Articles / 2 października, 2021

Strukturalny mechanizm regulacji ergosterolu przez grzybowy sterolowy czynnik transkrypcyjny Upc2

Upc2 jest specyficznym receptorem dla ergosterolu

Upc2 i Ecm22 wykazują wysoki poziom podobieństwa sekwencji w N-końcowych domenach wiążących DNA, charakteryzujących się konserwowanym motywem palca cynkowego Zn(II)2-Cys621. C-końcowy, konserwowany region o długości około 300 reszt aminokwasowych zawiera domenę aktywacji transkrypcji (Rys. 1a). Ponieważ aktywność transkrypcyjna Upc2 jest zależna od poziomu ergosterolu w komórce, wysunęliśmy hipotezę, że CTD może służyć jako LBD dla ergosterolu i regulować aktywność transkrypcyjną Upc2. Dehydroergosterol (DHE) jest naturalnym sterolem o wewnętrznych właściwościach fluorescencyjnych, który występuje w niewielkich ilościach w S. cerevisiae22,23. DHE jest bardzo podobny do ergosterolu pod względem właściwości strukturalnych i chemicznych, różni się tylko pojedynczym wiązaniem podwójnym i może zastąpić ergosterol w drożdżach bez żadnych zakłóceń funkcjonalnych24. Aby sprawdzić, czy Upc2 bezpośrednio wiąże się ze sterolami drożdżowymi, przeprowadziliśmy test wiązania fluorescencyjnego DHE przy użyciu oczyszczonego CTD rekombinowanego Upc2 (reszty 598-913). Reszty tryptofanowe Upc2 wzbudzano przy długości fali 285 nm i monitorowano widmo fluorescencji DHE. Analiza spektralna wykazała, że wygaszanie tryptofanu przy długości fali 340 nm było równoczesne z pojawieniem się trzech pików emisyjnych przy długości fali 354, 373 i 393 nm (Rys. 1b). Piki te są charakterystyczne dla DHE, co sugeruje transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) z Upc2 LBD do związanej DHE25,26. Upc2 LBD wiąże wolne DHE z nanomolarnym powinowactwem, jak zmierzono w eksperymentach wiązania równowagowego (Rys. 1b). Upc2 LBD również ekstrahuje i wiąże DHE osadzoną w liposomach DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholina), co było monitorowane przez wzrost emisji fluorescencji przy 375 nm, gdy Upc2 LBD została dodana do liposomów DOPC:DHE (Fig. 1c,d). Po dodaniu niefluorescencyjnego ergosterolu do mieszaniny zawierającej Upc2 związanego z DHE, emisja fluorescencji zmniejszyła się, wskazując, że ergosterol konkuruje z DHE o wiązanie z Upc2. Jednakże dodanie cholesterolu nie wpłynęło na wiązanie DHE, wskazując, że Upc2 nie wiąże cholesterolu. Inne sterole takie jak 20-hydroksycholesterol, 25-hydroksycholesterol, hydrokortyzon i β-estradiol nie konkurowały z DHE sugerując, że Upc2 LBD jest specyficznym receptorem dla steroli grzybowych takich jak ergosterol i DHE (Rys. 1e). Dodatkowo, aby zbadać właściwości ekstrakcji DHE i ergosterolu przez Upc2 z liposomów o fizjologicznym składzie lipidowym błon plazmatycznych drożdży27, monitorowaliśmy ekstrakcję DHE z liposomów z fosfatydylocholiną/fosfatydyloetanoloaminą/fosfatydyloinozytolem/fosfatydyloseryną/DHE (40:40:10:8:2, mol %) oraz kompetycyjnego wiązania ergosterolu z następowym dodaniem liposomów z fosfatydylocholiną/fosfatydyloetanoloaminą/fosfatydyloinozytolem/fosfatydyloseryną/ergosterolem (25:25:10:10:30, mol %) w stężeniach 6.5 μM i 23 nM odpowiednio liposomów i białka (Supplementary Fig. 1). Upc2 wiąże DHE i ergosterol w podobny sposób, jak liposomy DOPC/DHE. Ecm22, bliski homolog Upc2, również wiąże się z wolnym DHE w taki sam sposób jak Upc2 (ryc. 1f).

figura1 — Ryc. 1: Specyficzne wiązanie LBD Upc2 z ergosterolem i DHE.

Aby porównać ligandy sterolowe zidentyfikowane przez eksperymenty in vitro z naturalnym ligandem wychwyconym przez Upc2 z lizatu komórek drożdżowych, scharakteryzowaliśmy ligand wyekstrahowany przez Upc2 za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (HPLC) i analizy chromatografii cieczowej ze spektroskopią masową (ryc. 2). Wychwyconym ligandem był wyłącznie ergosterol, bez wykrywalnych gatunków innych lipidów. Biorąc pod uwagę podobieństwa w strukturalnych i chemicznych właściwościach pomiędzy ergosterolem i DHE oraz fakt, że ergosterol jest znacznie bardziej obfity niż DHE w komórkach drożdży, doszliśmy do wniosku, że ergosterol jest fizjologicznym ligandem dla Upc2.

Rycina 2: Analizy HPLC i chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową ligandu wychwyconego przez Upc2 z lizatu komórek drożdży.

Upc2 LBD wyświetla nowy α-helikalny fałd

Aby zbadać strukturę C-końcowego LBD Upc2, przeprowadziliśmy badania krystalograficzne na różnych konstruktach C-końcowych. Kryształy apo Upc2 LBD i Upc2 LBD związanego z ergosterolem zostały skrystalizowane, ale nie dyfrakcjonowały w promieniowaniu synchrotronowym. Aby poprawić jakość dyfrakcji kryształów Upc2 LBD, stworzyliśmy białko fuzyjne (Upc2 LBD-T4L), w którym lizozym T4 zastępuje zmienną pętlę (reszty 715-725) w Upc2 (ref. 28). Białko fuzyjne Upc2-T4L ulegało stabilnej ekspresji i wykazywało dobre wła¶ciwo¶ci wi±ż±ce DHE (ryc. 3a), co sugeruje, że fuzja z lizozymem T4 nie zaburza wi±zania ligandu i fałdowania białka. Struktura C-końcowego LBD apo Upc2 (reszty 598-878)-T4L pozbawionego C-końcowych 35 reszt została określona do rozdzielczości 2,9 Å metodą pojedynczego rozproszenia anomalnego z użyciem kryształów znakowanych selenometioniną. Ostateczna struktura zawierająca dwie cząsteczki Upc2-T4L i 29 cząsteczek wody w jednostce asymetrycznej została dopracowana do współczynnika R wynoszącego 24,9% (Tabela 1).

Tabela 1 Statystyki zbierania danych i rafinacji.

Struktura apo Upc2 LBD wykazuje globularne α-helikalne zagięcie o owalnym kształcie (Rys. 3b). LBD Upc2 składa się z 11 α-helikali i pętli łączących. W regionie pętli C-końcowej znajduje się mała przewidywana α-helisa (α12, reszty 889-896), która nie została włączona do skrystalizowanej konstrukcji. 11 α-helis jest ułożonych w zamkniętą klamrę, która tworzy głęboką kieszeń w rdzeniu białka. Pierwsze trzy α-heliksy tworzą palce N-końcowe, a heliksy α8-α9, α7 i α11 tworzą pozostałe palce klamry. Cztery heliksy α3-α6 tworzą centralną dłoń w postaci wiązki helikalnej. Pętla α7-α8 (reszty 760-799) otacza heliksy α8-α9 jako najdłuższa w strukturze przypadkowa spirala. Lizozym T4 zastępujący dziewięć reszt w pętli α5-α6 jest ściśle zlokalizowany na powierzchni Upc2 LBD (Rys. 3c).

Struktura Upc2 LBD ujawnia centralną kieszeń hydrofobową otoczoną przez heliksy α (Rys. 3d). Głęboka kieszeń hydrofobowa ma objętość 287 Å3. Helisy α5 i α6 tworzą dno kieszeni, a heliksy α1-α2, α7, α9 i α11 tworzą ścianę kieszeni hydrofobowej. Kieszeń ta jest dostępna dla rozpuszczalnika dzięki niewielkiemu porowi na powierzchni. Obecno¶ć kieszeni hydrofobowej sugeruje, że może ona służyć jako miejsce wi±zania dla małych lipofilowych cz±steczek. Strukturalne porównanie Upc2 ze znanymi strukturami w PDB przy użyciu serwera DALI nie pozwoliło na znalezienie pokrewnych struktur o punktacji Z >7 sugeruj±c, że Upc2 LBD reprezentuje now± fałdkę LBD.

Upc2 LBD tworzy konstytutywny homodimer

Analiza chromatografii wykluczania rozmiaru (SEC) wykazała, że rekombinowany Upc2 LBD lub Upc2 LBD-T4L jest homogennym dimerem bez wykrywalnego gatunku monomerycznego, co sugeruje, że dimeryczny Upc2 jest biologicznie istotną formą. Dimer Upc2 LBD zawiera dwa miejsca wiążące sterole, a wiązanie ligandu nie wpływa na stan oligomeryczny Upc2 analizowany metodą SEC (Rys. 4a). W jednostce asymetrycznej kryształów znajdowały się dwie cząsteczki Upc2 LBD-T4L powiązane ze sobą niekrystalograficzną osią dwukrotną. Upc2 LBD dimeryzuje poprzez heliksy α1 i α2 tworzące wiązkę czteroheliksową w interfejsie dimeru (Rys. 4b). Termininy N dimeru Upc2 LBD s± odsłonięte po tej samej stronie w pobliżu centrum interfejsu dimeru. Interfejs dimeru składa się głównie z hydrofobowych reszt, które zakopują 1,562 Å2 powierzchni w interfejsie (Rys. 4c). Met610 znajduje się w centrum interfejsu dimeru. Mutant M610R jest monomerem w roztworze analizowanym metodą SEC, co sugeruje, że dimer obserwowany w strukturze krystalicznej jest zgodny z dimerem obserwowanym w roztworze (Rys. 4a). LBD C. albicans Upc2 i S. cerevisiae Ecm22 również są dimerami w roztworze, a mutacja M506R w C. albicans Upc2 prowadziła do monomeryzacji LBD. Zachowanie reszt tworzących interfejs dimeru u homologów Upc2 sugeruje, że homodimeryzacja LBD jest ogólną cechą tych białek (Supplementary Fig. 2).

Pętla C-końcowa jest niezbędna do wiązania ligandu

Większość mutacji konstytutywnej aktywacji w S. cerevisiae Upc2 i C. albicans Upc2 jest skupiona w pętli C-końcowej między helisą α11 i przewidywaną helisą α1221,29. Struktura krystaliczna nie obejmuje tej C-końcowej pętli aktywacyjnej o długości 35 reszt. Aby zbadać funkcjonalne znaczenie tej C-końcowej pętli, przeprowadziliśmy testy wiązania ligandu na C-końcowych mutantach delecyjnych Upc2 LBD (Rys. 5a). Obcięcie 14 reszt C-końcowych (Δ900-913) nie miało wpływu na wiązanie ligandu. Jednakże, delecja 35 reszt C-końcowych (Δ879-913), w tym przewidywanej α12, znosiła wiązanie DHE, sugerując, że C-końcowa pętla bogata w glicynę i helisa α12 są niezbędne do wiązania ligandu (Rys. 5b). Ponadto, G888D, mutacja konstytutywnej aktywacji w pętli α11-α12 znacząco hamowała wiązanie DHE.

Rysunek 5: Kieszeń wiążąca sterol w Upc2.

Struktura krystaliczna Upc2 LBD pokazuje głęboką kieszeń hydrofobową, która może pomieścić pojedynczą cząsteczkę sterolu. Jednakże rozmiar kieszeni wiążącej w apo Upc2 LBD pozbawionej C-końcowej pętli aktywacyjnej jest nieco mniejszy niż wymiary ergosterolu, co sugeruje, że Upc2 LBD musi ulegać zmianom konformacyjnym podczas wiązania ligandu. Aby zidentyfikować strukturalne uwarunkowania wiązania steroli przez Upc2, podjęliśmy próbę współkrystalizacji Upc2 LBD z ergosterolem. Jednakże, z powodu słabej dyfrakcji kryształów Upc2 związanych ze sterolem, strukturalne określenie kompleksu z ligandem nie było możliwe. Alternatywnie, przetestowaliśmy wpływ kilku mutacji w kieszeni hydrofobowej na wiązanie sterolu. Mutacje reszt dystalnych do kieszeni, V699Y i R752A, nie miały wpływu na wiązanie ligandu. Mutacja reszt w kieszeni hydrofobowej na reszty wielkogabarytowe (L703F i L820W) znacząco zmniejszyła wiązanie DHE, potwierdzając, że kieszeń hydrofobowa mieści sterol (Rys. 5b). Ponadto, mutacja M610R całkowicie zniosła wiązanie steroli, co sugeruje, że dimeryzacja LBD Upc2 jest wymagana do wiązania steroli. LBD wszystkich homologów Upc2 u grzybów wykazuj± wysoki stopień zachowania sekwencji (Suplementarna ryc. 2). W szczególności, reszty zlokalizowane w interfejsie dimeryzacji, kieszeni wiążącej ligand i C-końcowej pętli aktywacyjnej są ściśle konserwowane.

Cytozolowa Upc2 relokalizuje się do jądra po aktywacji

Wyjątkowe cechy strukturalne i wiążące ligand Upc2 zasugerowały nam, że Upc2 może relokować się do jądra po związaniu ligandu w cytozolu. Zbadali¶my komórkow± lokalizację pełn± długo¶ci Upc2 i jej mutantów w warunkach bogatych w ergosterol i ubogich w ergosterol. Wcześniej istniało kilka sprzecznych doniesień na temat lokalizacji Upc2 w jądrze, cytoplazmie i ogniskach okołojądrowych przy użyciu C-końcowej fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP)30,31,32. Jednak kluczowe determinanty lokalizacji Upc2 nie zostały doświadczalnie zdefiniowane. W tym badaniu, w celu uniknięcia funkcjonalnej interferencji GFP z C-końcową pętlą aktywacyjną i wiązaniem ligandu, GFP zostało oznakowane do N-końca Upc2. Upc2 typu dzikiego jest obecny głównie w cytozolu z łagodną lokalizacją jądrową w 30% populacji komórek. Kiedy komórki drożdży hodowano w obecności 5 mM ergosterolu, Upc2 był zlokalizowany prawie wyłącznie w cytoplazmie. Jednak dodanie do podłoża hodowlanego 4 μg ml-1 flukonazolu, który hamuje biosyntezę ergosterolu, powodowało przesunięcie lokalizacji Upc2 do jądra w całej populacji komórek (ryc. 6). Upc2 zawiera dwudzielny sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) przed sekwencją klastra Zn2-Cys6, który nadaje mu wewnętrzną właściwość lokalizacji jądrowej. Delecja NLS (reszty 2-43) spowodowała, że Upc2 stał się całkowicie cytozolowy. Ponadto, izolowana LBD (reszty 598-913) lub konstrukt pozbawiony NLS-DBD (reszty 283-913) był całkowicie cytozolowy niezależnie od poziomu steroli. Z kolei delecja C-końcowego LBD (ΔLBD, konstrukt reszt 1-559) wykazywała silną lokalizację jądrową, niezależną od poziomu steroli. Dane te sugerują, że związana z ergosterolem C-końcowa LBD tłumi transport jądrowy Upc2 poprzez hamowanie funkcji NLS. Dysocjacja ligandu sterolowego z Upc2 może prowadzić do ekspozycji NLS lub uwolnienia Upc2 z wychwytu przez białka cytozolowe do transportu jądrowego. Delecja pętli C-końcowej (Δ879-913), która zaburza wiązanie ergosterolu, prowadziła do umiarkowanej lokalizacji jądrowej Upc2. G888D lub mutacje w kieszeni wiążącej sterol (L820W lub L703F) prowadziły do silnej konstytutywnej lokalizacji jądrowej Upc2. Mutacja M610R, która zaburza dimeryzację LBD i wiązanie ligandu, wykazuje głównie lokalizację jądrową niezależnie od poziomu steroli, co sugeruje, że dimeryzacja Upc2 jest niezbędna dla jego funkcji regulacyjnej. Podsumowuj±c, obserwacje te wraz z testami wi±zania ligandów sugeruj±, że wi±zanie steroli jest kluczowym mechanizmem reguluj±cym lokalizację TF. W warunkach bogatych w sterole Upc2 wi±że się z ergosterolem i jest obecny w cytozolu jako forma represyjna. Po wyczerpaniu ergosterolu, niezwiązany Upc2 jest aktywowany i przemieszcza się do jądra w celu transkrypcyjnej aktywacji związanych z nim genów.

Rysunek 6: Lokalizacja komórkowa konstruktów GFP-Upc2.

Upc2 reguluje poziom ergosterolu w komórkach drożdży

Upc2 i Ecm22 wiążą się do konserwowanego 7-bp sterolowego elementu regulatorowego w obrębie promotorów większości genów ERG, w tym ERG2, ERG3 i ERG11 (ref. 2, 21). Aby zbadać mechanizm regulacji transkrypcyjnej Upc2, sprawdziliśmy aktywność transkrypcyjną różnych konstruktów Upc2, używając ERG2-LacZ jako reportera (Rys. 7a). Upc2 typu dzikiego wykazywał umiarkowaną aktywność transkrypcyjną w normalnych warunkach wzrostu. Leczenie flukonazolem zwiększa aktywność transkrypcyjną ponad dwukrotnie. Jednakże pusty plazmid lub delecja C-końcowej LBD wykazywały bardzo słabą aktywność transkrypcyjną, co sugeruje, że LBD jest niezbędna dla aktywności transkrypcyjnej Upc2. Mutacja G888D, niezależnie od leczenia flukonazolem, wykazywała pełną konstytutywną aktywację Upc2, która jest 1,2 razy większa niż indukowana typu dzikiego. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszym doniesieniem, że CTD jest niezbędny do aktywacji transkrypcyjnej Upc2 (ref. 21). M610R nie wykazywał wzrostu aktywności transkrypcyjnej przy zubożeniu sterolu, co sugeruje, że dimeryzacja jest niezbędna dla funkcji regulacyjnej. Delecja C-końcowej pętli aktywacyjnej (ΔCT), która wykazuje konstytutywną lokalizację jądrową, wykazywała jednak co najmniej 30% niższą aktywność transkrypcyjną niż nieindukowany typ dziki. Ponadto, aktywność transkrypcyjna ΔCT nie wzrastała pod wpływem leczenia flukonazolem. Dane te sugeruj±, że C-końcowa pętla aktywuj±ca jest niezbędna nie tylko do regulacji lokalizacji białka, ale także do pełnej aktywno¶ci transkrypcyjnej Upc2. Zaburzenie wiązania steroli przez L703F lub L820W wykazało konstytutywną lokalizację jądrową. Aktywno¶ć transkrypcyjna tych mutantów była jednak o 40% mniejsza niż typu dzikiego i nie ulegała znacznemu zwiększeniu przy indukcji flukonazolem. Wydaje się, że wprowadzenie nieporęcznych reszt do kieszeni wi±ż±cej sterole nie tylko zaburza wi±zanie steroli, ale także zaburza wła¶ciw± konformację Upc2 dla pełnej aktywno¶ci transkrypcyjnej. Obserwacje te wraz z eksperymentami wi±zania ligandów i lokalizacji komórek sugeruj±, że wi±zanie steroli nie tylko reguluje lokalizację białka, ale również reguluje aktywno¶ć transkrypcyjn± Upc2. Aby potwierdzić, że Upc2 jest zaangażowany w regulację poziomu ergosterolu w komórkach, oznaczyliśmy ilościowo całkowitą zawartość ergosterolu w komórkach drożdży zawierających allele UPC2 typu dzikiego lub zmutowanego (Rys. 7b). Ponieważ Upc2 aktywuje ekspresję genów biosyntezy ergosterolu, można sobie wyobrazić, że poziom sterolu w komórkach drożdży pośrednio koreluje z aktywnością transkrypcyjną Upc2. Przy braku genów UPC2 i ECM22 poziom sterolu w komórkach drożdży był słabo wykrywalny, a dodatek 4 μg ml-1 flukonazolu silnie hamował wzrost komórek drożdży. Upc2 typu dzikiego wykazywał podobny poziom ergosterolu w komórce jak Upc2 L703F i L820W przy braku flukonazolu. Leczenie flukonazolem obniżyło poziom ergosterolu o około 40% w szczepach typu dzikiego, L793F i L820W. Delecja 35 reszt C-końcowych (ΔCT) powodowała nieco wyższy poziom ergosterolu niż w komórkach typu dzikiego. Jednakże, flukonazol bardziej znacząco obniżał poziom sterolu w komórkach mutantów ΔCT i M610R niż w komórkach typu dzikiego. Upc2 pozbawiony LBD wykazywał pewien podstawowy poziom syntezy steroli przy braku flukonazolu. Jednakże obecność 4 μg ml-1 flukonazolu hamowała poziom steroli i wzrost komórek w sposób znaczący. Komórki wykazujące ekspresję mutanta G888D miały trzykrotnie wyższy poziom ergosterolu w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję Upc2 typu dzikiego. Poziom ergosterolu był wyższy w komórkach mutanta G888D traktowanych flukonazolem w porównaniu z poziomem stwierdzonym w komórkach typu dzikiego hodowanych bez flukonazolu. Dane te sugeruj±, że mutacja G888D konstytutywnie aktywuje Upc2 do biosyntezy ergosterolu, co prowadzi do zwiększonej odporno¶ci na azolowe leki przeciwgrzybicze. Aby potwierdzić, że Upc2 jest zaangażowany w regulację ekspresji genów enzymów biosyntezy ergosterolu, przeprowadziliśmy ilościową analizę ekspresji genów ERG11 metodą real-time PCR, używając szczepów upc2/ecm22-knockout z allelami UPC2 typu dzikiego i zmutowanego. Zmierzyliśmy poziomy mRNA genów ERG11, które zostały znormalizowane przez gen TAF10 jako kontrolę wewnętrzną33. Dane wskazują, że poziomy ekspresji mRNA ERG11 korelują z aktywnością promotora ERG2 i poziomami ergosterolu zgodnie z oczekiwaniami (Supplementary Fig. 3).

Rysunek 7: Poziom ergosterolu i oporność na antybiotyki.

Aktywacja Upc2 nadaje oporność na środek przeciwgrzybiczy

Aby zbadać związek między aktywacją Upc2 a opornością na środki przeciwgrzybicze, sprawdziliśmy wrażliwość na flukonazol szczepów upc2Δ ecm22Δ lub ecm22Δ wyrażających allele UPC2 typu dzikiego lub zmutowane (Fig. 7c). Ponieważ flukonazol zaburza wzrost komórek drożdży poprzez hamowanie biosyntezy ergosterolu, ogólne wzorce wzrostu komórek wykazywały korelację z poziomem steroli w komórkach poddanych działaniu flukonazolu. Podwójnie znokautowane komórki upc2Δ ecm22Δ nie rosły w obecności flukonazolu. Wprowadzenie UPC2 typu dzikiego umożliwiało słaby wzrost komórek przy 8 μg ml-1 flukonazolu. Komórki drożdży wyrażające mutanta G888D wykazywały znaczny wzrost oporności na flukonazol w stężeniu 8 μg ml-1. Jednakże, mutant G888D rósł słabiej niż typ dziki przy braku flukonazolu, co sugeruje, że pełna konstytutywna aktywacja Upc2 jest niekorzystna w warunkach nieselektywnych poprzez obciążenie metaboliczne34. Mutanty L820W, L703F, M610R i ΔCT, które zaburzają wiązanie steroli, były bardziej wrażliwe na flukonazol niż typ dziki. Pojedynczy szczep upc2Δ-knockout posiadający allel ECM22 umożliwiał słaby wzrost w niskim stężeniu flukonazolu, co sugeruje, że ECM22 pełni częściowo pokrywającą się rolę w aktywacji genów zaangażowanych w oporność na azole. Jednakże, w stężeniach flukonazolu wyższych niż 6 μg ml-1, szczepy upc2Δ i upc2Δ ecm22Δ nie wykazywały istotnych różnic we wrażliwości na wszystkie konstrukty Upc2, co sugeruje, że Upc2 odgrywa dominującą rolę w regulacji steroli. Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że delecja UPC2 skutkuje wrażliwością na ketokonazol, podczas gdy nie zaobserwowano żadnego efektu przy delecji ECM22, co sugeruje, że Ecm22 i Upc2 mają specyficzne cele z pewnymi istotnymi nakładającymi się funkcjami35,36.

Upc2 jest nową klasą cynkowych palców TF

Poprzednie badania zaproponowały, że kilku członków rodziny grzybowych cynkowych klastrów regulatorów transkrypcji może reprezentować funkcjonalne analogi metazoanowych NRs13,18,19,20.

Pomimo, że grzybowe TF nie wykazują widocznego sekwencyjnego lub strukturalnego podobieństwa do metazoanowych NR, Upc2 wykazuje koncepcyjne podobieństwa do steroidowych NR w ogólnej architekturze domen, wiązaniu ligandów sterolowych, homodimeryzacji, zależnej od ligandów regulacji transkrypcji i translokacji jądrowej.

Upc2 i metazoanowe NR zawierają w swoich N-końcowych regionach domeny wiążące DNA z palcami cynkowymi. Palce cynkowe koordynujące dwa jony cynku składają się z sześciu cystein w przypadku Upc2 i czterech cystein w każdym z dwóch palców w przypadku NRs37. Domeny wiążące DNA NRs i TFs z klastrami cynkowymi są strukturalnie podobne i wiążą się z DNA jako homo- lub heterodimery13. TF z palcami cynkowymi posiadają C-końcową negatywną domenę regulacyjną, która w przypadku wielu członków rodziny pośredniczy w wiązaniu ligandów lub odpowiedzi na małe cząsteczki, takie jak metabolity komórkowe i lipofilowe ligandy13. Aktywność transkrypcyjna Upc2 jest regulowana przez ergosterol, który jest funkcjonalnie podobny do steroidowych NR typu I pod względem specyficzności ligandów. Zarówno Upc2, jak i receptory steroidowe tworzą homodimery. Upc2 tworzy konstytutywne homodimery niezależnie od wi±zania ligandu. Receptor estrogenowy α istnieje jako dimer nawet w stanie apo, a wiązanie ligandu dodatkowo stabilizuje homodimer38.

Porównanie strukturalne Upc2 z NR steroidowymi ssaków ujawnia, że Upc2 ma charakterystyczne α-helikalne zagięcie LBD od NR ssaków (Supplementary Fig. 4). Oba regulatory genowe składają się głównie z około 12 struktur α-helikalnych o podobnych wymiarach LBD. LBD receptorów Upc2, estrogenu i progesteronu tworz± dimery poprzez oddziaływania w pęczkach helis. Jednakże, poza ogóln± konfiguracj± dimerów z miejscami wi±zania ligandów blisko interfejsu dimeru, nie ma wyraźnej homologii strukturalnej pomiędzy Upc2 a NR. Po związaniu ligandu receptory steroidowe dysocjują od białka szoku cieplnego Hsp90 w cytozolu i przenoszą się do jądra, wiążąc się z promotorami genów docelowych jako homodimery17. Konsekwentnie, translokacja Upc2 z cytozolu do jądra jest regulowana w sposób zależny od ligandu.

Jednakże LBD Upc2 wykazuje zupełnie inną fałdę strukturalną w porównaniu z LBD metazoanowych NR. Brak podobieństw sekwencyjnych i strukturalnych grzybowych TF i metazoanowych NR sugeruje, że podobieństwa architektoniczne i funkcjonalne są produktem ewolucji konwergentnej o wspólnej strategii mechanistycznej. Analiza filogenetyczna wykazała, że ortologi Upc2 są identyfikowalne jedynie w obrębie Saccharomycotina, a białka Upc2/Ecm22 tworzą monofiletyczny klad, który nie jest blisko spokrewniony z żadnymi innymi białkami Zn2-Cys6 z Saccharomycotina5. Drożdże pączkujące, S. cerevisiae, zawierają około 50 Zn2-Cys6 TF39. Mimo że homologia sekwencji Upc2 z innymi typami TF-ów palców cynkowych jest niska, posiadają one konserwowaną, specyficzną dla grzybów sekwencję w obrębie C-końcowych LBD, która była wcześniej znana jako MHR (middle homology region)40. Region C-końcowy, w tym MHR, w cynkowych TF powszechnie zawiera 13-15 α-heliksów elementów struktury drugorzędowej, co sugeruje, że obecność LBD jest ogólną cechą tej rodziny białek. Podsumowując, Upc2 reprezentują nową klasę cynkowych TF wykazujących funkcjonalną analogię do metazoanowych receptorów steroidowych.

Universe