Mecanismul structural de reglare a ergosterolului de către factorul de transcripție a sterolului fungic Upc2

Upc2 este un receptor specific pentru ergosterol

Upc2 și Ecm22 au un nivel ridicat de similaritate de secvență în domeniile N-terminale de legare la ADN, caracterizate de un motiv conservat de deget de zinc Zn(II)2-Cys621. Regiunea conservată C-terminală de aproximativ 300 de resturi de aminoacizi conține un domeniu de activare a transcripției (Fig. 1a). Deoarece activitatea transcripțională a Upc2 depinde de nivelurile de ergosterol din celulă, am emis ipoteza că CTD poate servi ca LBD pentru ergosterol și poate regla activitatea transcripțională a Upc2. Dehidroergosterolul (DHE) este un sterol natural cu proprietăți intrinseci de fluorescență, care se găsește în cantități reduse în S. cerevisiae22,23. DHE este foarte asemănător cu ergosterolul în ceea ce privește proprietățile structurale și chimice, cu o singură diferență de legătură dublă, și poate înlocui ergosterolul în drojdie fără nicio interferență funcțională24. Pentru a testa dacă Upc2 se leagă direct de steroli din drojdie, am efectuat testul fluorescent de legare a DHE folosind CTD purificate ale Upc2 recombinant (reziduurile 598-913). Reziduurile de triptofan din Upc2 au fost excitate la 285 nm și a fost monitorizat spectrul de fluorescență al DHE. Analiza spectrală a arătat că stingerea triptofanului la 340 nm a fost concomitentă cu apariția a trei vârfuri de emisie la 354, 373 și 393 nm (Fig. 1b). Aceste vârfuri sunt caracteristice DHE, ceea ce sugerează transferul de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET) de la Upc2 LBD la DHE legat25,26. Upc2 LBD se leagă de DHE liber cu o afinitate nanomolară, măsurată prin experimente de legare în echilibru (Fig. 1b). Upc2 LBD extrage și leagă, de asemenea, DHE încorporat în lipozomii DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolină), după cum a fost monitorizat prin creșterea emisiei de fluorescență la 375 nm atunci când Upc2 LBD a fost adăugat la lipozomii DOPC:DHE (Fig. 1c,d). Atunci când ergosterolul nefluorescent a fost adăugat la amestecul care conținea Upc2 legat de DHE, emisia de fluorescență a scăzut, ceea ce indică faptul că ergosterolul concurează cu DHE pentru legarea la Upc2. Cu toate acestea, adăugarea de colesterol nu a afectat legarea DHE, ceea ce indică faptul că Upc2 nu se leagă de colesterol. Alți steroli, cum ar fi 20-hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, hidrocortizon și β-estradiol nu au intrat în competiție cu DHE, sugerând că Upc2 LBD este un receptor specific pentru steroli fungici, cum ar fi ergosterolul și DHE (Fig. 1e). În plus, pentru a examina proprietățile de extracție a DHE și a ergosterolului de către Upc2 din lipozomi cu o compoziție lipidică fiziologică a membranelor plasmatice de drojdie27, am monitorizat extracția DHE din lipozomi cu fosfatidilcolină/fosfatidiletanolamină/fosfatidilinositol/fosfatidilserină/DHE (40:40:10:10:8:2, mol %) și legarea competitivă a ergosterolului prin adăugarea ulterioară a lipozomilor cu fosfatidilcolină/fosfatidiletanolamină/fosfatidilinositol/fosfatidilserină/ergosterol (25:25:10:10:10:30, mol %) la 6.5 μM și 23 nM de lipozomi și, respectiv, de proteină (Fig. suplimentară 1). Upc2 se leagă de DHE și ergosterol într-un mod similar cu cel al lipozomilor DOPC/DHE. Ecm22, omologul apropiat al Upc2, se leagă, de asemenea, de DHE liber în același mod ca și Upc2 (Fig. 1f).

(a) Prezentarea schematică a structurilor domeniilor Upc2 și Ecm22 în S. cerevisia (S.c.) și C. albicans (C.a.). (b) Curbe de legare a DHE pentru LBD Upc2 de tip sălbatic și mutantul de trunchiere C-terminală a LBD Upc2 (Δ878-913). Intensitatea emisiei de fluorescență la 375 nm a probelor (λex=285 nm) a fost reprezentată grafic cu cantități crescânde de concentrații de DHE. Fiecare punct de date prezentat reprezintă media a trei măsurători, iar barele de eroare reprezintă s.d. Curbele de ajustare la punctele de date au fost calculate pe baza modelului de legare la un singur situs. Un set de spectre de emisie de fluorescență pentru Upc2 LBD de tip sălbatic a fost prezentat în panoul din dreapta. Cinci reziduuri de triptofan care sunt situate la mai puțin de 15 Å de buzunarul de legare au fost indicate prin sfere roșii pe panoul din dreapta. (c) Măsurarea în timp real a extracției DHE de către Upc2 LBD din lipozomi DOPC mari. Lipozomii conțineau în total 124 μM de fosfatidilcolină și DHE într-un raport molar de 98:2. Upc2 LBD a fost adăugat în lipozomi cu o concentrație finală de 0,73 μM la începutul măsurătorilor cinetice. S-a adăugat ergosterol sau colesterol nefluorescent la concentrația finală de 2,5 μM la 40 min pentru legarea competitivă la DHE. (d) Spectrele de emisie de fluorescență (λex=285 nm) ale probelor în timpul și la sfârșitul cineticii sunt prezentate pentru c. (e) Spectrele de emisie de fluorescență (λex=285 nm) ale diferiților steroli pentru legarea competitivă la DHE. Cele 0,6 μM de Upc2 LBD au fost încărcate cu 2,5 μM de DHE liber. Trei linii diferite în fiecare experiment reprezintă diferite concentrații de liganzi concurențiali (25-hidroxicolesterol, 20-hidroxicolesterol, hidrocortizon și β-estradiol) cu 2,5, 4 și, respectiv, 10 μM. β-estradiolul este un compus fluorescent natural. Asteriscul indică emisia de fluorescență intrinsecă a β-estradiolului la 310 nm (λex=285 nm). (f) Spectrele de emisie de fluorescență ale LBD al Ecm22 la legarea DHE.

Pentru a compara liganzii sterolici identificați prin experimentele in vitro cu ligandul natural capturat de Upc2 din lizatul celulelor de drojdie, am caracterizat ligandul extras de Upc2 folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu fază inversă și analize de cromatografie lichidă-spectroscopie de masă (Fig. 2). Ligandul capturat a fost exclusiv ergosterol, fără specii detectabile de alte lipide. Având în vedere asemănările în ceea ce privește proprietățile structurale și chimice dintre ergosterol și DHE, precum și faptul că ergosterolul este mult mai abundent decât DHE în celulele de drojdie, am concluzionat că ergosterolul este un ligand fiziologic pentru Upc2.

(a) Profilul de eluție HPLC în fază inversă al ergosterolului pur standard (Sigma 45480) și al ligandului extras din Upc2 LBD. (b) Analiza prin spectroscopie de masă a ergosterolului standard și a ligandului extras din Upc2 LBD. Identificarea ligandului captat de Upc2 s-a realizat prin compararea proprietăților cromatografice și a spectroscopiei de masă cu standardul de referință și cu datele din literatura de specialitate56. AMU, unitate de masă atomică; UV, ultraviolet.

Upc2 LBD prezintă un nou pliu α-helicoidal

Pentru a examina structura LBD-ului C-terminal al Upc2, am efectuat studii cristalografice pe diferite construcții C-terminale. Cristalele de LBD apo Upc2 și LBD Upc2 legat de ergosterol au fost cristalizate, dar nu au difractat la radiația sincrotronică. Pentru a îmbunătăți calitatea difracției cristalelor Upc2 LBD, am proiectat o proteină de fuziune (Upc2 LBD-T4L) în care lizozimul T4 înlocuiește bucla variabilă (reziduurile 715-725) din Upc2 (ref. 28). Proteina de fuziune Upc2-T4L a fost exprimată în mod stabil și a prezentat proprietăți bune de legare a DHE (Fig. 3a), ceea ce sugerează că fuziunea lizozimei T4 nu interferează cu legarea ligandului și cu plierea proteinei. Structura LBD-ului C-terminal al apo Upc2 (reziduurile 598-878)-T4L căruia îi lipsesc cele 35 de reziduuri C-terminale a fost determinată la o rezoluție de 2,9 Å prin metoda dispersiei unice anormale folosind cristale marcate cu selenometionină. Structura finală care conține două molecule de Upc2-T4L și 29 de molecule de apă în unitatea asimetrică a fost rafinată la un factor R de 24,9% (tabelul 1).

(a) Spectrele de emisie de fluorescență ale construcției de fuziune Upc2 LBD-T4L (reziduurile 598-913) la legarea DHE. (b) Structura generală a Upc2 LBD. Structura a fost colorată cu roșu spre albastru în funcție de succesiunea structurii secundare. Lizozima T4 fuzionată în bucla α5-α6 nu a fost prezentată pentru claritate. (c) Structura globală a dimerului Upc2 LBD-T4L cu reprezentare cilindrică. Locația buzunarului hidrofob profund în unul dintre protomerii Upc2 este indicată printr-un cerc negru. (d) Reprezentare de suprafață a monomerului Upc2 LBD. Reziduurile care compun peretele buzunarului hidrofob sunt reprezentate în bastonașe. Buzunarul hidrofob este indicat în reprezentarea gri a suprafeței. Conc., concentrație; C-term, C-terminal; N-term, N-terminal.

Structura apo Upc2 LBD prezintă un pliu globular α-helicoidal cu o formă ovală (Fig. 3b). LBD-ul Upc2 este compus din 11 α-helice și bucle de legătură. Există o mică α-helixă prezisă (α12, reziduurile 889-896) în regiunea buclă C-terminală care nu a fost inclusă în construcția cristalizată. Cele 11 α-helice sunt dispuse pentru a forma o clemă închisă care creează un buzunar adânc în miezul proteinei. Primele trei α-helice compun degetele N-terminale, iar elicele α8-α9, α7 și α11 compun celelalte degete ale clemei. Cele patru elice α3-α6 compun palma centrală sub forma unui pachet elicoidal. Bucla α7-α8 (reziduurile 760-799) înconjoară elicele α8-α9 ca o spirală aleatorie cea mai lungă din structură. Lizozima T4 care înlocuiește nouă reziduuri în bucla α5-α6 este localizată îndeaproape pe suprafața Upc2 LBD (Fig. 3c).

Structura Upc2 LBD relevă un buzunar hidrofob central înconjurat de elicele α (Fig. 3d). Buzunarul hidrofob profund are un volum de 287 Å3. Elicele α5 și α6 compun partea inferioară a buzunarului, iar elicele α1-α2, α7, α9 și α11 compun peretele buzunarului de legare hidrofobă. Buzunarul este accesibil unui solvent cu un por mic la suprafață. Prezența unui buzunar hidrofob ne-a sugerat că acesta poate servi ca situs de legare pentru molecule lipofile mici. Compararea structurală a Upc2 cu structurile cunoscute din PDB cu ajutorul serverului DALI nu a găsit structuri înrudite cu scoruri Z >7, sugerând că LBD Upc2 reprezintă un nou pliu al unui LBD.

Upc2 LBD formează un homodimer constitutiv

Analiza prin cromatografie de excludere a dimensiunilor (SEC) a demonstrat că Upc2 LBD recombinant sau Upc2 LBD-T4L este un dimer omogen, fără o specie monomerică detectabilă, sugerând că Upc2 dimeric este o formă relevantă din punct de vedere biologic. Dimerul Upc2 LBD conține două situsuri de legare a sterolului, iar legarea ligandului nu a afectat starea oligomerică a Upc2, așa cum a fost analizată prin SEC (Fig. 4a). Au existat două molecule de Upc2 LBD-T4L legate printr-o axă dublă necristalografică în unitatea asimetrică a cristalelor. Upc2 LBD se dimerizează prin elicele α1 și α2 formând un pachet de patru elice în interfața dimerului (Fig. 4b). Extremitățile N ale dimerului Upc2 LBD sunt expuse în aceeași parte, aproape de centrul interfeței dimerului. Interfața dimerului este compusă în principal din reziduuri hidrofobe care înglobează 1.562 Å2 de suprafață la interfață (Fig. 4c). Met610 este situat în centrul interfeței dimerice. Mutantul M610R este un monomer în soluție analizat prin SEC, sugerând că dimerul observat în structura cristalină este în concordanță cu cel observat în soluție (Fig. 4a). LBD-urile lui C. albicans Upc2 și S. cerevisiae Ecm22 sunt, de asemenea, dimeri în soluție, iar mutația M506R a lui C. albicans Upc2 a dus la monomerizarea LBD-ului. Conservarea reziduurilor care compun interfața dimeră la omologii Upc2 sugerează că homodimerizarea LBD-urilor este o caracteristică generală a acestor proteine (Fig. suplimentară 2).

(a) Profiluri de SEC pentru LBD-urile lui Upc2 din S. cerevisiae (S.c.), Upc2 din C. albicans (C.a.) și Ecm22 din S. cerevisiae. Profilurile tipului sălbatic și ale mutanților de interfață a dimerului (M610R în S. cerevisiae Upc2 și L506R în C. albicans Upc2) sunt prezentate în albastru și, respectiv, în verde. Profilurile LBD-urilor Upc2 și Ecm22 legate de ergosterol sunt prezentate în linii roșii. LBD-urile legate de ergosterol au fost preparate prin amestecarea LBD-urilor purificate și a ergosterolului într-un raport molar de 1:5, iar amestecul a fost incubat peste noapte înainte de analiza SEC. (b) Vedere laterală a dimerului LBD Upc2. (c) Vedere detaliată a interfeței dimerului Upc2. Un protomer este reprezentat în culoarea curcubeului, iar celălalt în alb.

Bucla C-terminală este esențială pentru legarea ligandului

Majoritatea mutațiilor de activare constitutivă în Upc2 din S. cerevisiae Upc2 și Upc2 din C. albicans Upc2 sunt grupate în bucla C-terminală între helixul α11 și helixul α12 prezis21,29. Structura cristalină nu include această buclă de activare C-terminală de 35 de reziduuri. Pentru a examina importanța funcțională a acestei bucle C-terminale, am efectuat testele de legare a ligandului pe mutanții de deleție C-terminală a LBD Upc2 (Fig. 5a). Trunchierea celor 14 reziduuri C-terminale (Δ900-913) nu a afectat legarea ligandului. Cu toate acestea, ștergerea celor 35 de reziduuri C-terminale (Δ879-913), inclusiv a prezisului α12, a abolit legarea DHE, sugerând că bucla C-terminală bogată în glicină și helixul α12 sunt esențiale pentru legarea ligandului (Fig. 5b). În plus, G888D, o mutație de activare constitutivă în bucla α11-α12 a inhibat în mod semnificativ legarea DHE.

(a) Spectrele de emisie de fluorescență ale diferiților mutanți la legarea DHE. Spectrele de emisie la mai multe momente de timp au fost prezentate în culori diferite. (b) Reprezentare sub formă de panglică a buzunarului hidrofob. Buzunarul hidrofob este prezentat în reprezentarea gri a suprafeței. Urma speculativă a buclei de activare C-terminală care nu a fost inclusă în construcția cristalizată este reprezentată prin puncte roșii.

Structura cristalină a Upc2 LBD arată un buzunar hidrofob profund care ar putea găzdui o singură moleculă de sterol. Cu toate acestea, dimensiunea buzunarului de legare în apo Upc2 LBD lipsit de bucla de activare C-terminală este ușor mai mică decât dimensiunile ergosterolului, ceea ce implică faptul că Upc2 LBD trebuie să sufere o modificare conformațională la legarea ligandului. Pentru a identifica factorii structurali determinanți pentru legarea de sterol a Upc2, am încercat să cristalizăm în comun Upc2 LBD cu ergosterol. Cu toate acestea, din cauza difracției slabe a cristalelor Upc2 legate de sterol, nu a fost posibilă determinarea structurală a complexului ligand. Alternativ, am testat efectul mai multor mutații în buzunarul hidrofob asupra legăturii cu sterolul. Mutația reziduurilor distale față de buzunar, V699Y și R752A, nu a afectat legarea ligandului. Mutarea reziduurilor din buzunarul de legare hidrofobă în reziduuri voluminoase (L703F și L820W) a redus semnificativ legarea DHE, confirmând faptul că buzunarul hidrofob găzduiește sterolul (Fig. 5b). În plus, mutația M610R a abolit complet legarea sterolului, ceea ce implică faptul că dimerizarea LBD Upc2 este necesară pentru legarea sterolului. LBD-urile tuturor omologilor Upc2 din speciile fungice prezintă un grad ridicat de conservare a secvenței (figura suplimentară 2). În mod specific, reziduurile situate în interfața de dimerizare, buzunarul de legare a ligandului și bucla de activare C-terminală sunt strict conservate.

Upc2 citosolic se relocalizează în nucleu la activare

Caracteristicile structurale și de legare a ligandului unice ale Upc2 ne-au sugerat că Upc2 se poate relocaliza în nucleu la legarea ligandului în citosol. Am examinat localizarea celulară a Upc2 de lungime completă și a mutanților săi în condiții de bogăție de ergosterol sau de deficit de ergosterol. Anterior, au existat mai multe rapoarte contradictorii cu privire la localizarea Upc2 în nucleu, citoplasmă și focare perinucleare utilizând fuziunea proteinei fluorescente verzi (GFP) C-terminale30,31,32. Cu toate acestea, factorii determinanți cheie ai localizării Upc2 nu au fost definiți experimental. În acest studiu, pentru a evita interferența funcțională a GFP cu bucla de activare C-terminală și cu legarea ligandului, GFP a fost marcată la terminația N a Upc2. Upc2 de tip sălbatic este prezent în cea mai mare parte în citosol, cu o ușoară localizare nucleară în 30% din populația celulară. Atunci când celulele de drojdie au fost cultivate în prezența a 5 mM ergosterol, Upc2 a fost localizat aproape exclusiv în citoplasmă. Cu toate acestea, adăugarea a 4 μg ml-1 de fluconazol în mediile de cultură, care inhibă biosinteza ergosterolului, a mutat localizarea Upc2 în nucleu la o întreagă populație celulară (Fig. 6). Upc2 conține un semnal bipartit de localizare nucleară (NLS) în amonte de secvența clusterului său Zn2-Cys6 care îi conferă o proprietate intrinsecă de localizare nucleară. Eliminarea NLS (reziduurile 2-43) a făcut ca Upc2 să fie complet citosolic. În plus, LBD izolată (reziduurile 598-913) sau construcția lipsită de NLS-DBD (reziduurile 283-913) a fost complet citosolică, indiferent de nivelurile de steroli. În schimb, ștergerea LBD-ului C-terminal (ΔLBD, reziduu de construcție 1-559) a arătat o localizare nucleară puternică, independentă de nivelurile de steroli. Aceste date sugerează că LBD-ul C-terminal legat de ergosterol suprimă transportul nuclear al Upc2 prin inhibarea funcției NLS. Disocierea ligandului de sterol din Upc2 poate duce la expunerea NLS sau la eliberarea Upc2 de la capturarea de către proteinele citosolice pentru transportul nuclear. Eliminarea buclei C-terminale (Δ879-913) care întrerupe legarea ergosterolului a dus la o localizare nucleară modestă a Upc2. G888D sau mutațiile în buzunarul de legare a sterolului (L820W sau L703F) au dus la o puternică localizare nucleară constitutivă a Upc2. Mutația M610R, care întrerupe dimerizarea LBD și legarea ligandului, prezintă localizare nucleară în cea mai mare parte, indiferent de nivelul de sterol, sugerând că dimerizarea lui Upc2 este esențială pentru funcția sa de reglementare. În concluzie, aceste observații, împreună cu testele de legare a ligandului, sugerează că legarea sterolului este mecanismul cheie în reglarea localizării TF. Într-o condiție bogată în steroli, Upc2 este legat de ergosterol și este prezent în citosol ca formă reprimată. La epuizarea ergosterolului, Upc2 nelegat este activat și se deplasează în nucleu pentru activarea transcripțională a genelor înrudite.

Celulele au fost cultivate în 4 μg ml-1 de fluconazol sau 5 mM de ergosterol timp de 12 h înainte de vizualizarea prin microscopie cu fluorescență. Panourile de sus arată localizarea GFP-Upc2. DAPI colorează atât ADN-ul nuclear sub formă de sfere, cât și ADN-ul mitocondrial sub formă de pete luminoase care întunecă caracteristicile de segregare a ADN-ului nuclear. ADN-ul nuclear poate fi diferențiat de ADN-ul mitocondrial prin dimensiunea și forma sa. Localizarea nucleară a Upc2 apare ca sfere verzi strălucitoare în interiorul celulelor. Bară de scară, 3 μm.

Upc2 reglează nivelul de ergosterol în celulele de drojdie

Upc2 și Ecm22 se leagă la un element de reglare a sterolului conservat de 7-bp în cadrul promotorilor majorității genelor ERG, inclusiv ERG2, ERG3 și ERG11 (refs 2, 21). Pentru a investiga mecanismul de reglare transcripțională a Upc2, am verificat activitatea transcripțională a diferitelor construcții Upc2 folosind ERG2-LacZ ca reporter (Fig. 7a). Upc2 de tip sălbatic a prezentat o activitate transcripțională moderată în condiții normale de creștere. Tratamentul cu fluconazol crește activitatea de transcriere de peste două ori. Cu toate acestea, plasmidă goală sau ștergerea LBD C-terminal a prezentat o activitate de transcriere foarte slabă, sugerând că LBD este esențială pentru activitatea transcripțională a Upc2. Mutația G888D, indiferent de tratamentul cu fluconazol, a arătat o activare constitutivă completă a Upc2, care este de 1,2 ori mai mare decât tipul sălbatic indus. Această observație este în concordanță cu raportul anterior conform căruia CTD-ul este esențial pentru activarea transcripției lui Upc2 (ref. 21). M610R nu a prezentat nicio creștere a activității transcripționale la depleția de steroli, sugerând că dimerizarea este esențială pentru funcția de reglementare. Cu toate acestea, ștergerea buclei de activare C-terminală (ΔCT), care prezintă o localizare nucleară constitutivă, a prezentat o activitate transcripțională cu cel puțin 30% mai mică decât tipul sălbatic neindus. În plus, activitatea de transcripție a ΔCT nu a crescut la tratamentul cu fluconazol. Aceste date sugerează că bucla de activare C-terminală este esențială nu numai pentru reglarea localizării proteice, ci și pentru întreaga activitate de transcripție a Upc2. Întreruperea legării sterolului prin L703F sau L820W a arătat o localizare nucleară constitutivă. Cu toate acestea, activitățile de transcripție ale acestor mutanți au fost cu 40% mai mici decât cele ale tipului sălbatic și nu au fost îmbunătățite semnificativ la inducerea cu fluconazol. Se pare că introducerea de reziduuri voluminoase în buzunarul de legare a sterolului nu numai că întrerupe legarea sterolului, dar perturbă și conformația adecvată a Upc2 pentru o activitate transcripțională completă. Aceste observații, împreună cu experimentele de legare a ligandului și de localizare celulară, sugerează că legarea sterolului nu numai că reglează localizarea proteinei, ci și activitatea transcripțională a Upc2. Pentru a confirma faptul că Upc2 este implicat în reglarea nivelului de ergosterol din celule, am cuantificat conținutul total de ergosterol al celulelor de drojdie care conțin alele UPC2 de tip sălbatic sau mutant (Fig. 7b). Deoarece Upc2 activează expresia genelor de biosinteză a ergosterolului, este de presupus că nivelul de sterol din celulele de drojdie se corelează indirect cu activitatea transcripțională a Upc2. În absența genelor UPC2 și ECM22, nivelurile de sterol ale celulelor de drojdie au fost slab detectabile, iar adăugarea a 4 μg ml-1 de fluconazol a inhibat sever creșterea celulelor de drojdie. Upc2 de tip sălbatic a prezentat un nivel de ergosterol în celulă similar cu cel al celulelor L703F și L820W în absența fluconazolului. Tratamentul cu fluconazol a suprimat nivelul de ergosterol cu aproximativ 40% în cazul tulpinilor de tip sălbatic, L793F și L820W. Ștergerea celor 35 de reziduuri C-terminale (ΔCT) a dus la un nivel ușor mai ridicat de ergosterol decât în celulele de tip sălbatic. Cu toate acestea, fluconazolul a suprimat mai semnificativ nivelul de sterol al celulelor mutante ΔCT și M610R decât cel al celulelor de tip sălbatic. Upc2 lipsit de LBD a prezentat un anumit nivel bazal de sinteză a sterolului în absența fluconazolului. Cu toate acestea, prezența a 4 μg ml-1 de fluconazol a inhibat semnificativ nivelul de sterol și creșterea celulelor. Celulele care exprimă mutantul G888D au niveluri de ergosterol de trei ori mai mari în comparație cu celulele care exprimă Upc2 de tip sălbatic. Nivelurile de ergosterol au fost mai mari în celulele mutante G888D tratate cu fluconazol în comparație cu cele găsite în celulele de tip sălbatic crescute fără fluconazol. Aceste date sugerează că mutația G888D activează constitutiv Upc2 pentru biosinteza ergosterolului, ceea ce duce la o rezistență crescută la antifungicele azolice. Pentru a confirma faptul că Upc2 este implicat în reglarea expresiei genice a enzimelor de biosinteză a ergosterolului, am efectuat o analiză cantitativă a expresiei genice a ERG11 prin PCR în timp real folosind tulpinile upc2/ecm22-knockout cu alele UPC2 de tip sălbatic și mutant. Am măsurat nivelurile de ARNm ale genelor ERG11 care au fost normalizate cu gena TAF10 ca un control intern33. Datele indică faptul că nivelurile de expresie a ARNm ale ERG11 se corelează cu activitățile promotorului ERG2 și cu nivelurile de ergosterol, așa cum era de așteptat (Fig. Suplimentară 3).

(a) Activitatea transcripțională a Upc2. Reporterii ERG2-lacZ au fost utilizați pentru a determina contribuția fiecărei construcții Upc2 la reglarea promotorului ERG2. S-au efectuat teste de β-Galactosidază pe fiecare transformant după ce culturi de 5 ml au fost cultivate timp de 16 h fie în mediu minimal (neindus), fie în mediu minimal care conține 4 μg ml-1 de fluconazol (indus). Valorile testelor reprezintă media a trei experimente independente. Toate barele de eroare indică s.d. Valorile P au fost evaluate prin testul t al lui Student cu două cozi. *P<0,05 față de tipul sălbatic, #P<0,05 față de fiecare mutant fără fluconazol. (b) Cuantificarea ergosterolului total în celulele de drojdie. Tulpinile de drojdie upc2Δ ecm22Δ care conțin diferite alele UPC2 au fost analizate pentru conținutul lor de ergosterol. Fiecare punct de date reprezintă media a trei măsurători. Toate barele de eroare indică s.d. Valorile P au fost evaluate prin testul t al lui Student cu două cozi. *P<0,05 față de tipul sălbatic, #P<0,05 față de tipul sălbatic tratat cu fluconazol. (c) Susceptibilitățile la fluconazol ale tulpinilor de drojdie care exprimă alela UPC2 de tip sălbatic sau mutant. Tulpinile au fost cultivate inițial fără fluconazol, iar seriile de diluții au fost aplicate pe plăci de agar conținând fluconazol și incubate timp de 36 de ore.

Activarea lui Upc2 conferă rezistență la agenți antifungici

Pentru a investiga relația dintre activarea lui Upc2 și rezistența la agenți antifungici, am verificat sensibilitatea la fluconazol a tulpinilor upc2Δ ecm22Δ sau ecm22Δ care exprimă alelele UPC2 de tip sălbatic sau mutant (Fig. 7c). Deoarece fluconazolul interferează cu creșterea celulelor de drojdie prin inhibarea biosintezei ergosterolului, modelele generale ale creșterilor celulare au prezentat o corelație cu nivelurile de sterol ale celulelor tratate cu fluconazol. Celulele dublu knock-out upc2Δ ecm22Δ nu au crescut în prezența fluconazolului. Introducerea UPC2 de tip sălbatic a permis o creștere slabă a celulelor la 8 μg ml-1 de fluconazol. Celulele de drojdie care exprimă un mutant G888D au prezentat o creștere semnificativă a rezistenței la fluconazol la 8 μg ml-1. Cu toate acestea, mutantul G888D a crescut mai slab decât tipul sălbatic în absența fluconazolului, sugerând că activarea constitutivă completă a Upc2 este dezavantajoasă în condiții neselective prin impunerea unei sarcini metabolice34. Mutantul ΔLBD lipsit de activitate de transcripție nu a crescut la cea mai mică concentrație de fluconazol. Mutanții L820W, L703F, M610R și ΔCT care interferează cu legarea sterolilor au fost mai sensibili la fluconazol decât tipul sălbatic. O singură tulpină upc2Δ-knockout care adăpostește alela ECM22 a permis o creștere slabă la o concentrație scăzută de fluconazol, sugerând că ECM22 are un rol parțial suprapus în activarea genelor implicate în rezistența la azoli. Cu toate acestea, la concentrații de fluconazol mai mari de 6 μg ml-1, tulpinile upc2Δ și upc2Δ ecm22Δ nu au prezentat diferențe semnificative în ceea ce privește susceptibilitatea tuturor construcțiilor Upc2, ceea ce sugerează că Upc2 joacă un rol dominant în reglarea sterolului. Acest lucru este în concordanță cu observațiile anterioare conform cărora deleția UPC2 are ca rezultat sensibilitatea la ketoconazol, în timp ce nu s-a observat niciun efect în cazul deleției ECM22, ceea ce sugerează că Ecm22 și Upc2 au ținte specifice cu unele funcții esențiale care se suprapun35,36.

Upc2 este o nouă clasă de TF cu degete de zinc

Studii recente au propus că mai mulți membri ai familiei de regulatori de transcripție din clusterul de zinc fungic ar putea reprezenta analogii funcționali ai NR-urilor metazoare13,18,19,20.

În timp ce TF-urile fungice cu cluster de zinc nu au nicio asemănare aparentă de secvență sau structurală cu NR-urile metazoare, Upc2 prezintă asemănări conceptuale cu NR-urile steroidiene în ceea ce privește arhitecturile generale ale domeniilor, legarea ligandului de sterol, homodimerizarea, reglarea transcripțională dependentă de ligand și translocarea nucleară.

Upc2 și NR-urile metazoare conțin ambele domenii de legare la ADN cu deget de zinc în regiunile lor N-terminale. Degetele de zinc care coordonează doi ioni de zinc sunt compuse din șase cisteine pentru Upc2 și patru cisteine în fiecare dintre cele două degete pentru NRs37. Domeniile de legare la ADN ale NRs și ale TF-urilor cu grup de zinc sunt similare din punct de vedere structural și se leagă de ADN sub formă de homo- sau heterodimeri13. TF-urile cu degete de zinc au un domeniu de reglare negativă C-terminal, care, pentru un număr de membri ai familiei, mediază legarea ligandului sau răspunsul la molecule mici, cum ar fi metaboliții celulari și liganzii lipofili13. Activitatea transcripțională a Upc2 este reglată de ergosterol, care este similar din punct de vedere funcțional cu NR-urile steroidiene de tip I în ceea ce privește specificitatea ligandului. Atât Upc2, cât și receptorii de steroizi formează homodimeri. Upc2 formează homodimeri constitutivi indiferent de legarea ligandului. S-a raportat că receptorul de estrogen α există ca dimer chiar și în stare apo, iar legarea ligandului stabilizează și mai mult homodimerul38.

Compararea structurală a Upc2 cu NR steroizi de mamifere arată că Upc2 are un pliu α-helicoidal distinctiv al LBD față de NR de mamifere (Fig. suplimentară 4). Ambele regulatoare genice sunt compuse în principal din aproximativ 12 structuri α-helicoidale cu dimensiuni similare ale LBD-urilor. LBD-urile lui Upc2, ale receptorilor de estrogen și progesteron formează dimeri prin interacțiuni de tip helix bundle. Cu toate acestea, cu excepția configurației generale a dimerilor cu situsuri de legare a ligandului situate îndeaproape la interfața dimerului, nu există o omologie structurală clară între Upc2 și NRs. La legarea ligandului, receptorii de steroizi se disociază de proteina de șoc termic Hsp90 în citosol și se translocă în nucleu, legându-se de promotorii genelor lor țintă ca homodimeri17. În mod consecvent, translocarea Upc2 din citosol în nucleu este reglată într-o manieră dependentă de ligand.

Cu toate acestea, LBD-ul Upc2 prezintă un pliu structural complet diferit în comparație cu LBD-urile NR-urilor metazoarelor. Lipsa similitudinilor structurale și de secvență ale TF-urilor fungice cu grup de zinc și ale NR-urilor metazoare sugerează că asemănările arhitecturale și funcționale sunt produsul unei evoluții convergente cu o strategie mecanicistă comună. Analiza filogenetică arată că orthologii lui Upc2 sunt identificabili numai în cadrul Saccharomycotina, iar proteinele Upc2/Ecm22 formează o cladă monofilitică care nu este strâns legată de nicio altă proteină Zn2-Cys6 din Saccharomycotina5. Drojdia înmugurită, S. cerevisiae, conține aproximativ 50 de TF Zn2-Cys639. Chiar dacă omologia secvenței Upc2 cu alte tipuri de TF-uri cu degete de zinc este scăzută, acestea adăpostesc o secvență conservată, specifică ciupercilor, în cadrul LBD-urilor C-terminale, care a fost cunoscută anterior sub numele de MHR (middle homology region)40. Regiunea C-terminală, inclusiv MHR, în cazul TF-urilor de zinc conține în mod obișnuit 13-15 α-helice de elemente de structură secundară, ceea ce implică faptul că prezența unui LBD este o caracteristică generală a acestei familii de proteine. În concluzie, Upc2 reprezintă o nouă clasă de TF-uri cu degete de zinc care prezintă o analogie funcțională cu receptorii de steroizi metazoari.

.