala LBD:n undertrycker den nukleära transporten av Upc2 genom att hämma NLS-funktionen. Dissocieringen av sterolliganden från Upc2 kan leda till exponering av NLS eller frigöra Upc2 från fångst av cytosoliska proteiner för kärntransport. Deletion av den C-terminala slingan (Δ879-913) som stör ergosterolbindningen ledde till blygsam nukleär lokalisering av Upc2. G888D eller mutationer i den sterolbindande fickan (L820W eller L703F) ledde till stark konstitutiv kärnlokalisering av Upc2. M610R-mutationen som bryter dimeriseringen av LBD och ligandbindning visar mestadels kärnlokalisering oavsett sterolnivå, vilket tyder på att dimeriseringen av Upc2 är nödvändig för dess reglerande funktion. Sammanfattningsvis tyder dessa observationer tillsammans med ligandbindningsanalyser på att sterolbindning är den viktigaste mekanismen för att reglera TF:s lokalisering. I ett sterolrikt tillstånd är Upc2 bunden till ergosterol och finns i cytosolen som en reprimerad form. Vid utarmning av ergosterol aktiveras obundet Upc2 och rör sig till kärnan för transkriptionsaktivering av relaterade gener.

Celler odlades i 4 μg ml-1 flukonazol eller 5 mM ergosterol i 12 timmar före visualisering med fluorescensmikroskopi. De övre panelerna visar lokaliseringen av GFP-Upc2. DAPI färgar både kärn-DNA som sfärer och mitokondrie-DNA som ljusa fläckar som skymmer drag av kärn-DNA-segregation. Kärn-DNA kan särskiljas från mitokondrie-DNA genom sin storlek och form. Upc2:s nukleära lokalisering framträder som ljusgröna sfärer inuti cellerna. Skalstreck, 3 μm.

Upc2 reglerar ergosterolnivån i jästceller

Upc2 och Ecm22 binder till ett bevarat 7-bp sterolreglerande element inom promotorerna för de flesta ERG-gener inklusive ERG2, ERG3 och ERG11 (refs 2, 21). För att undersöka mekanismen för transkriptionsreglering av Upc2 kontrollerar vi transkriptionsaktiviteten hos olika Upc2-konstruktioner med ERG2-LacZ som reporter (fig. 7a). Upc2 av vildtyp uppvisade en måttlig transkriptionell aktivitet under normala tillväxtförhållanden. Flukonazolbehandling ökar transkriptionsaktiviteten mer än två gånger. Tom plasmid eller deletion av den C-terminala LBD visade dock mycket svag transkriptionsaktivitet, vilket tyder på att LBD är nödvändig för Upc2:s transkriptionsaktivitet. G888D-mutationen visade, oavsett flukonazolbehandling, en fullständig konstitutiv aktivering av Upc2, vilket är 1,2 gånger högre än den inducerade vildtypen. Denna observation stämmer överens med den tidigare rapporten om att CTD är väsentlig för transkriptionsaktiveringen av Upc2 (ref. 21). M610R visade ingen ökning av transkriptionsaktiviteten vid steroldepletion, vilket tyder på att dimerisering är nödvändig för regleringsfunktionen. Deletion av den C-terminala aktiveringsslingan (ΔCT) som visar konstitutiv nukleär lokalisering visade dock minst 30 % lägre transkriptionsaktivitet än oinducerad vildtyp. Dessutom ökade inte ΔCT:s transkriptionsaktivitet vid flukonazolbehandling. Dessa data tyder på att den C-terminala aktiveringsslingan är väsentlig inte bara för regleringen av proteinlokaliseringen utan även för Upc2:s fulla transkriptionsaktivitet. Störning av sterolbindning genom L703F eller L820W visade konstitutiv kärnlokalisering. Transkriptionsaktiviteterna hos dessa mutanter var dock 40 % lägre än hos vildtypen och ökade inte nämnvärt vid flukonazolinduktion. Det verkar som om införandet av skrymmande rester i den sterolbindande fickan inte bara stör sterolbindningen utan också stör Upc2:s korrekta konformation för full transkriptionsaktivitet. Dessa observationer tillsammans med ligandbindnings- och cellokaliseringsexperiment tyder på att sterolbindning inte bara reglerar proteinlokalisering utan också reglerar transkriptionsaktiviteten hos Upc2. För att bekräfta att Upc2 är involverad i regleringen av ergosterolnivån i cellerna kvantifierade vi det totala ergosterolinnehållet i jästceller som innehöll vildtyp eller muterade UPC2-alleler (Fig. 7b). Eftersom Upc2 aktiverar uttrycket av ergosterolbiosyntetiska gener är det tänkbart att jästcellernas sterolnivå indirekt korrelerar med Upc2:s transkriptionella aktivitet. I avsaknad av UPC2- och ECM22-gener var sterolnivåerna i jästcellerna svagt påvisbara, och tillsatsen av 4 μg ml-1 flukonazol hämmade allvarligt jästcellstillväxten. Upc2 av vildtyp uppvisade en liknande ergosterolnivå i cellen som L703F och L820W i frånvaro av flukonazol. Flukonazolbehandlingen undertryckte ergosterolnivån med cirka 40 % i vildtyp-, L793F- och L820W-stammarna. Utslagning av de C-terminala 35 resterna (ΔCT) resulterade i en något högre ergosterolnivå än vildtypceller. Flukonazol undertryckte dock sterolnivån i ΔCT- och M610R-mutantcellerna mer signifikant än i vildtypcellerna. Upc2 som saknar LBD uppvisade en viss basal nivå av sterolsyntes i frånvaro av flukonazol. Närvaron av 4 μg ml-1 flukonazol hämmade dock sterolnivån och celltillväxten signifikant. De celler som uttrycker G888D-mutanten har tre gånger högre ergosterolnivåer jämfört med de celler som uttrycker Upc2 av vildtyp. Ergosterolnivåerna var högre i flukonazolbehandlade G888D-mutantceller jämfört med de som fanns i vildtypceller som odlades utan flukonazol. Dessa data tyder på att G888D-mutationen konstitutivt aktiverar Upc2 för biosyntesen av ergosterol, vilket leder till en ökad resistens mot azolantisk svampmedel. För att bekräfta att Upc2 är involverad i regleringen av genuttrycket av ergosterolbiosyntetiska enzymer utförde vi kvantitativ genuttrycksanalys av ERG11 genom realtids-PCR med hjälp av upc2/ecm22-knockoutstammar med vildtyp och muterade UPC2-alleler. Vi mätte mRNA-nivåerna för ERG11-gener som normaliserades med TAF10-genen som intern kontroll33. Data visar att mRNA-uttrycksnivåerna av ERG11 korrelerar med promotoraktiviteterna för ERG2 och ergosterolnivåerna som förväntat (kompletterande figur 3).

(a) Transkriptionsaktivitet för Upc2. ERG2-lacZ-reportrar användes för att bestämma bidraget från varje Upc2-konstruktion till regleringen av ERG2-promotorn. β-galaktosidasanalyser utfördes på varje transformant efter att 5 ml kulturer odlats i 16 timmar antingen i minimalt medium (oinducerat) eller i minimalt medium innehållande 4 μg ml-1 flukonazol (inducerat). Analysvärdena representerar genomsnittet av tre oberoende experiment. Alla felstaplar anger s.d. P-värdena bedömdes med hjälp av tvåsidigt Student’s t-test. *P<0,05 jämfört med vildtyp, #P<0,05 jämfört med varje mutant utan flukonazol. (b) Kvantifiering av total ergosterol i jästceller. Jäststammar upc2Δ ecm22Δ som innehöll olika UPC2-alleler analyserades med avseende på deras ergosterolinnehåll. Varje datapunkt är medelvärdet av tre mätningar. Alla felstaplar anger s.d. P-värden bedömdes med hjälp av tvåsidigt Student’s t-test. *P<0,05 jämfört med vildtyp, #P<0,05 jämfört med flukonazolbehandlad vildtyp. (c) Mottagningsförmåga för flukonazol hos jäststammar som uttrycker vildtyp eller muterad UPC2-allel. Stammarna odlades inledningsvis utan flukonazol och spädningsserierna spottades på agarplattor som innehöll flukonazol och inkuberades i 36 timmar.

Aktivering av Upc2 ger resistens mot svampmedel

För att undersöka sambandet mellan aktivering av Upc2 och resistens mot svampmedel kontrollerade vi flukonazolkänsligheten hos upc2Δ ecm22Δ eller ecm22Δ-stammar som uttrycker vildtyp- eller muterad UPC2-allel (fig. 7c). Eftersom flukonazol stör jästcellstillväxten genom att hämma ergosterolbiosyntesen visade de övergripande mönstren för celltillväxten en korrelation med sterolnivåerna i de celler som behandlats med flukonazol. Dubbel knockout-celler av upc2Δ ecm22Δ växte inte i närvaro av flukonazol. Införande av UPC2 av vildtyp möjliggjorde en svag celltillväxt vid 8 μg ml-1 flukonazol. De jästceller som uttrycker en G888D-mutant visade en signifikant ökning av resistensen mot flukonazol vid 8 μg ml-1. G888D-mutanten växte dock svagare än vildtypen i avsaknad av flukonazol, vilket tyder på att fullständig konstitutiv aktivering av Upc2 är ofördelaktig under icke-selektiva förhållanden genom att den medför en metabolisk börda34. ΔLBD-mutanten som saknar transkriptionsaktivitet växte inte vid den lägsta flukonazolkoncentrationen. Mutanter L820W, L703F, M610R och ΔCT som stör sterolbindningen var mer mottagliga för flukonazol än vildtypen. En enda upc2Δ-knockout-stam med ECM22-allelen möjliggjorde svag tillväxt i en låg koncentration av flukonazol, vilket tyder på att ECM22 har en delvis överlappande roll när det gäller att aktivera gener som är involverade i azolresistens. I flukonazolkoncentrationer högre än 6 μg ml-1 uppvisade dock inte upc2Δ- och upc2Δ ecm22Δ-stammar några signifikanta skillnader i känslighet för alla Upc2-konstruktioner, vilket tyder på att Upc2 spelar en dominerande roll i sterolregleringen. Detta stämmer överens med de tidigare observationerna att deletion av UPC2 resulterar i ketokonazolkänslighet, medan ingen effekt observerades med Ecm22-deletion, vilket tyder på att Ecm22 och Upc2 har specifika mål med vissa väsentliga överlappande funktioner35,36.

Upc2 är en ny klass av zinkfinger-TF:er

Nyligen genomförda studier har föreslagit att flera medlemmar i svampens zinkklusterfamilj av transkriptionsregulatorer kan representera funktionella analoger till metazoers NRs13,18,19,20.

Och även om svampens zinkkluster-TF:er inte har någon uppenbar sekvens- eller strukturell likhet med metazoernas NR:er, uppvisar Upc2 konceptuella likheter med steroid-NR:er när det gäller allmänna domänarkitekturer, bindning av sterolligander, homodimerisering, ligandberoende transkriptionsreglering och nukleär translokation.

Upc2 och metazoernas NR:er innehåller båda zinkfinger-DNA-bindningsdomäner i sina N-terminala regioner. Zinkfingrar som samordnar två zinkjoner består av sex cysteiner för Upc2 och fyra cysteiner i var och en av de två fingrarna för NRs37. De DNA-bindande domänerna hos NRs och Zinc Cluster TFs är strukturellt likartade och de binder till DNA som homo- eller heterodimerer13. Zinkfinger-TFs har en C-terminal negativ regulatorisk domän, som för ett antal familjemedlemmar medierar ligandbindning eller respons på små molekyler som cellulära metaboliter och lipofila ligander13. Transkriptionsaktiviteten hos Upc2 regleras av ergosterol, som funktionellt liknar typ I steroid NRs när det gäller ligandspecificiteter. Upc2 och steroidreceptorer bildar båda homodimerer. Upc2 bildar konstitutiva homodimerer oberoende av ligandbindning. Östrogenreceptor α har rapporterats existera som en dimer även i apo-tillstånd och ligandbindningen stabiliserar homodimern ytterligare38.

Strukturell jämförelse av Upc2 med däggdjurs steroid-NRs avslöjar att Upc2 har ett distinkt α-helikalt veck av LBD från däggdjurs-NRs (Supplementary Fig. 4). Båda genregulatorerna består huvudsakligen av cirka 12 α-helikala strukturer med liknande dimensioner av LBD:er. LBD:er av Upc2, östrogen- och progesteronreceptorer bildar dimerer genom helixbuntinteraktioner. Förutom den övergripande konfigurationen av dimererna med ligandbindningsställen nära placerade vid dimergränssnittet finns det dock ingen tydlig strukturell homologi mellan Upc2 och NR-receptorerna. Vid ligandbindning dissocieras steroidreceptorer från värmeschockproteinet Hsp90 i cytosolen och translokaliseras till kärnan där de binder sig till sina målgenpromotorer som homodimerer17. Konsekvent regleras translokaliseringen av Upc2 från cytosolen till kärnan på ett ligandberoende sätt.

Och Upc2 LBD uppvisar en helt annorlunda strukturell veckning jämfört med LBD:erna hos NR från metazoer. Avsaknaden av sekvens- och strukturella likheter mellan svampens zinkkluster-TFs och metazoernas NRs tyder på att de arkitektoniska och funktionella likheterna är en produkt av konvergent evolution med gemensam mekanistisk strategi. Fylogenetisk analys visar att Upc2:s ortologer endast kan identifieras inom Saccharomycotina och att Upc2/Ecm22-proteinerna bildar en monofyletisk klunga som inte är nära besläktad med några andra Zn2-Cys6-proteiner från Saccharomycotina5. Den knoppande jästen, S. cerevisiae, innehåller cirka 50 Zn2-Cys6 TFs39. Även om sekvenshomologin mellan Upc2 och andra typer av zinkfinger-TF:er är låg har de en bevarad svampspecifik sekvens inom den C-terminala LBD:n som tidigare var känd som MHR (middle homology region)40. Den C-terminala regionen, inklusive MHR, i zinkfinger-TF:er innehåller vanligen 13-15 α-helixer av sekundärstrukturelement, vilket innebär att närvaron av en LBD är ett generellt kännetecken för denna proteinfamilj. Sammanfattningsvis representerar Upc2 en ny klass av zinkfinger-TFs som uppvisar en funktionell analogi med metazoernas steroidreceptorer.