Frontiers in Celland Developmental Biology

Background

De basiseenheid van het Golgi-apparaat wordt gewoonlijk beschouwd als een stapel cisternae die sterk gepolariseerd is, met de cis-face ontvangen lading van de ER en de trans-face van de stapel, de TGN, geassocieerd met het sorteren van lading voor post-Golgi export (Boncompain en Perez, 2013). De organisatie van deze mini-stapels in de cel varieert echter tussen verschillende organismen. In planten en ongewervelden zijn individuele Golgi stapels onafhankelijk verspreid over het cytoplasma, terwijl in de meeste gewervelde cellen tijdens de interfase, individuele Golgi stapels zijn samengesmolten in een compacte lintstructuur gelegen in de nabijheid van de MTOC (Wei en Seemann, 2017). De structuur van het Golgi-lint in zoogdiercellen wordt het best onthuld door elektronenmicroscopie (Rambourg en Clermont, 1997); optische microscopie met hoge resolutie met behulp van cis- en trans-markers kan de lintorganisatie ook detecteren (Gosavi et al., 2018). Een belangrijke vraag die in het veld wordt onderzocht is de relevantie van de Golgi lintstructuur en de functionele verschillen van het Golgi lint in vergelijking met “geïsoleerde Golgi mini-stacks” of andere toestanden van Golgi architectuur. Met andere woorden, wat is het evolutionaire voordeel van de meer complexe lintmorfologie van het Golgi-apparaat in gewervelde cellen en welke functies kunnen worden gereguleerd door een overgang naar een niet-ribbon structuur?

Studies van de laatste jaren tonen aan dat Golgi-membranen een platform bieden voor de regulatie van een reeks cellulaire processen, waaronder celpolarisatie (Kupfer et al., 1983), gerichte migratie (Millarte en Farhan, 2012), stress (Sasaki en Yoshida, 2015), DNA-reparatie (Farber-Katz et al., 2014), mitose (Rabouille en Kondylis, 2007), metabolisme (Abdel Rahman et al., 2015), pro-inflammatoire reacties (Chen en Chen, 2018) en autofagie (Yamamoto et al., 2012; Lamb et al., 2013). In zoogdiercellen zijn er nu inderdaad aanzienlijke aanwijzingen dat de Golgi, net als andere intracellulaire organellen, kan fungeren als een celsensor (Farhan en Rabouille, 2011; Mayinger, 2011; Millarte en Farhan, 2012; Sasaki en Yoshida, 2015; Luini en Parashuraman, 2016; Gosavi en Gleeson, 2017; Makhoul et al., 2018). Het wordt ook duidelijk dat de precieze morfologie van de Golgi relevant is voor de regulatie van een aantal van deze celprocessen (Makhoul et al., 2018). De associatie van Golgi morfologie met signalering kwam voort uit een genoom breed kinoom en fosfatoom scherm dat een groot cohort van kinasen en fosfatasen (20% van het totaal in het genoom) identificeerde die de morfologie van de Golgi beïnvloedde (Chia et al., 2012). De veranderingen in Golgi morfologie omvatten ofwel fragmentatie van de Golgi (verlies van Golgi lint) of de vorming van een zeer compacte en gecondenseerde Golgi in de perinucleaire locatie. De relevantie van actine in de regulatie van de Golgi-morfologie werd in deze studie benadrukt door de identificatie van een aantal kinasen, bijvoorbeeld ROCK1 en PAK1, die de actinedynamiek reguleren en de Golgi-structuur moduleren (Chia et al., 2012). Andere genoombrede analyses hebben ook de waarschijnlijkheid benadrukt dat de Golgi een grote verscheidenheid aan signalen kan ontvangen en doorgeven die niet alleen membraantransportroutes kunnen beïnvloeden, maar ook andere processen, apoptose, mitose, autofagie en stressreacties (Farhan et al., 2010; Millarte et al., 2015).

De Golgi-lintstructuur is zeer dynamisch en kan een zeer snelle hermodellering ondergaan tijdens een reeks verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, tijdens mitose de demontage van het Golgi-lint is een vroege gebeurtenis in G2/M overgang en speelt een belangrijke rol als een celcyclus checkpoint in het bevorderen van mitotische entry (Wei en Seemann, 2010; Corda et al., 2012). De regulatie van Golgi dynamiek wordt gemedieerd door interacties tussen moleculaire steigers gelegen op de Golgi membraan en het cytoskelet. MT dynamiek kan de locatie van het Golgi-lint bij het centrosoom en de herpositionering van de Golgi reguleren om gepolariseerde trafficking en gerichte secretie te vergemakkelijken (Millarte en Farhan, 2012; Sanders en Kaverina, 2015). Bovendien kunnen membraancomponenten van de Golgi ook microtubuli kernen en stabiliseren bij zowel de cis- als trans-Golgi, en daarom is de Golgi zelf ook een MTOC (Efimov et al., 2007; Wu et al., 2016). Actine-gemedieerde processen dragen ook bij aan de vorm en functie van de Golgi en ten minste negen Golgi-gelokaliseerde moleculaire scaffolds zijn geïdentificeerd die interageren met het actine cytoskelet . Versterking van actinepolymerisatie bij de Golgi resulteert in verspreiding van het lint, terwijl remming van actinepolymerisatie met specifieke geneesmiddelen zoals latrunculine A resulteert in verdichting van de Golgi (Lazaro-Dieguez et al., 2006; Makhoul et al., 2018, 2019). Gezien deze regulerende netwerken die de Golgi-lintstructuur moduleren, achten wij het zeer aannemelijk dat het evenwicht tussen het Golgi-lint en Golgi-ministapels zowel de kwalitatieve als de kwantitatieve respons van signaalwegen kan bepalen. Het verband tussen Golgi morfologie en signaaltransductie heeft ook belangrijke vertakkingen in het begrijpen van de moleculaire basis van een aantal ziekten die geassocieerd worden met het verlies van het Golgi lint en het verschijnen van een verspreide Golgi. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat de overleving van sommige kankercellen geassocieerd is met een verspreide Golgi die het niveau van apoptose vermindert (Farber-Katz et al., 2014; Petrosyan, 2015).

Wat betekent Golgi-fragmentatie?

De term “Golgi-fragmentatie” wordt algemeen gebruikt om de morfologische status van een verspreide Golgi in zoogdiercellen te beschrijven, zoals gedetecteerd door optische microscopie gekleurd met Golgi-markers. Een verspreide Golgi wordt vaak waargenomen in experimentele systemen, bijvoorbeeld wanneer cellen worden behandeld met geneesmiddelen om het cytoskelet te verstoren, bijvoorbeeld nocodazol (Wei en Seemann, 2010), wanneer membraan flux wordt verstoord, of wanneer componenten van Golgi transport machines, of het cytoskelet interactie systeem, worden neergehaald, uitgeklopt, of overgeëxpresseerd (Zappa et al., 2018). In verschillende fysiologische toestanden, bijvoorbeeld stress (Serebrenik et al., 2018) en pathologische omstandigheden, met name kanker en neurodegeneratie, heeft de Golgi vaak de typische compacte juxtanucleaire locatie verloren en wordt waargenomen door confocale microscopie als verspreide structuren in het hele cytoplasma . Er zijn een toenemend aantal rapporten beschrijven Golgi fragmentatie onder fysiologische en pathologische omstandigheden (Figuur 1A). Echter, een probleem met het gebruik van de term “gefragmenteerd” is dat het impliceert dat de structurele integriteit van de Golgi verloren is gegaan en dat de morfologie in verband met de “gefragmenteerde” structuur vertegenwoordigt een uiteengevallen, abnormale of vernietigd organel. In een aantal gevallen is dit duidelijk misleidend, aangezien de afzonderlijke Golgistapels intact kunnen blijven en de klassieke functies van de organel, namelijk glycosylering en membraantransport, kunnen blijven vervullen. Inderdaad, verspreide Golgi mini-stapels komen voor in sommige gespecialiseerde cellen, zoals gedifferentieerde myoblasten (Lu et al., 2001), gedifferentieerde neuronen die individuele Golgi stapels of “buitenposten” langs dendrieten bevatten (Lasiecka en Winckler, 2011), maag pariëtale cellen (Gunn et al., 2011), en uroepitheliale cellen van de urineblaas (Kreft et al., 2010), zonder schijnbare tekortkomingen in membraantransport en glycosylatie. Integendeel, de verspreiding van het Golgi lint in verband met experimentele en pathologische omstandigheden kan een verschuiving van het dynamisch evenwicht tussen de compacte lint morfologie en de individuele Golgi mini-stapels weerspiegelen of kan resulteren in verstoring van de lint architectuur en de integriteit van de Golgi stapel. Dit is een relevante kwestie omdat de precieze morfologische status van de Golgi zeer waarschijnlijk van invloed zal zijn, in sommige gevallen op de efficiëntie van het transport en de glycosylering (Puthenveedu et al., 2006), en in andere gevallen op een verscheidenheid van signaleringsnetwerken, maar niet noodzakelijkerwijs op het transport of de glycosylering. Het is belangrijk om onderscheid te maken tussen intacte Golgi mini-stacks en verlies van de integriteit van de Golgi stacks bij het definiëren van wat wordt bedoeld met een “gefragmenteerde” Golgi. Hier bespreken we de verschillende Golgi morfologieën die zijn gedetecteerd en gekarakteriseerd in experimentele, fysiologische en pathologische setting.

Rethinking the Terminology of Golgi Morphological States

De structuren van de Golgi-fragmenten verschillen afhankelijk van de aard van de pathway die betrokken is bij het verstoren of moduleren van het Golgi-lint. Het is belangrijk om een betere ultrastructurele karakterisering van de Golgi “fragmenten” na het verlies van het Golgi lint als de functionele uitkomst is waarschijnlijk zeer verschillend, afhankelijk van de precieze Golgi structuren. Afgezien van de voorwaarden die resulteren in een langgerekte Golgi lint, kunnen we identificeren uit de literatuur ten minste 4 verschillende scenario’s in verband met Golgi lint “fragmentatie.” Deze zijn afgebeeld in figuur 2 en als volgt beschreven:

(1) Omzetting van Golgi lint naar Golgi stapels. Hier gaat het verlies (of de vermindering van de lengte) van het Golgi-lint gepaard met verspreide, intacte, Golgi-ministapels. Deze situatie doet zich voor in een aantal celtypes en ook in modelsystemen, zoals de behandeling met nocodazole of de modulatie van de niveaus van TGN golgin GCC88. Membraantransport lijkt onder deze omstandigheden grotendeels onaangetast, met uitzondering van mogelijk grote lading (Ferraro et al., 2014; Lavieu et al., 2014), terwijl mTOR-signalering wordt verminderd en autofagie wordt versterkt (Gosavi et al., 2018).

(2) Verlies van zowel Golgi-lint als integriteit van Golgi-stapels. In dit scenario gaat de lintstructuur verloren en bovendien zijn cisternae van individuele stapels verminderd in lengte en/of aantal en kunnen ze ook geassocieerd zijn met gezwollen compartimenten, bijvoorbeeld de knock-out van GM130 (Liu et al., 2017) en mutaties van COG-subeenheden (Blackburn en Lupashin, 2016). Membraantransport en glycosylering worden waarschijnlijk beïnvloed in dit scenario, samen met verschillende signaleringsnetwerken.

(3) Verspreiding van één Golgi-compartiment. In dit scenario wordt slechts één Golgi-compartiment verstrooid, zoals de verstrooiing van de TGN onlangs gerapporteerde activering van het NLRP3 inflammasoom (Chen en Chen, 2018). De rest van de stapel/ribbon blijft onaangetast. Het identificeren van deze Golgi-structuren vereist het opnemen van EM- en optische microscopie en een aantal Golgi-markers over de stapel om de precieze veranderingen in Golgi-morfologie te definiëren.

(4) Conversie van Golgi-lint naar tubulovesiculaire elementen. In dit scenario worden zowel het Golgi-lint als de stapels uitgebreid verstoord met een dramatische toename van tubulovesiculaire structuren, zoals in het geval tijdens mitose (Wei en Seemann, 2017), verschillende geneesmiddelen en behandeling van cellen met amyloïde β (Joshi et al., 2014). Hier zou men een impact verwachten op veel van de functies van de Golgi.

Wij concluderen niet dat figuur 2 de enige morfologieën van Golgi “fragmenten” vertegenwoordigt en het is mogelijk dat aanvullende scenario’s zullen worden geïdentificeerd naarmate de structuren van Golgi “fragmenten” uitgebreider worden onderzocht.

Voorbeelden van een relatie tussen Golgi morfologie en celproces

De coördinatie van veranderingen in Golgi morfologie en verschillende celprocessen heeft veel aandacht gekregen. Voor een meer gedetailleerd overzicht van de achtergrondinformatie van de processen die beïnvloed worden door de veranderingen in Golgi-morfologie, zoals trafficking, glycosylatie, stress, DNA-reparatie, wordt de lezer verwezen naar een aantal recente reviews (Farhan en Rabouille, 2011; Millarte en Farhan, 2012; Sasaki en Yoshida, 2015; Gosavi en Gleeson, 2017; Makhoul et al., 2019). Hieronder volgen enkele voorbeelden om het bereik van celprocessen te benadrukken die worden gereguleerd of gecoördineerd door verschillende morfologische toestanden van de Golgi. In een aantal andere gevallen, zoals sommige kankers en stressresponsen, is het Golgi-lint verspreid als fragmenten, echter, de morfologie van deze Golgi-fragmenten is niet goed gekarakteriseerd. De bespreking hierin zal worden gericht op de voorbeelden waar de Golgi-morfologie goed is gedefinieerd.

DNA Repair and Cancer

Er is een intieme associatie tussen Golgi-morfologie en de DNA-schaderespons (Farber-Katz et al., 2014). De Golgi-membraanbinder, GOLPH3, is een oncogen en overexpressie van GOLPH3 resulteert in verbeterde celoverleving na DNA-schade (Scott et al., 2009; Farber-Katz et al., 2014). Omgekeerd, verlies van GOLPH3 voorkomt de dispersie van het Golgi-lint, versterkt het Golgi-lint en bevordert apoptose na DNA-schade. De DNA-schaderespons wordt gemedieerd door het kinase DNA-PK, dat GOLPH3 fosforyleert en Golgi-“fragmentatie” bevordert door actinepolymerisatie bij Golgi-membranen te versterken (Dippold et al., 2009). mTOR wordt gemoduleerd door de veranderingen in Golgi-morfologie gemedieerd door GOLPH3 (Scott et al., 2009) en draagt waarschijnlijk bij aan de uitkomst van de DNA-reactie. De precieze Golgi-structuur is dus verbonden met celoverleving en apoptose. De identiteit van de Golgi-structuren na de dispersie van het Golgi-lint door fosfo-GOLPH3 moet nog gekarakteriseerd worden. Toekomstige studies die de relatie tussen Golgi fragmentatie en mTOR signalisatie in kankercellen onderzoeken, zullen duidelijk de moeite waard zijn.

Genetische Aandoeningen Geassocieerd Met Veranderde Golgi Morfologie

Vele ziekten zijn geïdentificeerd met monogene aandoeningen veroorzaakt door overgeërfde mutaties van ofwel componenten geassocieerd met transport machines of van de enzymen die in de Golgi verblijven. Veel van deze ziekten zijn geassocieerd met fragmentatie van het Golgi-lint, bijvoorbeeld defecten in het geconserveerde oligomere Golgi-complex (COG) in aangeboren aandoeningen van de glycosylering (Miller en Ungar, 2012). In veel gevallen zijn de aandoeningen geassocieerd met pathologieën die beperkt zijn tot een beperkt aantal organen of weefsels. De basis voor weefselspecificiteit is slecht begrepen, maar waarschijnlijk te wijten aan tekortkomingen in glycosylatie en secretie en ook veranderingen in signaleringsnetwerken geassocieerd met het verlies van het Golgi-lint, zoals Golgi-stressreacties. De Golgi in alle COG subeenheid knock-out cellijnen vertonen matige tot ernstige veranderingen in morfologie zoals gekarakteriseerd door EM, geassocieerd met verlies van het lint, verwijde cisternae en in sommige gevallen verstoring van de mini-stacks. De toepassing van EM was fundamenteel bij het definiëren van de morfologische veranderingen (Blackburn en Lupashin, 2016).

Neurodegeneratieve Ziekten

De status van de Golgi in neurodegeneratieve ziekten heeft onlangs veel aandacht gekregen (figuur 1B). Verlies van het Golgi-lint is een gemeenschappelijk kenmerk van veel neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Huntington, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Parkinson (Gonatas et al., 2006; Haase en Rabouille, 2015; Rabouille en Haase, 2015; Sundaramoorthy et al., 2015). Het is zeer waarschijnlijk dat de verstoringen in de Golgi-architectuur bij deze ziekten bijdragen aan de pathologische processen. In de meeste gevallen is de precieze morfologische structuur van de Golgifragmenten in deze neurodegeneratieve ziekten niet gedefinieerd. Echter, twee experimentele systemen hebben onlangs onderzocht veranderingen in Golgi structuur en neuronale degeneratie in een aantal details. Ten eerste werd voorwaardelijke knock-out van GM130, een structurele golgin die het Golgi-lint reguleert, in het centrale zenuwstelsel aangetoond dat Golgi fragmentatie, atrofie van dendrieten en neuronale degeneratie in muizen veroorzaakt (Liu et al., 2017). EM analyse van de GM130 KO Purkinje cellen toonde een vermindering van de Golgi cisternal lengte en stapeling en bovendien waren de typische Golgi dendriet voorposten afwezig in deze GM130 -/- Purkinje cellen (Liu et al., 2017). In een tweede studie, hippocampale neuronen van muizen transgeen voor de Zweedse mutatie van amyloïde precursor eiwit (APP) en een mutant preseniline 1 subeenheid van γ-secretase, waar beide mutaties worden geassocieerd met de ziekte van Alzheimer op jonge leeftijd, onthulde uitgebreide Golgi fragmentatie door optische microscopie (Joshi et al., 2014). Kwantitatieve EM van neuronen in deze muizen toonde een vermindering van het aantal en de lengte van de cisternae in de stapels in vergelijking met neuronen van wild-type muizen. Bovendien waren de cisternae gezwollen. De veranderingen in Golgi morfologie in deze primaire neuronen werd aangetoond direct geassocieerd te zijn met het verhoogde niveau van amyloid-β productie. Primaire neuronen behandeld met synthetisch amyloid-β toonden ook een vergelijkbare fragmentatie van de Golgi en een toename van tubulovesiculaire structuren geassocieerd met Golgi cisternae in vergelijking met onbehandelde cellen. Het verlies van het Golgi-lint was te wijten aan de fosforylering van GRASP65, een Golgi-structuur-eiwit dat een sleutelrol speelt in de ontmanteling van het Golgi-lint en de stapels in mitose (Joshi et al., 2014). Vergelijking van deze twee studies hierboven is informatief, omdat de routes die de veranderingen in Golgi-morfologie bemiddelen in elk geval verschillen, wat leidt tot verschillen in de morfologie van de Golgi-“fragmenten”. Overwogen moet worden hoe deze verschillende paden die Golgi morfologie beïnvloeden de downstream reacties beïnvloeden.

mTOR Signaling

Ons lab heeft een experimentele benadering vastgesteld om het evenwicht tussen het Golgi-lint en Golgi mini-stapels te verstoren door het moduleren van de dosis van GCC88, een golgin gelegen aan de TGN. Deze strategie maakte het mogelijk een stabiele cellijn, HeLa-B6, tot stand te brengen die geen Golgi lint heeft. We hebben aangetoond dat GCC88 het evenwicht tussen Golgi-linten en mini-stapels reguleert door een actine-afhankelijk proces (Makhoul et al., 2019) en intersectin-1 (ITSN1) geïdentificeerd, een guanine nucleotide-uitwisselingsfactor voor cdc42 (Hussain et al., 2001), als een interactor van GCC88 die verantwoordelijk is voor het verlies van het Golgi-lint (Makhoul et al., 2019). Analyses van HeLa B6-cellen, die een Golgi-lint missen, toonden een verminderde mTOR-activiteit aan en een bijbehorende toename van autofagosomenbiogenese (Gosavi et al., 2018). mTOR is een van de belangrijkste signaalwegen van eukaryote cellen en staat bekend als een negatieve regulator van autofagie (Wullschleger et al., 2006). Vandaar dat het evenwicht van Golgi stapels naar Golgi lint een direct effect heeft op de mTORC1 pathway. Het gebruik van cis- en trans-compartiment specifieke markers, en EM tomografie, was van cruciaal belang bij het onthullen van de morfologische veranderingen in de Golgi ribbon.

Inflammation

Inflammasomes van het aangeboren immuunsysteem fungeren als een steiger voor caspase 1-afhankelijke activering van pro-inflammatoire cytokines (Broz en Dixit, 2016). Het NLRP3 (nucleotide-bindend domein, leucine-rijke-bevattende familie, pyrine-domein-bevattende-3) is een veelzijdig inflammasoom dat geactiveerd kan worden door een reeks microbiële en niet-microbiële stimuli wat resulteert in secretie van pro-inflammatoire cytokines interleukine 1β (IL-1β) en interleukine 18 (IL-18) en geprogrammeerde celdood door pyroptose. Een recente studie heeft aangetoond dat de activering van het cytosolische NLRP3 door stimuli gepaard gaat met rekrutering van NLRP3 naar verspreide TGN membranen om NLRP3 scaffold assemblage te vergemakkelijken (Chen en Chen, 2018). De verspreide TGN, maar niet de onderliggende andere compartimenten, rekruteert specifiek NLRP3, via PI4P, om het downstream adaptorcomplex ASC te assembleren dat polymerisatie ondergaat in de peri-nucleaire regio voordat caspase-1 wordt gerekruteerd om de downstream signaalroute te activeren (Chen en Chen, 2018). Deze belangrijke bevinding toont dus aan dat de modulatie van de architectuur van de TGN selectief, cruciaal is in de activering van deze signaalweg. Het gebruik van compartimentspecifieke markers (TGN en cis-Golgi) samen met optische en EM-analyse was van cruciaal belang bij het onthullen van de morfologische veranderingen in het Golgi-lint.

Conclusieve opmerkingen

De precieze architectuur van de Golgi-morfologie wordt bepaald door de hoge resolutie optische microscopie en door EM. Het opnemen van deze informatie in toekomstige studies in het veld zal een aanzienlijk inzicht geven in de dynamiek van de Golgi, de routes voor verstoring van de lintstructuur en de functionele gevolgen geassocieerd met deze verschillende routes.

Samenvattend stellen wij voor dat het gebruik van de term “gefragmenteerde Golgi” ontoereikend is om Golgi-structuren geassocieerd met vele behandelingen en aandoeningen te beschrijven en dat de verschillen in deze Golgi-structuren waarschijnlijk fysiologisch relevant zullen zijn. Gezien de dynamische aard van het Golgi-apparaat, is het mogelijk dat er een evenwicht is tussen verschillende morfologische toestanden van de Golgi op een gegeven moment, dat wil zeggen, mini-stapels en lintstructuren. Inzicht in het dynamische evenwicht tussen de verschillende Golgi-morfologieën in moleculair detail is van cruciaal belang voor een volledige beoordeling van dit organel tijdens normale celprocessen en ook onder pathologische omstandigheden. Het zal fascinerend zijn om te zien wat zich ontvouwt als we meer leren over de cel sensing functies van deze complexe organel en de relatie tussen deze functies en Golgi structuren.

Data Beschikbaarheid

Alle datasets geanalyseerd voor deze studie zijn opgenomen in het manuscript en de aanvullende bestanden.

Author Contributions

Alle vermelde auteurs hebben een substantiële, directe en intellectuele bijdrage geleverd aan het werk, en goedgekeurd voor publicatie.

Funding

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Australian Research Council (DP160102394).

Conflict of Interest Statement

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Afkortingen

GM130, cis-Golgi matrix proteïne; GMAP210, Golgi microtubule associated protein; GOLPH3, Golgi phosphoprotein 3; GRASP, Golgi reassembly stacking protein; MTOC, microtubule organizing center; mTOR, mechanistic target of rapamycin; PI4P, phosphatidylinositol-4-phosphate; TGN, trans-Golgi network.