Mecanismo estrutural de regulação do ergosterol pelo fator de transcrição do esterol fúngico Upc2
Upc2 é um receptor específico para o ergosterol
Upc2 e Ecm22 compartilham um alto nível de similaridade de seqüência nos domínios N-terminais de ligação de DNA caracterizados por um motivo de dedo de zinco Zn(II)2-Cys6 conservado21. A região conservada C-terminal de cerca de 300 resíduos amino-ácidos contém um domínio de ativação de transcrição (Fig. 1a). Como a atividade transcripcional do Upc2 é dependente dos níveis de ergosterol na célula, colocamos a hipótese de que o CTD possa servir como um LBD para o ergosterol e regular a atividade transcripcional do Upc2. O dehidroergosterol (DHE) é um esterol natural com propriedades intrínsecas de fluorescência, que é encontrado em baixas quantidades em S. cerevisiae22,23. O DHE é muito semelhante ao ergosterol em propriedades estruturais e químicas com apenas uma diferença de ligação dupla e pode substituir o ergosterol em leveduras sem qualquer interferência funcional24. Para testar se o Upc2 se liga directamente aos esteróis de levedura, realizámos o ensaio de ligação fluorescente do DHE utilizando CTDs purificados de Upc2 recombinante (resíduos 598-913). Os resíduos de triptofano Upc2 foram excitados a 285 nm e o espectro de fluorescência do DHE foi monitorizado. A análise espectral revelou que o têmpera do triptofano a 340 nm foi concomitante com o aparecimento de três picos de emissão a 354, 373 e 393 nm (Fig. 1b). Estes picos são característicos do DHE, o que sugere transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) de Upc2 LBD para DHE25,26 ligados. Upc2 LBD liga DHE livre com afinidade nanomolar como medida por experimentos de ligação de equilíbrio (Fig. 1b). Upc2 LBD também extrai e liga DHE embutido nos lipossomas DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholina) como monitorado pelo aumento da emissão de fluorescência a 375 nm quando Upc2 LBD foi adicionado aos lipossomas DOPC:DHE (Fig. 1c,d). Quando o ergosterol não fluorescente foi adicionado à mistura contendo Upc2 ligado ao DHE, a emissão de fluorescência foi diminuída indicando que o ergosterol compete com o DHE para a ligação ao Upc2. No entanto, a adição de colesterol não afectou a ligação ao DHE indicando que o Upc2 não liga o colesterol. Outros esteróis como 20-hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, hidrocortisona e β-estradiol não competir com o DHE sugerindo que o Upc2 LBD é um receptor específico para esteróis fúngicos como o ergosterol e o DHE (Fig. 1e). Além disso, para examinar as propriedades de extração do DHE e ergosterol Upc2 dos lipossomos com uma composição lipídica fisiológica das membranas plasmáticas de levedura27 , monitoramos a extração do DHE dos lipossomos com fosfatidilcolina/fosfatidilanolamina/fosfatidilinositol/fosfatidilserina/DHE (40:40:10:8:2, mol %) e a ligação competitiva do ergosterol com adição subsequente dos lipossomas com fosfatidilcolina/fosfatidilanolamina/fosfatidilinositol/fosfatidilserina/ergosterol (25:25:10:10:30, mol %) a 6.5 μM e 23 nM de lipossomas e proteínas, respectivamente (Suplemento Fig. 1). Upc2 liga DHE e ergosterol de forma similar ao dos lipossomas DOPC/DHE. Ecm22, o homólogo próximo de Upc2, também se liga ao DHE livre da mesma forma que o Upc2 (Fig. 1f).
(a) Apresentação esquemática das estruturas de domínio de Upc2 e Ecm22 em S. cerevisia (S.c.) e C. albicans (C.a.). (b) Curvas de ligação de DHE para Upc2 LBD do tipo selvagem e o mutante de truncagem terminal C de Upc2 LBD (Δ878-913). As intensidades de emissão de fluorescência nos 375 nm das amostras (λex=285 nm) foram plotadas com quantidades crescentes de concentrações de DHE. Cada ponto de dados mostrado é a média de três medições com barras de erro representando a s.d. As curvas de ajuste aos pontos de dados foram calculadas com base no modelo de ligação a um local. Um conjunto de espectros de emissão de fluorescência para Upc2 LBD do tipo selvagem foi mostrado no painel direito. Cinco resíduos triptofanos que estão localizados a 15 Å da bolsa de encadernação foram indicados por esferas vermelhas no painel direito. (c) Medição em tempo real da extração de DHE por Upc2 LBD a partir de grandes lipossomas DOPC. Os lipossomas continham um total de 124 μM de fosfatidilcolina e DHE numa razão molar de 98:2. Upc2 LBD foi adicionado aos lipossomas com a concentração final de 0,73 μM no início da medição cinética. O ergosterol ou colesterol não fluorescente foi adicionado à concentração final de 2,5 μM a 40 min para ligação competitiva ao DHE. (d) Os espectros de emissão de fluorescência (λex=285 nm) das amostras durante e no final da cinética são mostrados para c. (e) Os espectros de emissão de fluorescência (λex=285 nm) de vários esteróis para ligação competitiva ao DHE. O 0,6 μM de Upc2 LBD foi carregado com 2,5 μM de DHE livre. Três linhas diferentes em cada experiência representam diferentes concentrações de ligandos concorrentes (25-hidroxicolesterol, 20-hidroxicolesterol, hidrocortisona e β-estradiol) com 2,5, 4 e 10 μM respectivamente. O β-estradiol é um composto naturalmente fluorescente. O asterisco indica a emissão de fluorescência intrínseca do β-estradiol a 310 nm (λex=285 nm). (f) Espectros de emissão de fluorescência de Ecm22 LBD em ligação DHE.
Para comparar os ligandos de esterol identificados por experimentos in vitro com o ligante natural capturado pelo Upc2 a partir do lisado de células de levedura, caracterizamos o ligante extraído pelo Upc2 utilizando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) de fase reversa e análises por espectroscopia de massa líquida (Fig. 2). O ligante capturado foi exclusivamente ergosterol, sem espécies detectáveis de outros lipídios. Dadas as semelhanças nas propriedades estruturais e químicas entre o ergosterol e o DHE, e que o ergosterol é muito mais abundante do que o DHE em células de levedura, concluímos que o ergosterol é um ligante fisiológico para o Upc2.
(a) Perfil de eluição HPLC de fase reversa do padrão de ergosterol puro (Sigma 45480) e do ligante extraído do Upc2 LBD. (b) Análise por espectroscopia de massa do ergosterol padrão e do ligante extraído do Upc2 LBD. A identificação do ligante capturado pela Upc2 foi obtida por comparação das propriedades cromatográficas e espectroscopia de massa com o padrão de referência e os dados da literatura56. AMU, unidade de massa atômica; UV, ultravioleta.
Upc2 LBD exibe uma nova dobra helicoidal α-helical fold
Para examinar a estrutura do LBD terminal C da Upc2, realizamos os estudos cristalográficos em várias construções terminais C. Os cristais de apo Upc2 LBD e ergosterol-bound Upc2 LBD foram cristalizados mas não se difundiram na radiação sincrotrônica. Para melhorar a qualidade de difração dos cristais Upc2 LBD, projetamos uma proteína de fusão (Upc2 LBD-T4L) na qual a lisozima T4 substitui a laço variável (resíduos 715-725) em Upc2 (ref. 28). A proteína de fusão Upc2-T4L foi expressa de forma estável e apresentou boas propriedades de ligação ao DHE (Fig. 3a), o que sugere que a fusão da lisozima T4 não interfere com a ligação dos ligandos e a dobra da proteína. A estrutura do LBD terminal C do apo Upc2 (resíduos 598-878)-T4L sem os resíduos do C-terminal 35 foi determinada com resolução de 2,9 Å pelo método de dispersão anômala única usando cristais marcados com selenometionina. A estrutura final contendo duas moléculas de Upc2-T4L e 29 moléculas de água na unidade assimétrica foi refinada para um fator R de 24,9% (Tabela 1).
(a) Espectros de emissão de fluorescência da construção de fusão Upc2 LBD-T4L (resíduos 598-913) em ligação DHE. (b) Estrutura geral da Upc2 LBD. A estrutura foi colorida de vermelho a azul com base na sucessão da estrutura secundária. A lisozima T4 fundida no laço α5-α6 não foi mostrada para maior clareza. (c) Estrutura geral do dímero Upc2 LBD-T4L com representação cilíndrica. A localização da bolsa hidrofóbica profunda em um dos protomers Upc2 é indicada por um círculo preto. (d) Representação da superfície do monômero Upc2 LBD. Os resíduos que compõem a parede da bolsa hidrofóbica são mostrados em bastões. A bolsa hidrofóbica é mostrada em representação de superfície cinza. Conc., concentração; C-term, C-terminal; N-terminal, N-terminal.
A estrutura do apo Upc2 LBD exibe uma dobra globular α-helical com uma forma oval (Fig. 3b). A Upc2 LBD é composta por 11 α-helices e laços de ligação. Há uma pequena hélice prevista α (α12, resíduos 889-896) na região da malha terminal C que não foi incluída na construção cristalizada. Os 11 hélices do α estão dispostos de forma a formar uma pinça fechada que cria uma bolsa profunda no núcleo da proteína. Os três primeiros α-helices compõem os dedos N-terminais e os helices α8-α9, α7 e α11 compõem os outros dedos da pinça. Os quatro hélices α3-α6 compõem a palma central como um feixe helicoidal. O laço α7-_α8 (resíduos 760-799) envolve os hélices α8-α9 como uma bobina aleatória mais longa na estrutura. A lisozima T4 que substitui nove resíduos no laço α5-α6 está localizada na superfície da Upc2 LBD (Fig. 3c).
A estrutura da Upc2 LBD revela uma bolsa hidrofóbica central rodeada por hélices α (Fig. 3d). A bolsa hidrofóbica profunda tem um volume de 287 Å3. Os hélices α5 e α6 compõem o fundo da bolsa e os hélices α1-α2, α7, α9 e α11 compõem a parede da bolsa de ligação hidrofóbica. A bolsa é acessível a um solvente com um pequeno poro na superfície. A presença de uma bolsa hidrofóbica sugeriu-nos que ela pode servir como um local de ligação para pequenas moléculas lipofílicas. A comparação estrutural do Upc2 com estruturas conhecidas no PDB usando o servidor DALI não encontrou estruturas relacionadas com escores Z >7 sugerindo que o Upc2 LBD representa uma nova dobra de um LBD.
Upc2 LBD forma um homodímero constitutivo
Análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) demonstrou que a Upc2 LBD ou Upc2 LBD-T4L recombinante é um dimer homogêneo sem uma espécie monomérica detectável, sugerindo que a Upc2 dimérica é uma forma biologicamente relevante. O dímero de Upc2 LBD contém dois sítios de ligação de esteróis e a ligação de ligantes não afectou o estado oligomérico de Upc2 conforme analisado pela SEC (Fig. 4a). Havia duas moléculas de Upc2 LBD-T4L relacionadas por um eixo duplo não cristalográfico na unidade assimétrica dos cristais. O Upc2 LBD dimeriza por hélices α1 e α2 formando um feixe de quatro hélices na interface do dimer (Fig. 4b). Os terminais N do dímero Upc2 LBD são expostos ao mesmo lado perto do centro da interface do dímero. A interface do dímero é composta principalmente de resíduos hidrofóbicos enterrando 1.562 Å2 de área de superfície na interface (Fig. 4c). O Met610 está localizado no centro da interface do dímero. O M610R mutante é um monômero em solução analisado pelo SEC sugerindo que o dímero observado na estrutura cristalina é consistente com o observado em solução (Fig. 4a). Os LBDs de C. albicans Upc2 e S. cerevisiae Ecm22 também são dímeros em solução e a mutação M506R de C. albicans Upc2 levou à monomerização do LBD. A conservação dos resíduos que compõem a interface dimer em homólogos Upc2 sugere que a homodimerização das LBDs é uma característica geral dessas proteínas (Suplemento Fig. 2).
(a) Perfis de SEC para LBDs de S. cerevisiae (S.c.) Upc2, C. albicans (C.a.) Upc2 e S. cerevisiae Ecm22. Os perfis do tipo selvagem e os mutantes da interface dimer (M610R em S. cerevisiae Upc2 e L506R em C. albicans Upc2) são mostrados em azul e verde, respectivamente. Os perfis de Upc2 e Ecm22 LBDs ligados ao ergosterol são mostrados em linhas vermelhas. As LBDs ligadas ao ergosterol foram preparadas misturando LBDs purificados e ergosterol numa proporção 1:5 molar e a mistura foi incubada durante a noite antes da análise SEC. (b) Vista lateral do dímero Upc2 LBD. (c) Vista detalhada da interface do dímero Upc2. Um protomer é mostrado em cor arco-íris e o outro em branco.
A alça terminal C é essencial para a ligação ligando
A maioria das mutações de ativação constitutivas em S. cerevisiae Upc2 e C. albicans Upc2 estão agrupadas na alça terminal C entre a hélice α11 e a hélice prevista α12 helix21,29. A estrutura cristalina não inclui esta alça de ativação terminal em C de 35 resíduos. Para examinar a importância funcional desta alça terminal em C, realizamos os ensaios de ligadura de ligação dos mutantes de deleção terminal em C da Upc2 LBD (Fig. 5a). A truncagem dos resíduos do C-terminal 14 (Δ900-913) não afetou a ligadura ligandar. Entretanto, a deleção dos resíduos C-terminal 35 (Δ879-913), incluindo o previsto α12, aboliu a ligação DHE, sugerindo que o laço e a hélice rica em glicina C-terminal α12 são essenciais para a ligação ligandar (Fig. 5b). Além disso, G888D, uma mutação de ativação constitutiva no laço α11-α12 inibiu significativamente a ligação do DHE.
(a) Espectros de emissão de fluorescência de vários mutantes na ligação do DHE. Os espectros de emissão em vários pontos de tempo foram mostrados em cores diferentes. (b) Representação da fita da bolsa hidrofóbica. A bolsa hidrofóbica é mostrada em representação da superfície cinza. O traço especulativo do laço de ativação terminal C que não foi incluído na construção cristalizada é mostrado em pontos vermelhos.
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A estrutura cristalina do Upc2 LBD mostra uma bolsa hidrofóbica profunda que pode acomodar uma única molécula de esterol. No entanto, o tamanho da bolsa de ligação no apo Upc2 LBD sem o laço de ativação terminal C é ligeiramente menor do que as dimensões do ergosterol, o que implica que o Upc2 LBD deve sofrer uma mudança conformacional na ligação ligand. Para identificar os determinantes estruturais da ligação do Upc2 ao esterol, tentamos co-cristalizar o Upc2 LBD com o ergosterol. Entretanto, devido à fraca difração dos cristais Upc2 ligados ao esterol, a determinação estrutural do complexo ligante não foi possível. Alternativamente, testamos o efeito de várias mutações na bolsa hidrofóbica sobre a ligação do esterol. A mutação dos resíduos distais à bolsa, V699Y e R752A, não afetou a ligação ligante. A mutação de resíduos na bolsa de ligação hidrofóbica em resíduos volumosos (L703F e L820W) reduziu significativamente a ligação DHE confirmando que a bolsa hidrofóbica acomoda o esterol (Fig. 5b). Além disso, a mutação M610R aboliu completamente a ligação do esterol, implicando que a dimerização do Upc2 LBD é necessária para a ligação do esterol. As LBDs de todos os homólogos Upc2 em espécies fúngicas apresentam um alto grau de conservação da sequência (Suplemento Fig. 2). Especificamente, os resíduos localizados na interface de dimerização, na bolsa ligante e na alça de ativação terminal C são estritamente conservados.
Cytosolic Upc2 relocaliza-se para o núcleo na ativação
As características únicas estruturais e ligantes da Upc2 nos sugeriram que a Upc2 pode se relocalizar para o núcleo na ligação ligante no citosol. Nós examinamos a localização celular do Upc2 de comprimento total e seus mutantes sob condições ricas em ergosterol ou deficientes em ergosterol. Anteriormente, havia vários relatos conflitantes sobre a localização da Upc2 no núcleo, citoplasma e focos perinucleares utilizando a fusão da proteína verde fluorescente terminal C (GFP)30,31,32. Entretanto, os principais determinantes da localização da Upc2 não foram definidos experimentalmente. Neste estudo, para evitar a interferência funcional da GFP com o laço de ativação C-terminal e a ligação dos ligandos, a GFP foi etiquetada para o terminal N da Upc2. A Upc2 do tipo selvagem está presente principalmente no citosol com localização nuclear leve em 30% da população celular. Quando as células de levedura foram cultivadas na presença de 5 mM de ergosterol, o Upc2 foi localizado quase que exclusivamente no citoplasma. Entretanto, a adição de 4 μg ml-1 de fluconazol aos meios de cultura, que inibe a biossíntese do ergosterol, deslocou a localização do Upc2 para o núcleo em toda uma população celular (Fig. 6). O Upc2 contém um sinal de localização nuclear bipartido (NLS) a montante de sua seqüência de agregados Zn2-Cys6 que confere uma propriedade intrínseca de localização nuclear. A eliminação do NLS (resíduos 2-43) tornou o Upc2 completamente citosólico. Além disso, o LBD isolado (resíduos 598-913) ou a construção sem NLS-DBD (resíduos de construção 283-913) era completamente citosólico, independentemente dos níveis de esterol. Em contraste, a eliminação do LBD terminal C (ΔLBD, resíduos de construção 1-559) mostrou uma forte localização nuclear independente dos níveis de esterol. Esses dados sugerem que o LBD terminal C encadernado com ergosterol suprime o transporte nuclear de Upc2, inibindo a função NLS. A dissociação do ligante de esterol do Upc2 pode levar à exposição do NLS ou liberar o Upc2 da captura por proteínas citosólicas para o transporte nuclear. A eliminação do laço terminal C (Δ879-913) que perturba a ligação do ergosterol levou a uma modesta localização nuclear do Upc2. G888D ou mutações na bolsa de ligação do esterol (L820W ou L703F) levaram a uma forte localização nuclear constitutiva do Upc2. A mutação M610R que perturba a dimerização do LBD e ligante mostra principalmente a localização nuclear independentemente do nível de esterol, sugerindo que a dimerização do Upc2 é essencial para a sua função reguladora. Em conclusão, estas observações juntamente com os ensaios de ligadura por ligante sugerem que a ligação do esterol é o mecanismo chave na regulação da localização da TF. Em uma condição rica em esterol, o Upc2 é ligado ao ergosterol e está presente no citosol como uma forma reprimida. No esgotamento do ergosterol, o Upc2 não ligado é ativado e se move para o núcleo para ativação transcripcional dos genes relacionados.
Células foram cultivadas em 4 μg ml-1 de fluconazol ou 5 mM de ergosterol durante 12 h antes da visualização por microscopia de fluorescência. Os painéis superiores mostram a localização da GFP-Upc2. O DAPI mancha tanto o DNA nuclear como esferas e o DNA mitocondrial como manchas brilhantes que obscurecem as características da segregação do DNA nuclear. O DNA nuclear pode ser distinguido do DNA mitocondrial pelo seu tamanho e forma. A localização nuclear do Upc2 aparece como esferas verdes brilhantes dentro das células. Barra de escala, 3 μm.
Upc2 regula o nível de ergosterol nas células de levedura
Upc2 e Ecm22 ligam-se a um elemento regulador de esterol 7-bp conservado dentro dos promotores da maioria dos genes ERG incluindo ERG2, ERG3 e ERG11 (refs 2, 21). Para investigar o mecanismo de regulação transcripcional do Upc2, verificamos a atividade transcripcional de várias construções Upc2 usando o ERG2-LacZ como repórter (Fig. 7a). O tipo selvagem Upc2 mostrou uma atividade transcritiva moderada em uma condição de crescimento normal. O tratamento com fluconazol aumenta a atividade de transcrição mais de duas vezes. Entretanto, o plasmídeo vazio ou deleção da LBD terminal C mostrou atividade de transcrição muito fraca, sugerindo que a LBD é essencial para a atividade transcritiva da Upc2. A mutação G888D, independentemente do tratamento com fluconazol, mostrou uma ativação constitutiva completa da Upc2, que é 1,2 vezes maior do que o tipo selvagem induzido. Esta observação é consistente com o relatório anterior de que o DTC é essencial para a ativação da transcrição do Upc2 (ref. 21). O M610R não mostrou aumento da atividade transcritiva no esgotamento do esterol, sugerindo que a dimerização é essencial para a função reguladora. A deleção da malha de ativação terminal C (ΔCT) que mostra a localização nuclear constitutiva, no entanto, apresentou atividade transcripcional pelo menos 30% menor do que a do tipo selvagem não induzido. Além disso, a atividade de transcrição do ΔCT não aumentou no tratamento com fluconazol. Estes dados sugerem que a malha de ativação terminal C é essencial não apenas para a regulação da localização de proteínas, mas para a atividade de transcrição completa da Upc2. A interrupção da ligação do esterol por L703F ou L820W mostrou uma localização nuclear constitutiva. Entretanto, as atividades de transcrição desses mutantes foram 40% menores do que as do tipo selvagem e não foram significativamente melhoradas na indução de fluconazol. Parece que a introdução de resíduos volumosos na bolsa de ligação do esterol não só perturba a ligação do esterol, mas também perturba a conformação adequada do Upc2 para a atividade transcripcional completa. Estas observações em conjunto com experimentos de ligand binding e localização celular sugerem que a ligação de esterol não apenas regula a localização da proteína, mas também regula a atividade transcripcional do Upc2. Para confirmar que o Upc2 está envolvido na regulação do nível de ergosterol nas células, quantificamos o conteúdo total de ergosterol das células de levedura contendo alelos UPC2 do tipo selvagem ou mutante (Fig. 7b). Como o Upc2 ativa a expressão dos genes biossintéticos do ergosterol, é concebível que o nível de esterol das células de levedura se correlacione indiretamente com a atividade transcripcional do Upc2. Na ausência dos genes UPC2 e ECM22, os níveis de esterol das células de levedura foram pouco detectáveis, e a adição de 4 μg ml-1 fluconazol inibiu severamente o crescimento das células de levedura. O tipo selvagem Upc2 mostrou um nível semelhante de ergosterol na célula com os de L703F e L820W, na ausência de fluconazol. O tratamento com fluconazol suprimiu o nível de ergosterol em cerca de 40% nas cepas tipo selvagem, L793F e L820W. A eliminação dos resíduos C-terminal 35 (ΔCT) resultou num nível ligeiramente mais elevado de ergosterol do que o das células do tipo selvagem. Entretanto, o fluconazol suprimiu o nível de esterol das células mutantes ΔCT e M610R em relação às células do tipo selvagem de forma mais significativa. A Upc2 sem LBD mostrou algum nível basal de síntese de esterol na ausência de fluconazol. Entretanto, a presença de 4 μg ml-1 de fluconazol inibiu significativamente o nível de esterol e o crescimento celular. As células que expressam G888D mutante têm níveis três vezes maiores de ergosterol em comparação com as células que expressam Upc2 do tipo selvagem. Os níveis de ergosterol foram maiores nas células mutantes G888D tratadas com fluconazol em comparação com aquelas encontradas em células do tipo selvagem cultivadas sem fluconazol. Esses dados sugerem que a mutação de G888D ativa constitutivamente o Upc2 para a biossíntese do ergosterol, o que leva a um aumento da resistência aos antifúngicos azóicos. Para confirmar que o Upc2 está envolvido na regulação da expressão gênica das enzimas biossintéticas do ergosterol, realizamos a análise quantitativa da expressão gênica do ERG11 por PCR em tempo real usando as cepas upc2/ecm22-knockout com alelos tipo selvagem e mutantes UPC2. Medimos os níveis de mRNA dos genes ERG11 que foram normalizados pelo gene TAF10 como um controle interno33. Os dados indicam que os níveis de expressão do mRNA do ERG11 correlacionam-se com as atividades promotoras do ERG2 e níveis de ergosterol como esperado (Suplemento 3).
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(a) Atividade transcrítica da Upc2. Os repórteres ERG2-lacZ foram utilizados para determinar a contribuição de cada construção Upc2 para a regulação do promotor ERG2. β Foram realizados ensaios de valactosidase em cada transformador após culturas de 5 ml de cultura durante 16 h, seja em meio mínimo (não induzido) ou no meio mínimo contendo 4 μg ml-1 de fluconazol (induzido). Os valores do ensaio representam a média de três experimentos independentes. Todas as barras de erro indicam os valores de s.d. P foram avaliados pelo teste t de Student de duas caudas. *P<0,05 versus tipo selvagem, #P<0,05 versus cada mutante sem fluconazol. (b) Quantificação do ergosterol total em células de levedura. Levedura upc2Δ ecm22Δ Cepas contendo vários alelos UPC2 foram analisadas quanto ao seu conteúdo em ergosterol. Cada ponto de dados é a média de três medições. Todas as barras de erro indicam valores s.d. P foram avaliadas pelo teste t de Student de duas caudas. *P<0,05 versus tipo selvagem, #P<0,05 versus tipo selvagem tratado com fluconazol. (c) Susceptibilidades ao fluconazol de cepas de leveduras expressando alelo UPC2 do tipo selvagem ou mutante. As cepas foram inicialmente cultivadas sem fluconazol e as séries de diluição foram manchadas nas placas de ágar contendo fluconazol e incubadas durante 36 h.
Ativação do Upc2 confere resistência ao agente antifúngico
Para investigar a relação entre a ativação do Upc2 e a resistência aos agentes antifúngicos, verificamos as suscetibilidades do fluconazol de upc2Δ ecm22Δ ou ecm22Δ cepas expressando alelos UPC2 do tipo selvagem ou mutante (Fig. 7c). Como o fluconazol interfere no crescimento das células de levedura ao inibir a biossíntese do ergosterol, os padrões gerais de crescimento celular mostraram uma correlação com os níveis de esterol das células tratadas com fluconazol. Células eliminatórias duplas de upc2Δ ecm22Δ não cresceram na presença de fluconazol. A introdução do tipo selvagem UPC2 permitiu um fraco crescimento celular a 8 μg ml-1 de fluconazol. As células de levedura que expressam um mutante G888D mostraram um aumento significativo de resistência ao fluconazol em 8 μg ml-1. Entretanto, o mutante G888D cresceu mais fraco que o tipo selvagem na ausência de fluconazol, sugerindo que a ativação constitutiva total de Upc2 é desvantajosa sob condição não seletiva, impondo uma carga metabólica34. ΔLBD mutante sem atividade de transcrição não cresceu com a menor concentração de fluconazol. L820W, L703F, M610R e ΔCT mutantes que interferem na ligação do esterol eram mais suscetíveis ao fluconazol do que o tipo selvagem. A cepa única upc2Δ-knockout que abriga o alelo ECM22 permitiu um crescimento fraco em uma baixa concentração de fluconazol, sugerindo que o ECM22 tem um papel parcialmente sobreposto na ativação dos genes envolvidos na resistência ao azole. Entretanto, nas concentrações de fluconazol superiores a 6 μg ml-1, upc2Δ e upc2Δ ecm22Δ cepas não mostraram diferenças significativas nas susceptibilidades de todas as construções Upc2, sugerindo que o Upc2 tem um papel dominante na regulação do esterol. Isto é consistente com as observações anteriores de que a deleção do UPC2 resulta em sensibilidade ao cetoconazol, enquanto que nenhum efeito foi observado com a deleção ECM22 sugerindo que Ecm22 e Upc2 têm alvos específicos com algumas funções essenciais sobrepostas35,36,
Upc2 é uma nova classe de TFs de dedos de zinco
Estudos recentes propuseram que vários membros da família de reguladores de transcrição de cluster de zinco fúngico podem representar análogos funcionais de NRs de metazoários13,18,19,20.
Embora as TFs de cluster de zinco fúngico não tenham seqüência aparente ou similaridade estrutural com NRs de metazoários, a Upc2 exibe similaridades conceituais com NRs de esteróides em arquiteturas de domínio geral, ligação de ligante de esterol, homodimerização, regulação transcripcional dependente de ligante e translocação nuclear.
NRs de Upc2 e de metazoários ambos contêm domínios de ligação de DNA de dedo de zinco em suas regiões N-terminais. Os dedos de zinco coordenando dois íons de zinco são compostos de seis cisteinas para Upc2 e quatro cisteinas em cada um dos dois dedos para NRs37. Os domínios que ligam o ADN das NRs e dos aglomerados de zinco TFs são estruturalmente semelhantes e ligam-se ao ADN como homo- ou heterodímeros13. As TFs de zinco têm um domínio regulador negativo terminal C, que para vários membros da família medeia a ligação ligante ou resposta a pequenas moléculas como metabólitos celulares e ligandos lipofílicos13. A atividade transcricional da Upc2 é regulada pelo ergosterol, que é funcionalmente semelhante aos esteróides NRs tipo I em termos de especificidades dos ligantes. Os receptores Upc2 e esteróides formam ambos homodímeros. O Upc2 forma homodímeros constitutivos independentemente da ligação dos ligantes. O receptor de estrogênio α tem sido relatado como um dímero mesmo no estado apo e a ligação dos ligantes estabiliza ainda mais o homodímero38,
Comparação estrutural do Upc2 com NRs de esteróides de mamíferos revela que o Upc2 tem uma dobra diferencial α-helical do LBD de NRs de mamíferos (Fig. 4 Suplementar). Ambos os reguladores gênicos são compostos principalmente de cerca de 12 α- estruturas helicoidais com dimensões semelhantes de LBDs. As LBDs de Upc2, estrogênio e receptores de progesterona formam dímeros por interações de feixes de hélice. No entanto, exceto pela configuração geral dos dímeros com sítios de ligação de ligantes próximos à interface do dímero, não há uma homologia estrutural clara entre a Upc2 e as NRs. Na ligação ligante, os receptores esteróides se dissociam da proteína de choque térmico Hsp90 no citosol e translocam-se para o núcleo, ligando-se aos seus promotores genéticos alvo como homodímeros17. Consistentemente, a translocação da Upc2 do citosol para o núcleo é regulada de forma ligante e dependente.
No entanto, a Upc2 LBD exibe uma dobra estrutural completamente diferente em comparação com as LBDs de NRs metazoárias. A falta de sequência e semelhanças estruturais do aglomerado de zinco fúngico TFs e NRs de metazoários sugere que as semelhanças arquitectónicas e funcionais são o produto de uma evolução convergente com uma estratégia mecanicista comum. A análise filogenética mostra que os ortologues de Upc2 só são identificáveis dentro das proteínas Saccharomycotina e Upc2/Ecm22 formam um clade monofilético que não está intimamente relacionado com quaisquer outras proteínas Zn2-Cys6 de Saccharomycotina5. A levedura de brotação, S. cerevisiae, contém cerca de 50 Zn2-Cys6 TFs39. Mesmo que a homologia de sequência de Upc2 para outros tipos de TFs de dedos de zinco seja baixa, eles abrigam uma sequência conservada específica de fungos dentro das LBDs terminais C que era anteriormente conhecida como MHR (região de homologia média)40. A região C-terminal, incluindo o MHR, nas TFs de zinco contém normalmente 13-15 α-helices de elementos de estrutura secundária, o que implica que a presença de uma LBD é uma característica geral desta família de proteínas. Em conclusão, a Upc2 representa uma nova classe de TFs de dedos de zinco mostrando uma analogia funcional com receptores de esteróides metazoários.
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