Meccanismo strutturale della regolazione dell’ergosterolo da parte del fattore di trascrizione dello sterolo fungino Upc2

Upc2 è un recettore specifico per l’ergosterolo

Upc2 ed Ecm22 condividono un alto livello di somiglianza di sequenza nei domini N-terminali di legame al DNA caratterizzati da un motivo conservato Zn(II)2-Cys6 zinc finger21. La regione conservata C-terminale di circa 300 residui di aminoacidi contiene un dominio di attivazione della trascrizione (Fig. 1a). Poiché l’attività trascrizionale di Upc2 dipende dai livelli di ergosterolo nella cellula, abbiamo ipotizzato che il CTD può servire come un LBD per ergosterolo e regolare l’attività trascrizionale di Upc2. Il deidroergosterolo (DHE) è uno sterolo naturale con proprietà intrinseche di fluorescenza, che si trova in basse quantità in S. cerevisiae22,23. Il DHE è molto simile all’ergosterolo nelle proprietà strutturali e chimiche con una sola differenza di doppio legame e può sostituire l’ergosterolo nel lievito senza alcuna interferenza funzionale24. Per verificare se Upc2 si lega direttamente agli steroli del lievito, abbiamo eseguito il test di legame fluorescente DHE utilizzando CTD purificato di Upc2 ricombinante (residui 598-913). I residui di triptofano di Upc2 sono stati eccitati a 285 nm e lo spettro di fluorescenza del DHE è stato monitorato. L’analisi spettrale ha rivelato che il quenching del triptofano a 340 nm era concomitante con la comparsa di tre picchi di emissione a 354, 373 e 393 nm (Fig. 1b). Questi picchi sono caratteristici di DHE, che suggerisce il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza (FRET) da Upc2 LBD a DHE legato25,26. Upc2 LBD lega DHE libero con affinità nanomolare come misurato da esperimenti di equilibrio-binding (Fig. 1b). Upc2 LBD estrae e lega anche DHE incorporato nel DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina) liposomi come monitorato dall’aumento di emissione di fluorescenza a 375 nm quando Upc2 LBD è stato aggiunto a DOPC: DHE liposomi (Fig. 1c,d). Quando l’ergosterolo non fluorescente è stato aggiunto alla miscela contenente Upc2 legato a DHE, l’emissione di fluorescenza è diminuita indicando che l’ergosterolo compete con DHE per il legame a Upc2. Tuttavia, l’aggiunta di colesterolo non ha influenzato il legame del DHE, indicando che Upc2 non lega il colesterolo. Altri steroli come il 20-idrossicolesterolo, il 25-idrossicolesterolo, l’idrocortisone e il β-estradiolo non competono con il DHE suggerendo che Upc2 LBD è un recettore specifico per gli steroli fungini come l’ergosterolo e il DHE (Fig. 1e). Inoltre, per esaminare le proprietà di estrazione di DHE ed ergosterolo di Upc2 dai liposomi con una composizione lipidica fisiologica delle membrane plasmatiche del lievito27, abbiamo monitorato l’estrazione di DHE dai liposomi con fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina/fosfatidilinositolo/fosfatidilserina/DHE (40:40:10:8:2, mol %) e il legame competitivo dell’ergosterolo con la successiva aggiunta dei liposomi con fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina/fosfatidilinositolo/fosfatidilserina/ergosterolo (25:25:10:10:30, mol %) a 6.5 μM e 23 nM di liposomi e proteine, rispettivamente (Fig. 1 supplementare). Upc2 lega DHE ed ergosterolo in modo simile a quello dei liposomi DOPC/DHE. Ecm22, l’omologo stretto di Upc2, si lega anche al DHE libero nello stesso modo di Upc2 (Fig. 1f).

(a) Presentazione schematica delle strutture di dominio di Upc2 e Ecm22 in S. cerevisia (S.c.) e C. albicans (C.a.). (b) Curve di legame di DHE per Upc2 LBD wild-type e il mutante di troncamento C-terminale di Upc2 LBD (Δ878-913). Le intensità di emissione di fluorescenza a 375 nm dei campioni (λex=285 nm) sono state tracciate con quantità crescenti di concentrazioni di DHE. Ogni punto di dati mostrato è la media di tre misurazioni con le barre di errore che rappresentano la s.d. Le curve di adattamento ai punti di dati sono state calcolate sulla base del modello di legame a un sito. Una serie di spettri di emissione di fluorescenza per Upc2 LBD wild-type è stata mostrata nel pannello di destra. Cinque residui di triptofano che si trovano entro 15 Å dalla tasca di legame sono stati indicati da sfere rosse sul pannello di destra. (c) Misura in tempo reale di estrazione DHE da Upc2 LBD da grandi liposomi DOPC. I liposomi contenevano 124 μM totali di fosfatidilcolina e DHE in un rapporto molare 98:2. Upc2 LBD è stato aggiunto ai liposomi con una concentrazione finale di 0,73 μM all’inizio della misurazione cinetica. L’ergosterolo non fluorescente o il colesterolo è stato aggiunto alla concentrazione finale di 2.5 μM a 40 min per il legame competitivo con DHE. (d) Spettri di emissione in fluorescenza (λex=285 nm) dei campioni durante e alla fine della cinetica sono mostrati per c. (e) Spettri di emissione in fluorescenza (λex=285 nm) di vari steroli per il legame competitivo a DHE. Il 0,6 μM di Upc2 LBD è stato caricato con 2,5 μM di DHE libero. Tre linee diverse in ogni esperimento rappresentano diverse concentrazioni di ligandi concorrenti (25-idrossicolesterolo, 20-idrossicolesterolo, idrocortisone e β-estradiolo) con 2,5, 4 e 10 μM rispettivamente. Il β-estradiolo è un composto naturalmente fluorescente. L’asterisco indica l’emissione intrinseca di fluorescenza del β-estradiolo a 310 nm (λex=285 nm). (f) Spettri di emissione di fluorescenza di Ecm22 LBD sul legame DHE.

Per confrontare i ligandi sterolici identificati dagli esperimenti in vitro con il ligando naturale catturato da Upc2 dal lisato di cellule di lievito, abbiamo caratterizzato il ligando estratto da Upc2 usando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in fase inversa e analisi di cromatografia liquida-spettroscopia di massa (Fig. 2). Il ligando catturato era esclusivamente ergosterolo senza specie rilevabili di altri lipidi. Date le somiglianze nelle proprietà strutturali e chimiche tra l’ergosterolo e il DHE, e che l’ergosterolo è molto più abbondante del DHE nelle cellule di lievito, abbiamo concluso che l’ergosterolo è un ligando fisiologico per Upc2.

(a) Profilo di eluizione HPLC in fase inversa di ergosterolo puro standard (Sigma 45480) e il ligando estratto da Upc2 LBD. (b) Analisi di spettroscopia di massa di ergosterolo standard e il ligando estratto da Upc2 LBD. Identificazione del ligando catturato da Upc2 è stato raggiunto dal confronto delle proprietà cromatografiche e spettroscopia di massa con lo standard di riferimento e dati di letteratura56. AMU, unità di massa atomica; UV, ultravioletto.

Upc2 LBD mostra una nuova piega α-elica

Per esaminare la struttura del C-terminale LBD di Upc2, abbiamo eseguito gli studi cristallografici su vari costrutti C-terminale. I cristalli di apo Upc2 LBD e di Upc2 LBD legato all’ergosterolo sono stati cristallizzati ma non si sono diffratti alla radiazione di sincrotrone. Per migliorare la qualità di diffrazione dei cristalli di Upc2 LBD, abbiamo ingegnerizzato una proteina di fusione (Upc2 LBD-T4L) in cui il lisozima T4 sostituisce il ciclo variabile (residui 715-725) in Upc2 (rif. 28). La proteina di fusione Upc2-T4L è stata espressa in modo stabile e ha mostrato buone proprietà di legame al DHE (Fig. 3a), il che suggerisce che la fusione di lisozima T4 non interferisce con il legame del ligando e il ripiegamento della proteina. La struttura della LBD C-terminale di apo Upc2 (residui 598-878)-T4L priva dei 35 residui C-terminali è stata determinata alla risoluzione di 2,9 Å con il metodo della dispersione anomala singola usando cristalli marcati con selenometionina. La struttura finale contenente due molecole di Upc2-T4L e 29 molecole d’acqua nell’unità asimmetrica è stata raffinata con un fattore R del 24,9% (Tabella 1).

(a) Spettri di emissione in fluorescenza del costrutto di fusione Upc2 LBD-T4L (residui 598-913) sul legame DHE. (b) Struttura complessiva di Upc2 LBD. La struttura è stata colorata dal rosso al blu in base alla successione della struttura secondaria. Il lisozima T4 fuso nel loop α5-α6 non è stato mostrato per chiarezza. (c) Struttura complessiva del dimero Upc2 LBD-T4L con rappresentazione cilindrica. La posizione della tasca idrofobica profonda in uno dei protomeri Upc2 è indicata da un cerchio nero. (d) Rappresentazione della superficie di Upc2 LBD monomero. I residui che compongono la parete della tasca idrofobica sono mostrati in bastoncini. La tasca idrofobica è mostrata in rappresentazione superficiale grigia. Conc., concentrazione; C-term, C-terminale; N-term, N-terminale.

La struttura di apo Upc2 LBD mostra una piega globulare α-elica con una forma ovale (Fig. 3b). La LBD di Upc2 è composta da 11 α-eliche e anelli di collegamento. C’è un piccolo predetto α-elica (α12, residui 889-896) nella regione C-terminale loop che non è stato incluso nel costrutto cristallizzato. Le 11 α-eliche sono disposte a formare un morsetto chiuso che crea una tasca profonda nel nucleo della proteina. I primi tre α-eliche compongono le dita N-terminali e le eliche α8-α9, α7 e α11 compongono le altre dita del morsetto. Le quattro eliche α3-α6 compongono il palmo centrale come un fascio elicoidale. Le anse α7-α8 (residui 760-799) circondano le eliche α8-α9 come una spirale casuale più lunga nella struttura. Il lisozima T4 che sostituisce nove residui nell’ansa α5-α6 è strettamente situato sulla superficie di Upc2 LBD (Fig. 3c).

La struttura di Upc2 LBD rivela una tasca idrofobica centrale circondata da eliche α (Fig. 3d). La profonda tasca idrofobica ha un volume di 287 Å3. Le eliche α5 e α6 compongono il fondo della tasca e le eliche α1-α2, α7, α9 e α11 compongono la parete della tasca idrofoba di legame. La tasca è accessibile a un solvente con un piccolo poro sulla superficie. La presenza di una tasca idrofoba ci ha suggerito che può servire come sito di legame per piccole molecole lipofile. Il confronto strutturale di Upc2 con strutture note nel PDB usando il server DALI non ha trovato strutture correlate con punteggi Z >7 suggerendo che la LBD di Upc2 rappresenta una nuova piega di una LBD.

Upc2 LBD forma un omodimero costitutivo

L’analisi della cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) ha dimostrato che il ricombinante Upc2 LBD o Upc2 LBD-T4L è un dimero omogeneo senza una specie monomerica rilevabile, suggerendo che Upc2 è una forma biologicamente rilevante. Il dimero di Upc2 LBD contiene due siti di legame agli steroli e il legame al ligando non ha influenzato lo stato oligomerico di Upc2 come analizzato da SEC (Fig. 4a). C’erano due molecole di Upc2 LBD-T4L collegate da un asse non cristallografico a due pieghe nell’unità asimmetrica dei cristalli. Upc2 LBD dimerizza con le eliche α1 e α2 formando un fascio di quattro eliche nell’interfaccia del dimero (Fig. 4b). I termini N del dimero Upc2 LBD sono esposti allo stesso lato vicino al centro dell’interfaccia del dimero. L’interfaccia del dimero è composta principalmente da residui idrofobici che seppelliscono 1.562 Å2 di superficie all’interfaccia (Fig. 4c). Il Met610 si trova al centro dell’interfaccia del dimero. M610R mutante è un monomero in soluzione analizzato da SEC suggerendo che il dimero osservato nella struttura di cristallo è coerente con quello osservato in soluzione (Fig. 4a). Le LBD di C. albicans Upc2 e S. cerevisiae Ecm22 sono anche dimeri in soluzione e la mutazione M506R di C. albicans Upc2 ha portato alla monomerizzazione della LBD. La conservazione dei residui che compongono l’interfaccia del dimero negli omologhi di Upc2 suggerisce che l’omodimerizzazione delle LBD è una caratteristica generale di queste proteine (Fig. 2 supplementare).

(a) Profili di SEC per LBDs di S. cerevisiae (S.c.) Upc2, C. albicans (C.a.) Upc2 e S. cerevisiae Ecm22. Profili di wild type e i mutanti di interfaccia dimer (M610R in S. cerevisiae Upc2 e L506R in C. albicans Upc2) sono mostrati in blu e verde, rispettivamente. I profili di ergosterolo-bound Upc2 e Ecm22 LBDs sono mostrati in linee rosse. Ergosterolo legato LBDs sono stati preparati mescolando LBDs purificati e ergosterolo in un rapporto molare 1:5 e la miscela è stata incubata durante la notte prima di analisi SEC. (b) Vista laterale del dimero Upc2 LBD. (c) Vista dettagliata dell’interfaccia del dimero Upc2. Un protomero è mostrato in colore arcobaleno e l’altro in bianco.

L’anello C-terminale è essenziale per il legame del ligando

La maggior parte delle mutazioni di attivazione costitutiva in S. cerevisiae Upc2 e C. albicans Upc2 sono raggruppate nell’anello C-terminale tra l’elica α11 e l’elica α12 prevista21,29. La struttura cristallina non include questo anello di attivazione C-terminale di 35 residui. Per esaminare l’importanza funzionale di questo anello C-terminale, abbiamo eseguito i saggi di legame al ligando sui mutanti di delezione C-terminale di Upc2 LBD (Fig. 5a). La troncatura dei 14 residui C-terminali (Δ900-913) non ha influenzato il legame con il ligando. Tuttavia, la delezione del C-terminale 35 residui (Δ879-913), compreso il predetto α12, ha abolito il legame DHE, suggerendo che l’anello C-terminale ricco di glicina e l’elica α12 sono essenziali per il legame del ligando (Fig. 5b). Inoltre, G888D, una mutazione di attivazione costitutiva nell’ansa α11-α12 ha inibito significativamente il legame di DHE.

(a) Spettri di emissione in fluorescenza di vari mutanti sul legame DHE. Gli spettri di emissione a diversi punti temporali sono stati mostrati in diversi colori. (b) Rappresentazione a nastro della tasca idrofobica. La tasca idrofobica è mostrata in rappresentazione superficiale grigia. La traccia speculativa del loop di attivazione C-terminale che non è stato incluso nel costrutto cristallizzato è mostrato in punti rossi.

La struttura cristallina di Upc2 LBD mostra una profonda tasca idrofobica che potrebbe ospitare una singola molecola di sterolo. Tuttavia, la dimensione della tasca di legame in apo Upc2 LBD che manca dell’anello di attivazione C-terminale è leggermente più piccola delle dimensioni dell’ergosterolo, il che implica che Upc2 LBD deve subire un cambiamento conformazionale sul legame del ligando. Per identificare i determinanti strutturali per il legame dello sterolo di Upc2, abbiamo cercato di co-cristallizzare Upc2 LBD con l’ergosterolo. Tuttavia, a causa della scarsa diffrazione dei cristalli di Upc2 legati allo sterolo, la determinazione strutturale del complesso ligando non è stata possibile. In alternativa, abbiamo testato l’effetto di diverse mutazioni nella tasca idrofobica sul legame dello sterolo. La mutazione dei residui distali alla tasca, V699Y e R752A, non ha influenzato il legame con il ligando. La mutazione dei residui nella tasca idrofobica in residui ingombranti (L703F e L820W) ha ridotto significativamente il legame di DHE confermando che la tasca idrofobica ospita lo sterolo (Fig. 5b). Inoltre, la mutazione M610R ha completamente abolito il legame con lo sterolo, implicando che la dimerizzazione di Upc2 LBD è richiesta per il legame con lo sterolo. Le LBD di tutti gli omologhi di Upc2 nelle specie fungine mostrano un alto grado di conservazione della sequenza (Fig. 2 supplementare). In particolare, i residui situati nell’interfaccia di dimerizzazione, la tasca di legame al ligando e l’anello di attivazione C-terminale sono strettamente conservati.

L’Upc2 citosolico si rilocalizza nel nucleo sull’attivazione

Le caratteristiche strutturali uniche e di legame al ligando di Upc2 ci hanno suggerito che Upc2 può rilocalizzarsi nel nucleo sul legame al ligando nel citosol. Abbiamo esaminato la localizzazione cellulare di Upc2 full-length e dei suoi mutanti in condizioni di ricchezza di ergosterolo o di carenza di ergosterolo. In precedenza, ci sono stati diversi rapporti contrastanti sulla localizzazione di Upc2 nel nucleo, citoplasma e foci perinucleari utilizzando il C-terminale verde fluorescente proteina (GFP) di fusione 30,31,32. Tuttavia, i determinanti chiave della localizzazione Upc2 non sono stati definiti sperimentalmente. In questo studio, per evitare l’interferenza funzionale di GFP con l’anello di attivazione C-terminale e legame del ligando, GFP è stato etichettato al termine N di Upc2. Upc2 di tipo selvaggio è presente principalmente nel citosol con una leggera localizzazione nucleare nel 30% della popolazione cellulare. Quando le cellule di lievito sono state coltivate in presenza di 5 mM ergosterolo, Upc2 è stato localizzato quasi esclusivamente al citoplasma. Tuttavia, l’aggiunta di 4 μg ml-1 di fluconazolo ai mezzi di coltura, che inibisce la biosintesi di ergosterolo, ha spostato la localizzazione di Upc2 al nucleo in un’intera popolazione cellulare (Fig. 6). Upc2 contiene un segnale bipartito di localizzazione nucleare (NLS) a monte della sua sequenza di cluster Zn2-Cys6 che conferisce una proprietà intrinseca di localizzazione nucleare. La delezione di NLS (residui 2-43) ha reso Upc2 completamente citosolico. Inoltre, il LBD isolato (residui 598-913) o il costrutto privo di NLS-DBD (residui 283-913 del costrutto) era completamente citosolico indipendentemente dai livelli di sterolo. Al contrario, la delezione della LBD C-terminale (ΔLBD, residui 1-559 del costrutto) ha mostrato una forte localizzazione nucleare indipendente dai livelli di sterolo. Questi dati suggeriscono che la LBD C-terminale legata all’ergosterolo sopprime il trasporto nucleare di Upc2 inibendo la funzione NLS. La dissociazione del ligando sterolico da Upc2 può portare all’esposizione della NLS o liberare Upc2 dalla cattura da parte delle proteine citosoliche per il trasporto nucleare. La delezione del loop C-terminale (Δ879-913) che interrompe il legame dell’ergosterolo ha portato a una modesta localizzazione nucleare di Upc2. G888D o mutazioni nella tasca di legame dello sterolo (L820W o L703F) hanno portato a una forte localizzazione nucleare costitutiva di Upc2. La mutazione M610R che interrompe la dimerizzazione di LBD e il legame con il ligando mostra una localizzazione prevalentemente nucleare indipendentemente dal livello di sterolo, suggerendo che la dimerizzazione di Upc2 è essenziale per la sua funzione regolatoria. In conclusione, queste osservazioni insieme ai saggi di legame al ligando suggeriscono che il legame allo sterolo è il meccanismo chiave nella regolazione della localizzazione della TF. In una condizione ricca di sterolo, Upc2 è legato all’ergosterolo ed è presente nel citosol come forma repressa. Alla deplezione dell’ergosterolo, Upc2 non legato viene attivato e si sposta nel nucleo per l’attivazione trascrizionale dei geni correlati.

Le cellule sono state coltivate in 4 μg ml-1 di fluconazolo o 5 mM di ergosterolo per 12 ore prima della visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. I pannelli superiori mostrano la localizzazione di GFP-Upc2. DAPI macchia sia il DNA nucleare come sfere e il DNA mitocondriale come macchie luminose che oscurano le caratteristiche della segregazione del DNA nucleare. Il DNA nucleare può essere distinto dal DNA mitocondriale per la sua dimensione e forma. La localizzazione nucleare di Upc2 appare come sfere verde brillante all’interno delle cellule. Barra della scala, 3 μm.

Upc2 regola il livello di ergosterolo nelle cellule di lievito

Upc2 e Ecm22 si legano a un elemento conservato di 7 bp di regolazione dello sterolo all’interno dei promotori della maggior parte dei geni ERG, compresi ERG2, ERG3 e ERG11 (rif. 2, 21). Per indagare il meccanismo di regolazione trascrizionale di Upc2, controlliamo l’attività trascrizionale di vari costrutti Upc2 utilizzando ERG2-LacZ come reporter (Fig. 7a). Il tipo selvaggio Upc2 ha mostrato una moderata attività trascrizionale in una condizione di crescita normale. Il trattamento con fluconazolo aumenta l’attività di trascrizione più di due volte. Tuttavia, il plasmide vuoto o la delezione del C-terminale LBD ha mostrato un’attività di trascrizione molto debole, suggerendo che LBD è essenziale per l’attività trascrizionale di Upc2. La mutazione G888D, indipendentemente dal trattamento con fluconazolo, ha mostrato una completa attivazione costitutiva di Upc2, che è 1,2 volte superiore al tipo selvaggio indotto. Questa osservazione è coerente con la precedente relazione che il CTD è essenziale per l’attivazione trascrizionale di Upc2 (rif. 21). La M610R non ha mostrato alcun aumento dell’attività trascrizionale sulla deplezione degli steroli, suggerendo che la dimerizzazione è essenziale per la funzione di regolazione. La delezione dell’anello di attivazione C-terminale (ΔCT) che mostra la localizzazione nucleare costitutiva, tuttavia, ha mostrato almeno il 30% di attività trascrizionale in meno rispetto al wild type non indotto. Inoltre, l’attività trascrizionale di ΔCT non è aumentata al trattamento con fluconazolo. Questi dati suggeriscono che il ciclo di attivazione C-terminale è essenziale non solo per la regolazione della localizzazione della proteina, ma per l’attività trascrizionale completa di Upc2. L’interruzione del legame degli steroli con L703F o L820W ha mostrato una localizzazione nucleare costitutiva. Tuttavia, le attività di trascrizione di questi mutanti erano del 40% inferiori a quelle del tipo selvaggio e non erano potenziate significativamente sull’induzione del fluconazolo. Sembra che l’introduzione di residui voluminosi nella tasca di legame dello sterolo non solo interrompa il legame dello sterolo ma perturbi anche la conformazione corretta di Upc2 per la piena attività trascrizionale. Queste osservazioni insieme al legame del ligando e agli esperimenti di localizzazione cellulare suggeriscono che il legame dello sterolo non solo regola la localizzazione della proteina ma anche l’attività trascrizionale di Upc2. Per confermare che Upc2 è coinvolto nella regolazione del livello di ergosterolo nelle cellule, abbiamo quantificato il contenuto totale di ergosterolo delle cellule di lievito contenenti alleli UPC2 wild-type o mutanti (Fig. 7b). Poiché Upc2 attiva l’espressione dei geni biosintetici dell’ergosterolo, è ipotizzabile che il livello di sterolo delle cellule di lievito sia indirettamente correlato all’attività trascrizionale di Upc2. In assenza dei geni UPC2 e ECM22, i livelli di sterolo delle cellule di lievito erano debolmente rilevabili, e l’aggiunta di 4 μg ml-1 di fluconazolo ha gravemente inibito la crescita delle cellule di lievito. Upc2 wild-type ha mostrato un livello di ergosterolo simile a quello di L703F e L820W in assenza di fluconazolo. Il trattamento con fluconazolo ha soppresso il livello di ergosterolo di circa il 40% nei ceppi wild type, L793F e L820W. La delezione dei 35 residui C-terminali (ΔCT) ha portato a un livello di ergosterolo leggermente superiore a quello delle cellule wild-type. Tuttavia, il fluconazolo ha soppresso il livello di sterolo delle cellule mutanti ΔCT e M610R rispetto alle cellule wild-type in modo più significativo. Upc2 privo di LBD ha mostrato un certo livello basale di sintesi di sterolo in assenza di fluconazolo. Tuttavia, la presenza di 4 μg ml-1 di fluconazolo ha inibito significativamente il livello di sterolo e la crescita cellulare. Le cellule che esprimono il mutante G888D hanno livelli di ergosterolo tre volte superiori rispetto alle cellule che esprimono Upc2 wild-type. I livelli di ergosterolo erano più alti nelle cellule mutanti G888D trattate con fluconazolo rispetto a quelli trovati nelle cellule wild-type coltivate senza fluconazolo. Questi dati suggeriscono che la mutazione G888D attiva costitutivamente Upc2 per la biosintesi di ergosterolo, che porta ad una maggiore resistenza agli antimicotici azolici. Per confermare che Upc2 è coinvolto nella regolazione dell’espressione genica degli enzimi biosintetici dell’ergosterolo, abbiamo eseguito un’analisi quantitativa dell’espressione genica di ERG11 mediante PCR in tempo reale utilizzando i ceppi upc2/ecm22-knockout con alleli UPC2 wild-type e mutanti. Abbiamo misurato i livelli di mRNA dei geni ERG11 che sono stati normalizzati dal gene TAF10 come controllo interno33. I dati indicano che i livelli di espressione di mRNA di ERG11 correlano con le attività del promotore di ERG2 e i livelli di ergosterolo come previsto (Fig. 3 supplementare).

(a) Attività trascrizionale di Upc2. I reporter ERG2-lacZ sono stati usati per determinare il contributo di ogni costrutto Upc2 alla regolazione del promotore ERG2. I saggi di β-Galattosidasi sono stati eseguiti su ogni trasformante dopo che 5 ml di colture sono state coltivate per 16 ore in terreno minimo (non indotto) o in terreno minimo contenente 4 μg ml-1 di fluconazolo (indotto). I valori del saggio rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti. Tutte le barre di errore indicano s.d. I valori P sono stati valutati con il test t di Student a due code. *P<0.05 contro il tipo selvaggio, #P<0.05 contro ogni mutante senza fluconazolo. (b) Quantificazione dell’ergosterolo totale nelle cellule di lievito. Ceppi di lievito upc2Δ ecm22Δ contenenti vari alleli UPC2 sono stati analizzati per il loro contenuto di ergosterolo. Ogni punto di dati è la media di tre misurazioni. Tutte le barre di errore indicano s.d. I valori P sono stati valutati con il test t di Student a due code. *P<0.05 rispetto al tipo selvatico, #P<0.05 rispetto al tipo selvatico trattato con fluconazolo. (c) Suscettibilità al fluconazolo dei ceppi di lievito che esprimono l’allele UPC2 wild-type o mutante. I ceppi sono stati inizialmente coltivati senza fluconazolo e le serie di diluizioni sono state macchiate sulle piastre di agar contenenti fluconazolo e incubate per 36 ore.

L’attivazione di Upc2 conferisce resistenza agli agenti antifungini

Per indagare la relazione tra l’attivazione di Upc2 e la resistenza agli agenti antifungini, abbiamo controllato la suscettibilità al fluconazolo dei ceppi upc2Δ ecm22Δ o ecm22Δ che esprimono alleli UPC2 wild-type o mutanti (Fig. 7c). Poiché il fluconazolo interferisce con la crescita delle cellule di lievito inibendo la biosintesi dell’ergosterolo, i modelli generali di crescita delle cellule hanno mostrato una correlazione con i livelli di sterolo delle cellule trattate con fluconazolo. Le cellule a doppio knockout di upc2Δ ecm22Δ non crescevano in presenza di fluconazolo. L’introduzione di UPC2 wild-type ha permesso una debole crescita cellulare a 8 μg ml-1 di fluconazolo. Le cellule di lievito che esprimono un mutante G888D hanno mostrato un aumento significativo della resistenza al fluconazolo a 8 μg ml-1. Tuttavia, il mutante G888D è cresciuto più debolmente del tipo selvatico in assenza di fluconazolo, suggerendo che l’attivazione completa e costitutiva di Upc2 è svantaggiosa in condizioni non selettive, imponendo un carico metabolico34. Il mutante ΔLBD privo di attività di trascrizione non è cresciuto alla concentrazione più bassa di fluconazolo. I mutanti L820W, L703F, M610R e ΔCT che interferiscono con il legame degli steroli erano più suscettibili al fluconazolo rispetto al tipo selvaggio. Un singolo ceppo upc2Δ-knockout che porta l’allele ECM22 ha permesso una crescita debole in una bassa concentrazione di fluconazolo, suggerendo che ECM22 ha un ruolo parzialmente sovrapposto nell’attivazione dei geni coinvolti nella resistenza agli azoli. Tuttavia, nelle concentrazioni di fluconazolo superiori a 6 μg ml-1, i ceppi upc2Δ e upc2Δ ecm22Δ non hanno mostrato differenze significative nelle suscettibilità di tutti i costrutti Upc2, suggerendo che Upc2 svolge un ruolo dominante nella regolazione degli steroli. Questo è coerente con le osservazioni precedenti che la delezione di UPC2 si traduce in sensibilità al ketoconazolo, mentre nessun effetto è stato osservato con la delezione di ECM22, suggerendo che Ecm22 e Upc2 hanno obiettivi specifici con alcune funzioni essenziali che si sovrappongono35,36.

Upc2 è una nuova classe di TFs zinc finger

Studi recenti hanno proposto che diversi membri della famiglia di regolatori di trascrizione fungina zinco cluster possono rappresentare analoghi funzionali di NRs metazoi13,18,19,20.

Sebbene i TF del cluster di zinco fungino non abbiano alcuna apparente somiglianza di sequenza o strutturale con le NR dei metazoi, Upc2 mostra somiglianze concettuali con le NR degli steroidi nelle architetture generali dei domini, nel legame del ligando sterolico, nell’omodimerizzazione, nella regolazione trascrizionale dipendente dal ligando e nella traslocazione nucleare.

Upc2 e le NR dei metazoi contengono entrambi domini di legame al DNA con dita di zinco nelle loro regioni N-terminali. Le dita di zinco che coordinano due ioni di zinco sono composte da sei cisteine per Upc2 e quattro cisteine in ciascuna delle due dita per NRs37. I domini di legame al DNA di NRs e zinco cluster TFs sono strutturalmente simili e si legano al DNA come omo- o eterodimeri13. Zinc finger TFs hanno un dominio regolatore negativo C-terminale, che per un certo numero di membri della famiglia media il legame del ligando o la risposta a piccole molecole come i metaboliti cellulari e ligandi lipofili13. L’attività trascrizionale di Upc2 è regolata dall’ergosterolo, che è funzionalmente simile a NRs steroidei di tipo I in termini di specificità del ligando. Upc2 e recettori steroidei entrambi formano omodimeri. Upc2 forma omodimeri costitutivi indipendentemente dal legame del ligando. Recettore degli estrogeni α è stato segnalato per esistere come un dimero anche nello stato apo e il legame ligando ulteriormente stabilizzare l’omodimero38.

Confronto strutturale di Upc2 con mammiferi steroidi NRs rivela che Upc2 ha un distintivo α-helical fold di LBD da mammiferi NRs (Fig. 4 supplementare). Entrambi i regolatori genici sono principalmente composti da circa 12 strutture α-elicoidali con dimensioni simili di LBDs. LBDs di Upc2, estrogeni e recettori del progesterone formano dimeri da interazioni elica fascio. Tuttavia, tranne la configurazione generale dei dimeri con siti di legame del ligando strettamente situati all’interfaccia del dimero, non c’è una chiara omologia strutturale tra Upc2 e i NR. Sul legame del ligando, recettori steroidei dissociare da heat shock protein Hsp90 nel citosol e traslocare al nucleo, legandosi ai loro promotori del gene bersaglio come omodimeri17. Coerentemente, la traslocazione di Upc2 dal citosol al nucleo è regolata in un modo ligando-dipendente.

Tuttavia, Upc2 LBD mostra una piega strutturale completamente diversa rispetto al LBDs di NRs metazoani. La mancanza di somiglianze di sequenza e strutturali tra i TF del cluster di zinco dei funghi e i NR dei metazoi suggerisce che le somiglianze architettoniche e funzionali siano il prodotto di un’evoluzione convergente con una strategia meccanicistica comune. L’analisi filogenetica mostra che gli ortologhi di Upc2 sono identificabili solo all’interno dei Saccharomycotina e le proteine Upc2/Ecm22 formano un clade monofiletico che non è strettamente legato a nessun altro Zn2-Cys6 proteine di Saccharomycotina5. Il lievito in erba, S. cerevisiae, contiene circa 50 Zn2-Cys6 TFs39. Anche se l’omologia di sequenza di Upc2 con altri tipi di zinc finger TFs è bassa, essi ospitano una sequenza conservata specifica per i funghi all’interno delle LBDs C-terminali che è stata precedentemente conosciuta come MHR (middle homology region)40. La regione C-terminale, compresa la MHR, nelle zinco TFs contiene comunemente 13-15 α-eliche di elementi di struttura secondaria, il che implica che la presenza di una LBD è una caratteristica generale di questa famiglia di proteine. In conclusione, Upc2 rappresenta una nuova classe di zinco finger TFs che mostra un’analogia funzionale con i recettori steroidei dei metazoi.