Articles / octubre 2, 2021

Mecanismo estructural de la regulación del ergosterol por el factor de transcripción de esteroles fúngicos Upc2

Upc2 es un receptor específico para el ergosterol

Upc2 y Ecm22 comparten un alto nivel de similitud de secuencia en los dominios N-terminales de unión al ADN caracterizados por un motivo conservado de dedo de zinc Zn(II)2-Cys621. La región conservada C-terminal de unos 300 residuos de aminoácidos contiene un dominio de activación de la transcripción (Fig. 1a). Dado que la actividad transcripcional de Upc2 depende de los niveles de ergosterol en la célula, se planteó la hipótesis de que el CTD podría servir como LBD para el ergosterol y regular la actividad transcripcional de Upc2. El dehidroergosterol (DHE) es un esterol natural con propiedades fluorescentes intrínsecas, que se encuentra en bajas cantidades en S. cerevisiae22,23. El DHE es muy similar al ergosterol en cuanto a sus propiedades estructurales y químicas, con una única diferencia de doble enlace, y puede sustituir al ergosterol en la levadura sin ninguna interferencia funcional24. Para comprobar si Upc2 se une directamente a los esteroles de la levadura, realizamos el ensayo de unión a DHE fluorescente utilizando CTDs purificados de Upc2 recombinante (residuos 598-913). Los residuos de triptófano de Upc2 se excitaron a 285 nm y se monitorizó el espectro de fluorescencia de la DHE. El análisis espectral reveló que el apagado del triptófano a 340 nm era concomitante con la aparición de tres picos de emisión a 354, 373 y 393 nm (Fig. 1b). Estos picos son característicos de la DHE, lo que sugiere una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) desde la LBD de Upc2 a la DHE unida25,26. La LBD de Upc2 se une a la DHE libre con una afinidad nanomolar, según los experimentos de unión en equilibrio (Fig. 1b). Upc2 LBD también extrae y se une a la DHE embebida en los liposomas DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) como se monitoriza por el incremento de la emisión de fluorescencia a 375 nm cuando Upc2 LBD se añade a los liposomas DOPC:DHE (Fig. 1c,d). Cuando se añadió ergosterol no fluorescente a la mezcla que contenía Upc2 unida a DHE, la emisión de fluorescencia disminuyó indicando que el ergosterol compite con la DHE por la unión a Upc2. Sin embargo, la adición de colesterol no afectó a la unión de la DHE, lo que indica que Upc2 no se une al colesterol. Otros esteroles como el 20-hidroxicolesterol, el 25-hidroxicolesterol, la hidrocortisona y el β-estradiol no compitieron con la DHE, lo que sugiere que el LBD de Upc2 es un receptor específico para esteroles fúngicos como el ergosterol y la DHE (Fig. 1e). Además, para examinar las propiedades de extracción de DHE y ergosterol de Upc2 a partir de los liposomas con una composición lipídica fisiológica de las membranas plasmáticas de las levaduras27, controlamos la extracción de DHE de los liposomas con fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina/fosfatidilinositol/fosfatidilserina/DHE (40:40:10:8:2, mol %) y la unión competitiva del ergosterol con la adición posterior de los liposomas con fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina/fosfatidilinositol/fosfatidilserina/ergosterol (25:25:10:10:30, mol %) a 6.5 μM y 23 nM de liposomas y proteína, respectivamente (Fig. Suplementaria 1). Upc2 se une a la DHE y al ergosterol de manera similar a la de los liposomas DOPC/DHE. Ecm22, el homólogo cercano de Upc2, también se une a la DHE libre de la misma manera que la de Upc2 (Fig. 1f).

Figura 1: Unión específica de Upc2 LBD al ergosterol y a la DHE.

Para comparar los ligandos de esteroles identificados mediante experimentos in vitro con el ligando natural capturado por Upc2 a partir de lisado de células de levadura, caracterizamos el ligando extraído por Upc2 mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa y análisis de cromatografía líquida-espectroscopia de masas (Fig. 2). El ligando capturado fue exclusivamente ergosterol, sin que se detectaran especies de otros lípidos. Dadas las similitudes en las propiedades estructurales y químicas entre el ergosterol y la DHE, y que el ergosterol es mucho más abundante que la DHE en las células de levadura, concluimos que el ergosterol es un ligando fisiológico para Upc2.

Figura 2: Análisis por HPLC y cromatografía líquida-espectrometría de masas del ligando capturado por Upc2 a partir de lisado de células de levadura.

La LBD de Upc2 muestra un nuevo pliegue α-helicoidal

Para examinar la estructura de la LBD C-terminal de Upc2, realizamos los estudios cristalográficos de varias construcciones C-terminal. Los cristales de la LBD de apo Upc2 y de la LBD de Upc2 unida a ergosterol se cristalizaron pero no se difractaron con la radiación de sincrotrón. Para mejorar la calidad de la difracción de los cristales de Upc2 LBD, diseñamos una proteína de fusión (Upc2 LBD-T4L) en la que la lisozima T4 sustituye al bucle variable (residuos 715-725) de Upc2 (ref. 28). La proteína de fusión Upc2-T4L se expresó de forma estable y mostró buenas propiedades de unión a DHE (Fig. 3a), lo que sugiere que la fusión de lisozima T4 no interfiere en la unión del ligando ni en el plegamiento de la proteína. La estructura del LBD C-terminal de apo Upc2 (residuos 598-878)-T4L que carece de los 35 residuos C-terminales se determinó con una resolución de 2,9 Å mediante el método de dispersión anómala simple utilizando cristales marcados con selenometionina. La estructura final que contiene dos moléculas de Upc2-T4L y 29 moléculas de agua en la unidad asimétrica se refinó con un factor R del 24,9% (Tabla 1).

Tabla 1 Estadísticas de recopilación y refinamiento de datos.

La estructura de apo Upc2 LBD muestra un pliegue α-helicoidal globular con forma ovalada (Fig. 3b). El LBD de Upc2 está compuesto por 11 α-hélices y bucles de conexión. Hay una pequeña α-hélice predicha (α12, residuos 889-896) en la región del bucle C-terminal que no se incluyó en la construcción cristalizada. Las 11 α-hélices están dispuestas para formar una pinza cerrada que crea un bolsillo profundo en el núcleo de la proteína. Las tres primeras α-hélices componen los dedos N-terminales y las hélices α8-α9, α7 y α11 componen los otros dedos de la pinza. Las cuatro hélices α3-α6 componen la palma central como un haz helicoidal. El bucle α7-α8 (residuos 760-799) rodea las hélices α8-α9 como una bobina aleatoria más larga en la estructura. La lisozima T4 que sustituye nueve residuos en el bucle α5-α6 está estrechamente localizada en la superficie de Upc2 LBD (Fig. 3c).

La estructura de Upc2 LBD revela un bolsillo hidrofóbico central rodeado de hélices α (Fig. 3d). El bolsillo hidrofóbico profundo tiene un volumen de 287 Å3. Las hélices α5 y α6 componen el fondo del bolsillo y las hélices α1-α2, α7, α9 y α11 componen la pared del bolsillo hidrofóbico de unión. El bolsillo es accesible a un disolvente con un pequeño poro en la superficie. La presencia de un bolsillo hidrofóbico nos sugirió que podría servir como sitio de unión para pequeñas moléculas lipofílicas. La comparación estructural de Upc2 con estructuras conocidas en el PDB utilizando el servidor DALI no encontró estructuras relacionadas con puntuaciones Z >7, lo que sugiere que el LBD de Upc2 representa un nuevo pliegue de un LBD.

La LBD de Upc2 forma un homodímero constitutivo

El análisis de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) demostró que la LBD de Upc2 recombinante o Upc2 LBD-T4L es un dímero homogéneo sin una especie monomérica detectable, lo que sugiere que la Upc2 dimérica es una forma biológicamente relevante. El dímero de Upc2 LBD contiene dos sitios de unión a esteroles y la unión al ligando no afectó al estado oligomérico de Upc2 analizado por SEC (Fig. 4a). Había dos moléculas de Upc2 LBD-T4L relacionadas por un eje doble no cristalino en la unidad asimétrica de los cristales. Upc2 LBD dimeriza por las hélices α1 y α2 formando un haz de cuatro hélices en la interfaz del dímero (Fig. 4b). Los extremos N del dímero de Upc2 LBD están expuestos al mismo lado cerca del centro de la interfaz del dímero. La interfaz del dímero se compone principalmente de residuos hidrofóbicos enterrando 1.562 Å2 de superficie en la interfaz (Fig. 4c). El Met610 está situado en el centro de la interfaz del dímero. El mutante M610R es un monómero en solución analizado por SEC lo que sugiere que el dímero observado en la estructura cristalina es consistente con el observado en solución (Fig. 4a). Los LBDs de C. albicans Upc2 y S. cerevisiae Ecm22 también son dímeros en solución y la mutación M506R de C. albicans Upc2 condujo a la monomerización del LBD. La conservación de los residuos que componen la interfaz del dímero en los homólogos de Upc2 sugiere que la homodimerización de los LBD es una característica general de estas proteínas (Fig. 2 suplementaria).

Figura 4: La LBD de Upc2 forma un dímero.

El bucle C-terminal es esencial para la unión del ligando

La mayoría de las mutaciones de activación constitutiva en S. cerevisiae Upc2 y C. albicans Upc2 se agrupan en el bucle C-terminal entre la hélice α11 y la hélice α12 predicha21,29. La estructura cristalina no incluye este bucle de activación C-terminal de 35 residuos. Para examinar la importancia funcional de este bucle C-terminal, realizamos los ensayos de unión a ligando en los mutantes de deleción C-terminal de Upc2 LBD (Fig. 5a). El truncamiento de los 14 residuos C-terminales (Δ900-913) no afectó a la unión del ligando. Sin embargo, la supresión de los 35 residuos C-terminales (Δ879-913), incluyendo la α12 predicha, abolió la unión a la DHE, sugiriendo que el bucle C-terminal rico en glicina y la hélice α12 son esenciales para la unión al ligando (Fig. 5b). Además, G888D, una mutación de activación constitutiva en el bucle α11-α12 inhibió significativamente la unión de DHE.

figura5 — Figura 5: Bolsillo de unión a esteroles de Upc2.

La estructura cristalina de Upc2 LBD muestra un bolsillo hidrofóbico profundo que podría acomodar una sola molécula de esterol. Sin embargo, el tamaño del bolsillo de unión en la LBD apo Upc2 que carece del bucle de activación C-terminal es ligeramente más pequeño que las dimensiones del ergosterol, lo que implica que la LBD Upc2 debe sufrir un cambio conformacional en la unión del ligando. Para identificar los determinantes estructurales de la unión al esterol de Upc2, intentamos co-cristalizar Upc2 LBD con ergosterol. Sin embargo, debido a la mala difracción de los cristales de Upc2 unidos a esteroles, no fue posible determinar la estructura del complejo del ligando. Como alternativa, probamos el efecto de varias mutaciones en el bolsillo hidrofóbico sobre la unión al esterol. La mutación de los residuos distales al bolsillo, V699Y y R752A, no afectó a la unión del ligando. La mutación de residuos en el bolsillo hidrofóbico de unión a residuos voluminosos (L703F y L820W) redujo significativamente la unión a la DHE, confirmando que el bolsillo hidrofóbico acomoda el esterol (Fig. 5b). Además, la mutación M610R abolió por completo la unión al esterol, lo que implica que la dimerización del LBD de Upc2 es necesaria para la unión al esterol. Los LBDs de todos los homólogos de Upc2 en las especies fúngicas muestran un alto grado de conservación de la secuencia (Fig. 2 suplementaria). En concreto, los residuos situados en la interfaz de dimerización, el bolsillo de unión al ligando y el bucle de activación C-terminal están estrictamente conservados.

La Upc2 citosólica se relocaliza en el núcleo al activarse

Las características estructurales y de unión al ligando únicas de Upc2 nos sugirieron que Upc2 podría relocalizarse al núcleo al unirse al ligando en el citosol. Examinamos la localización celular de Upc2 de longitud completa y sus mutantes en condiciones ricas en ergosterol o deficientes en ergosterol. Anteriormente, había varios informes contradictorios sobre la localización de Upc2 en el núcleo, el citoplasma y los focos perinucleares utilizando la fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) C-terminal30,31,32. Sin embargo, los determinantes clave de la localización de Upc2 no han sido definidos experimentalmente. En este estudio, para evitar la interferencia funcional de la GFP con el bucle de activación C-terminal y la unión del ligando, la GFP se marcó en el extremo N de Upc2. La Upc2 de tipo salvaje está presente principalmente en el citosol con una leve localización nuclear en el 30% de la población celular. Cuando las células de levadura se cultivaron en presencia de 5 mM de ergosterol, Upc2 se localizó casi exclusivamente en el citoplasma. Sin embargo, la adición de 4 μg ml-1 de fluconazol al medio de cultivo, que inhibe la biosíntesis de ergosterol, desplazó la localización de Upc2 al núcleo en toda la población celular (Fig. 6). Upc2 contiene una señal de localización nuclear bipartita (NLS) aguas arriba de su secuencia de cluster Zn2-Cys6 que le confiere una propiedad intrínseca de localización nuclear. La supresión de la NLS (residuos 2-43) hizo que Upc2 fuera completamente citosólica. Además, el LBD aislado (residuos 598-913) o el constructo que carece de NLS-DBD (residuos del constructo 283-913) era completamente citosólico independientemente de los niveles de esteroles. Por el contrario, la deleción del LBD C-terminal (ΔLBD, residuos del constructo 1-559) mostró una fuerte localización nuclear independiente de los niveles de esterol. Estos datos sugieren que el LBD C-terminal unido al ergosterol suprime el transporte nuclear de Upc2 al inhibir la función del NLS. La disociación del ligando esterol de Upc2 puede conducir a la exposición de la NLS o liberar a Upc2 de la captura por parte de las proteínas citosólicas para su transporte nuclear. La deleción del bucle C-terminal (Δ879-913) que interrumpe la unión del ergosterol condujo a una modesta localización nuclear de Upc2. G888D o las mutaciones en el bolsillo de unión al esterol (L820W o L703F) condujeron a una fuerte localización nuclear constitutiva de Upc2. La mutación M610R, que interrumpe la dimerización del LBD y la unión del ligando, muestra principalmente una localización nuclear independientemente del nivel de esterol, lo que sugiere que la dimerización de Upc2 es esencial para su función reguladora. En conclusión, estas observaciones junto con los ensayos de unión a ligandos sugieren que la unión a esteroles es el mecanismo clave en la regulación de la localización del FT. En condiciones ricas en esteroles, Upc2 se une al ergosterol y está presente en el citosol en forma reprimida. Al agotarse el ergosterol, Upc2 no ligado se activa y se desplaza al núcleo para la activación transcripcional de los genes relacionados.

figura6 — Figura 6: Localización celular de las construcciones GFP-Upc2.

Upc2 regula el nivel de ergosterol en las células de levadura

Upc2 y Ecm22 se unen a un elemento regulador de esteroles conservado de 7 pb dentro de los promotores de la mayoría de los genes ERG, incluyendo ERG2, ERG3 y ERG11 (refs 2, 21). Para investigar el mecanismo de regulación transcripcional de Upc2, comprobamos la actividad transcripcional de varias construcciones de Upc2 utilizando ERG2-LacZ como reportero (Fig. 7a). El Upc2 de tipo salvaje mostró una actividad transcripcional moderada en condiciones normales de crecimiento. El tratamiento con fluconazol aumenta la actividad de transcripción más de dos veces. Sin embargo, el plásmido vacío o la supresión del LBD C-terminal mostraron una actividad de transcripción muy débil, lo que sugiere que el LBD es esencial para la actividad transcripcional de Upc2. La mutación G888D, independientemente del tratamiento con fluconazol, mostró una activación constitutiva completa de Upc2, que es 1,2 veces superior a la del tipo salvaje inducido. Esta observación es coherente con el informe anterior de que el CTD es esencial para la activación de la transcripción de Upc2 (ref. 21). La M610R no mostró un aumento de la actividad transcripcional en la depleción de esteroles, lo que sugiere que la dimerización es esencial para la función reguladora. La supresión del bucle de activación C-terminal (ΔCT) que muestra una localización nuclear constitutiva, sin embargo, mostró al menos un 30% menos de actividad transcripcional que el tipo salvaje no inducido. Además, la actividad de transcripción de ΔCT no aumentó con el tratamiento con fluconazol. Estos datos sugieren que el bucle de activación C-terminal es esencial no sólo para la regulación de la localización de la proteína sino para la actividad de transcripción completa de Upc2. La interrupción de la unión al esterol mediante L703F o L820W mostró una localización nuclear constitutiva. Sin embargo, las actividades de transcripción de estos mutantes eran un 40% menores que las del tipo salvaje y no mejoraban significativamente en la inducción de fluconazol. Parece que la introducción de residuos voluminosos en el bolsillo de unión al esterol no sólo interrumpe la unión al esterol, sino que también perturba la conformación adecuada de Upc2 para su plena actividad transcripcional. Estas observaciones, junto con los experimentos de unión a ligandos y de localización celular, sugieren que la unión a esteroles no sólo regula la localización de la proteína, sino también la actividad transcripcional de Upc2. Para confirmar que Upc2 está implicada en la regulación del nivel de ergosterol en las células, cuantificamos el contenido total de ergosterol de las células de levadura que contenían alelos UPC2 de tipo salvaje o mutante (Fig. 7b). Dado que Upc2 activa la expresión de los genes biosintéticos del ergosterol, es concebible que el nivel de esteroles de las células de levadura se correlacione indirectamente con la actividad transcripcional de Upc2. En ausencia de los genes UPC2 y ECM22, los niveles de esteroles de las células de levadura eran débilmente detectables, y la adición de 4 μg ml-1 de fluconazol inhibía gravemente el crecimiento de las células de levadura. El Upc2 de tipo salvaje mostró un nivel de ergosterol en la célula similar al de L703F y L820W en ausencia de fluconazol. El tratamiento con fluconazol suprimió el nivel de ergosterol en aproximadamente un 40% en las cepas de tipo salvaje, L793F y L820W. La supresión de los 35 residuos C-terminales (ΔCT) dio lugar a un nivel de ergosterol ligeramente superior al de las células de tipo salvaje. Sin embargo, el fluconazol suprimió el nivel de esterol de las células mutantes ΔCT y M610R más significativamente que el de las células de tipo salvaje. Upc2 que carece de LBD mostró cierto nivel basal de síntesis de esteroles en ausencia de fluconazol. Sin embargo, la presencia de 4 μg ml-1 de fluconazol inhibió significativamente el nivel de esteroles y el crecimiento celular. Las células que expresan el mutante G888D tienen niveles de ergosterol tres veces superiores en comparación con las células que expresan el Upc2 de tipo salvaje. Los niveles de ergosterol fueron mayores en las células mutantes G888D tratadas con fluconazol en comparación con los encontrados en las células de tipo salvaje cultivadas sin fluconazol. Estos datos sugieren que la mutación G888D activa constitutivamente a Upc2 para la biosíntesis de ergosterol, lo que conduce a una mayor resistencia a los antifúngicos azólicos. Para confirmar que Upc2 está implicada en la regulación de la expresión génica de las enzimas biosintéticas del ergosterol, realizamos un análisis cuantitativo de la expresión génica de ERG11 mediante PCR en tiempo real utilizando las cepas upc2/ecm22-knockout con alelos UPC2 de tipo salvaje y mutante. Medimos los niveles de ARNm de los genes ERG11 que fueron normalizados por el gen TAF10 como control interno33. Los datos indican que los niveles de expresión de ARNm de ERG11 se correlacionan con las actividades promotoras de ERG2 y los niveles de ergosterol como se esperaba (Fig. Suplementaria 3).

figura7 — Figura 7: Nivel de ergosterol y resistencia a los antibióticos.

La activación de Upc2 confiere resistencia al agente antifúngico

Para investigar la relación entre la activación de Upc2 y la resistencia a los agentes antifúngicos, comprobamos las susceptibilidades al fluconazol de las cepas upc2Δ ecm22Δ o ecm22Δ que expresaban los alelos UPC2 de tipo salvaje o mutante (Fig. 7c). Dado que el fluconazol interfiere en el crecimiento de las células de levadura al inhibir la biosíntesis de ergosterol, los patrones generales de crecimiento celular mostraron una correlación con los niveles de esteroles de las células tratadas con fluconazol. Las células con doble knockout de upc2Δ ecm22Δ no crecieron en presencia de fluconazol. La introducción de UPC2 de tipo salvaje permitió un débil crecimiento celular a 8 μg ml-1 de fluconazol. Las células de levadura que expresaban un mutante G888D mostraron un aumento significativo de la resistencia al fluconazol a 8 μg ml-1. Sin embargo, el mutante G888D creció más débilmente que el tipo salvaje en ausencia de fluconazol, lo que sugiere que la activación constitutiva completa de Upc2 es desventajosa en condiciones no selectivas al imponer una carga metabólica34. El mutante ΔLBD que carece de actividad de transcripción no creció a la menor concentración de fluconazol. Los mutantes L820W, L703F, M610R y ΔCT que interfieren en la unión de esteroles fueron más susceptibles al fluconazol que el tipo salvaje. La cepa única upc2Δ-knockout que alberga el alelo ECM22 permitió un crecimiento débil en una concentración baja de fluconazol, lo que sugiere que ECM22 tiene un papel parcialmente superpuesto en la activación de los genes implicados en la resistencia a los azoles. Sin embargo, en las concentraciones de fluconazol superiores a 6 μg ml-1, las cepas upc2Δ y upc2Δ ecm22Δ no mostraron diferencias significativas en las susceptibilidades de todas las construcciones Upc2, lo que sugiere que Upc2 desempeña un papel dominante en la regulación de los esteroles. Esto es coherente con las observaciones anteriores de que la deleción de UPC2 da lugar a la sensibilidad al ketoconazol, mientras que no se observó ningún efecto con la deleción de Ecm22, lo que sugiere que Ecm22 y Upc2 tienen objetivos específicos con algunas funciones esenciales que se solapan35,36.

Upc2 es una nueva clase de TFs de dedos de zinc

Estudios recientes propusieron que varios miembros de la familia de reguladores de la transcripción del clúster de zinc fúngico pueden representar análogos funcionales de los NRs metazoos13,18,19,20.

Aunque los TFs fúngicos del cluster de zinc no tienen ninguna similitud estructural o de secuencia aparente con los NRs metazoos, Upc2 muestra similitudes conceptuales con los NRs esteroides en las arquitecturas generales de los dominios, la unión de ligandos de esteroles, la homodimerización, la regulación transcripcional dependiente de ligandos y la translocación nuclear.

Upc2 y los NRs metazoos contienen dominios de unión al ADN de dedos de zinc en sus regiones N-terminales. Los dedos de zinc que coordinan dos iones de zinc están compuestos por seis cisteínas en el caso de Upc2 y por cuatro cisteínas en cada uno de los dos dedos de NRs37. Los dominios de unión al ADN de los NRs y los TFs de dedos de zinc son estructuralmente similares y se unen al ADN como homo- o heterodímeros13. Los TFs de dedos de zinc tienen un dominio regulador negativo C-terminal, que para un número de miembros de la familia media la unión a ligandos o la respuesta a pequeñas moléculas como metabolitos celulares y ligandos lipofílicos13. La actividad transcripcional de Upc2 está regulada por el ergosterol, que es funcionalmente similar a los NR esteroides de tipo I en términos de especificidades de ligando. Tanto Upc2 como los receptores de esteroides forman homodímeros. Upc2 forma homodímeros constitutivos independientemente de la unión del ligando. Se ha informado de que el receptor de estrógenos α existe como un dímero incluso en el estado apo y la unión del ligando estabiliza aún más el homodímero38.

La comparación estructural de Upc2 con los NRs esteroides de mamíferos revela que Upc2 tiene un pliegue α-helicoidal de LBD distintivo de los NRs de mamíferos (Fig. Suplementaria 4). Ambos reguladores genéticos se componen principalmente de unas 12 estructuras α-helicoidales con dimensiones similares de LBDs. Los LBDs de Upc2 y de los receptores de estrógeno y progesterona forman dímeros mediante interacciones de haces de hélices. Sin embargo, salvo la configuración general de los dímeros con sitios de unión al ligando estrechamente situados en la interfaz del dímero, no existe una clara homología estructural entre Upc2 y los RN. Al unirse al ligando, los receptores de esteroides se disocian de la proteína de choque térmico Hsp90 en el citosol y se trasladan al núcleo, uniéndose a los promotores de sus genes diana como homodímeros17. En consecuencia, la translocación de Upc2 del citosol al núcleo está regulada de forma dependiente del ligando.

Sin embargo, el LBD de Upc2 muestra un pliegue estructural completamente diferente en comparación con los LBDs de los NRs metazoos. La falta de similitudes secuenciales y estructurales entre los TFs de clústeres de zinc de los hongos y los NRs de los metazoos sugiere que las similitudes arquitectónicas y funcionales son el producto de una evolución convergente con una estrategia mecanística común. El análisis filogenético muestra que los ortólogos de Upc2 sólo son identificables dentro de la Saccharomycotina y las proteínas Upc2/Ecm22 forman un clado monofilético que no está estrechamente relacionado con ninguna otra proteína Zn2-Cys6 de la Saccharomycotina5. La levadura en ciernes, S. cerevisiae, contiene alrededor de 50 TFs Zn2-Cys639. Aunque la homología de secuencia de Upc2 con otros tipos de TFs de dedos de zinc es baja, albergan una secuencia conservada específica de los hongos dentro de los LBDs C-terminales que se conocía previamente como MHR (región de homología media)40. La región C-terminal, incluyendo la MHR, en los TFs de zinc contiene comúnmente 13-15 α-hélices de elementos de estructura secundaria, lo que implica que la presencia de un LBD es una característica general de esta familia de proteínas. En conclusión, Upc2 representa una nueva clase de TFs de dedo de zinc que muestra una analogía funcional con los receptores de esteroides de los metazoos.

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