Articles / október 2, 2021

Structural mechanism of ergosterol regulation by fungal sterol transcription factor Upc2

Az Upc2 az ergoszterol specifikus receptora

Az Upc2 és az Ecm22 nagyfokú szekvencia hasonlóságot mutatnak az N-terminális DNS-kötő doménekben, amelyeket egy konzervált Zn(II)2-Cys6 cinkujj motívum jellemez21. A körülbelül 300 aminosavmaradékból álló C-terminális konzervált régió egy transzkripcióaktiváló domént tartalmaz (1a. ábra). Mivel az Upc2 transzkripciós aktivitása a sejt ergoszterinszintjétől függ, feltételeztük, hogy a CTD az ergoszterin LBD-jeként szolgálhat és szabályozhatja az Upc2 transzkripciós aktivitását. A dehidroergoszterol (DHE) egy természetes szterol, amely saját fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkezik, és kis mennyiségben található meg az S. cerevisiae-ben22,23. A DHE szerkezeti és kémiai tulajdonságait tekintve nagyon hasonlít az ergoszterolhoz, csak egyetlen kettős kötésnyi különbséggel, és funkcionális interferencia nélkül képes helyettesíteni az ergoszterolt az élesztőben24. Annak vizsgálatára, hogy az Upc2 közvetlenül kötődik-e az élesztősterolokhoz, fluoreszcens DHE-kötési próbát végeztünk a rekombináns Upc2 tisztított CTD-jével (598-913-as maradékok). Az Upc2 triptofánmaradványait 285 nm-en gerjesztettük, és a DHE fluoreszcencia spektrumát követtük. A spektrumanalízis kimutatta, hogy a triptofán 340 nm-nél történő kioltása három emissziós csúcs megjelenésével járt együtt 354, 373 és 393 nm-nél (1b. ábra). Ezek a csúcsok a DHE-ra jellemzőek, ami fluoreszcencia-rezonancia energiaátvitelre (FRET) utal az Upc2 LBD és a kötött DHE között25,26. Az Upc2 LBD a szabad DHE-t nanomoláris affinitással köti az egyensúlyi kötődési kísérletekben mértek szerint (1b. ábra). Az Upc2 LBD a DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin) liposzómákba ágyazott DHE-t is kivonja és megköti, amit a 375 nm-en történő fluoreszcens emisszió növekedése követett nyomon, amikor Upc2 LBD-t adtunk DOPC:DHE liposzómákhoz (1c,d ábra). Amikor nem fluoreszkáló ergoszterint adtunk a DHE-kötött Upc2-t tartalmazó keverékhez, a fluoreszcencia emisszió csökkent, ami azt jelzi, hogy az ergoszterin versenyez a DHE-val az Upc2 kötődéséért. A koleszterin hozzáadása azonban nem befolyásolta a DHE-kötődést, ami arra utal, hogy az Upc2 nem köt koleszterint. Más szterolok, mint a 20-hidroxikoleszterin, 25-hidroxikoleszterin, hidrokortizon és β-ösztradiol nem versenyeztek a DHE-val, ami arra utal, hogy az Upc2 LBD specifikus receptor a gombaszterolok, mint az ergoszterin és a DHE számára (1e. ábra). Ezen túlmenően, hogy megvizsgáljuk az Upc2 DHE és ergoszterin extrakciós tulajdonságait a liposzómákból az élesztő plazmamembránok fiziológiás lipidösszetételével27, nyomon követtük a DHE extrakcióját a liposzómákból foszfatidil-kolin/foszfatidil-etanolamin/foszfatidil-inozitol/foszfatidil-szerin/DHE (40:40:10:8:2, mol %) és az ergoszterin kompetitív kötődését a liposzómák foszfatidil-kolin/foszfatidil-etanolamin/foszfatidil-inozitol/foszfatidil-szerin/ergoszterin (25:25:10:10:10:30, mol %) liposzómák későbbi hozzáadásával 6 óránál.5 μM és 23 nM liposzómát, illetve fehérjét (1. kiegészítő ábra). Az Upc2 a DOPC/DHE liposzómákhoz hasonló módon köti a DHE-t és az ergoszterint. Az Ecm22, az Upc2 közeli homológja szintén az Upc2-hez hasonló módon kötődik a szabad DHE-hoz (1f. ábra).

1. ábra: Az Upc2 LBD specifikus kötődése ergoszterolhoz és DHE-hoz.

Az in vitro kísérletekkel azonosított szterolligandumok és az Upc2 által élesztősejt-lizátumból befogott természetes ligandumok összehasonlítása érdekében az Upc2 által extrahált ligandumot fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) és folyadékkromatográfia-tömegspektroszkópiai elemzésekkel jellemeztük (2. ábra). A befogott ligandum kizárólag ergoszterin volt, más lipidekből nem volt kimutatható faj. Tekintettel az ergoszterol és a DHE szerkezeti és kémiai tulajdonságainak hasonlóságára, valamint arra, hogy az ergoszterol sokkal nagyobb mennyiségben fordul elő az élesztősejtekben, mint a DHE, arra a következtetésre jutottunk, hogy az ergoszterol az Upc2 fiziológiás ligandja.

2. ábra: Az Upc2 által élesztősejt-lizátumból befogott ligandum HPLC és folyadékkromatográfia-tömegspektrometriás elemzése.

Az Upc2 LBD új α-hélixes hajtást mutat

Az Upc2 C-terminális LBD szerkezetének vizsgálatához különböző C-terminális konstrukciókon végzett kristallográfiai vizsgálatokat. Az apo Upc2 LBD és az ergoszterolhoz kötött Upc2 LBD kristályait kristályosítottuk, de szinkrotron sugárzáson nem diffraktáltak. Az Upc2 LBD kristályok diffrakciós minőségének javítása érdekében egy fúziós fehérjét (Upc2 LBD-T4L) állítottunk elő, amelyben a T4 lizozim helyettesíti az Upc2 változó hurkát (715-725. maradék) (hivatkozás 28). Az Upc2-T4L fúziós fehérjét stabilan expresszáltuk, és jó DHE-kötő tulajdonságokat mutatott (3a. ábra), ami arra utal, hogy a T4 lizozim fúzió nem zavarja a ligandumkötést és a fehérje foldingját. Az apo Upc2 (598-878. maradék)-T4L C-terminális LBD-jének (598-878. maradék) szerkezetét a C-terminális 35 maradékot nélkülözve 2,9 Å felbontással határoztuk meg az egyszeri anomális diszperziós módszerrel, szelenometioninnal jelölt kristályok felhasználásával. Az Upc2-T4L két molekuláját és 29 vízmolekulát az aszimmetrikus egységben tartalmazó végleges szerkezetet 24,9%-os R-faktorral finomítottuk (1. táblázat).

1. táblázat Adatgyűjtési és finomítási statisztikák.

Az apo Upc2 LBD szerkezete egy ovális alakú, globuláris α-hélixes hajtást mutat (3b. ábra). Az Upc2 LBD 11 α-hélixből és összekötő hurkokból áll. A C-terminális hurok régióban van egy kis előre jelzett α-hélix (α12, 889-896. maradék), amely nem szerepelt a kristályosított konstrukcióban. A 11 α-hélix úgy van elrendezve, hogy egy zárt bilincset képezzen, amely egy mély zsebet hoz létre a fehérje magjában. Az első három α-hélix alkotja az N-terminális ujjakat, az α8-α9, α7 és α11 hélixek pedig a szorító többi ujját. A négy α3-α6 hélix a központi tenyeret helikális kötegként alkotja. Az α7-α8 hurok (760-799. maradék) az α8-α9 hélixeket a szerkezet leghosszabb véletlenszerű tekercseként veszi körül. Az α5-α6 hurok kilenc maradékát helyettesítő T4 lizozim szorosan az Upc2 LBD felszínén helyezkedik el (3c. ábra).

Az Upc2 LBD szerkezetében egy központi hidrofób zseb látható, amelyet α hélixek vesznek körül (3d. ábra). A mély hidrofób zseb térfogata 287 Å3 . Az α5 és α6 hélixek alkotják a zseb alját, az α1-α2, α7, α9 és α11 hélixek pedig a hidrofób kötőzseb falát. A zseb egy kis pórussal a felszínen hozzáférhető az oldószer számára. A hidrofób zseb jelenléte azt sugallta számunkra, hogy kis lipofil molekulák kötőhelyeként szolgálhat. Az Upc2 strukturális összehasonlítása a PDB-ben található ismert struktúrákkal a DALI szerver segítségével nem találtunk olyan rokon struktúrákat, amelyek Z pontszáma >7 volt, ami arra utal, hogy az Upc2 LBD egy új LBD foldot képvisel.

Az Upc2 LBD konstitutív homodimert képez

A méret-kiválasztásos kromatográfiás (SEC) elemzés kimutatta, hogy a rekombináns Upc2 LBD vagy Upc2 LBD-T4L homogén dimer, kimutatható monomer faj nélkül, ami arra utal, hogy a dimer Upc2 biológiailag releváns forma. Az Upc2 LBD dimerje két szterol-kötőhelyet tartalmaz, és a ligandumkötés nem befolyásolta az Upc2 SEC-vel elemzett oligomer állapotát (4a. ábra). A kristályok aszimmetrikus egységében az Upc2 LBD-T4L két molekulája állt kapcsolatban egymással egy nem kristallográfiai kétszeres tengellyel. Az Upc2 LBD dimerizálódik az α1 és α2 hélixek által, amelyek a dimer határfelületen négyhélix-köteget alkotnak (4b. ábra). Az Upc2 LBD dimer N-terminálisai a dimer interfész középpontja közelében ugyanazon az oldalon helyezkednek el. A dimer interfész főként hidrofób maradékokból áll, amelyek 1562 Å2 felületet temetnek el az interfészen (4c. ábra). A Met610 a dimer interfész közepén helyezkedik el. Az M610R mutáns oldatban monomer, amit SEC-vel elemeztek, ami arra utal, hogy a kristályszerkezetben megfigyelt dimer összhangban van az oldatban megfigyelt dimerrel (4a. ábra). A C. albicans Upc2 és az S. cerevisiae Ecm22 LBD-i oldatban szintén dimerek, és a C. albicans Upc2 M506R mutációja az LBD monomerizációjához vezetett. A dimer interfészt alkotó maradékok konzerváltsága az Upc2 homológokban arra utal, hogy az LBD-k homodimerizációja általános jellemzője ezeknek a fehérjéknek (2. kiegészítő ábra).

A C-terminális hurok elengedhetetlen a ligandumkötéshez

A S. cerevisiae Upc2 és a C. albicans Upc2 konstitutív aktivációs mutációinak többsége a C-terminális hurokban, az α11-es hélix és az előre jelzett α12-es hélix között csoportosul21,29 . A kristályszerkezet nem tartalmazza ezt a 35 maradékból álló C-terminális aktiváló hurkot. E C-terminális hurok funkcionális jelentőségének vizsgálatára ligandumkötési vizsgálatokat végeztünk az Upc2 LBD C-terminális deléciós mutánsain (5a. ábra). A C-terminális 14 maradék (Δ900-913) csonkítása nem befolyásolta a ligandumkötést. A C-terminális 35 maradék (Δ879-913) deléciója azonban, beleértve a prediktált α12-t is, megszüntette a DHE kötődést, ami arra utal, hogy a C-terminális glicinben gazdag hurok és az α12 spirál nélkülözhetetlen a ligandumkötéshez (5b. ábra). Ezenkívül a G888D, egy konstitutív aktiváló mutáció az α11-α12 hurokban jelentősen gátolta a DHE kötődést.

Az Upc2 LBD kristályszerkezete egy mély hidrofób zsebet mutat, amely egyetlen szterolmolekula befogadására alkalmas. A C-terminális aktiváló hurkot nélkülöző apo Upc2 LBD-ben a kötőzseb mérete azonban valamivel kisebb, mint az ergoszterin méretei, ami arra utal, hogy az Upc2 LBD-nek konformációs változáson kell átesnie a ligandum megkötésekor. Az Upc2 szterolkötésének szerkezeti meghatározó tényezőinek azonosítása érdekében megpróbáltuk az Upc2 LBD-t ergoszterinnel együtt kristályosítani. A szterolhoz kötött Upc2 kristályok gyenge diffrakciója miatt azonban a ligandum-komplex szerkezeti meghatározása nem volt lehetséges. Alternatívaként megvizsgáltuk a hidrofób zsebben található számos mutáció hatását a szterolkötésre. A zsebtől távoli maradékok, a V699Y és az R752A mutációja nem befolyásolta a ligandumkötést. A hidrofób kötőzsebben lévő maradékok nagy tömegű maradékokká történő mutációja (L703F és L820W) jelentősen csökkentette a DHE kötődést, ami megerősítette, hogy a hidrofób zseb befogadja a szterint (5b. ábra). Ezenkívül az M610R mutáció teljesen megszüntette a szterolkötést, ami arra utal, hogy az Upc2 LBD dimerizációja szükséges a szterolkötéshez. A gombafajok összes Upc2 homológjának LBD-je nagyfokú szekvencia konzerváltságot mutat (2. kiegészítő ábra). Különösen a dimerizációs határfelületen, a ligandumkötő zsebben és a C-terminális aktivációs hurokban található maradékok szigorúan konzerváltak.

A citoszolikus Upc2 aktiváláskor a sejtmagba relokalizálódik

Az Upc2 egyedi szerkezeti és ligandumkötési jellemzői azt sugallták számunkra, hogy az Upc2 a citoszolban történő ligandumkötéskor a sejtmagba relokalizálódhat. Megvizsgáltuk a teljes hosszúságú Upc2 és mutánsainak celluláris lokalizációját ergoszterolban gazdag vagy ergoszterolhiányos körülmények között. Korábban számos ellentmondásos jelentés született az Upc2 sejtmagban, citoplazmában és perinukleáris fókuszokban való lokalizációjáról a C-terminális zöld fluoreszcens fehérje (GFP) fúziójának felhasználásával30,31,32. Az Upc2 lokalizációjának kulcsfontosságú meghatározóit azonban kísérletileg nem határozták meg. Ebben a vizsgálatban a GFP C-terminális aktivációs hurokkal és ligandumkötéssel kapcsolatos funkcionális interferenciájának elkerülése érdekében a GFP-t az Upc2 N-terminusához jelöltük. A vad típusú Upc2 főként a citoszolban van jelen, enyhe nukleáris lokalizációval a sejtpopuláció 30%-ában. Amikor az élesztősejteket 5 mM ergoszterin jelenlétében növesztettük, az Upc2 szinte kizárólag a citoplazmában lokalizálódott. Azonban 4 μg ml-1 flukonazol hozzáadása a táptalajhoz, amely gátolja az ergoszterin bioszintézisét, az Upc2 lokalizációját a sejtmagba tolta a teljes sejtpopulációban (6. ábra). Az Upc2 a Zn2-Cys6 klaszter szekvenciája előtt egy kétrészes nukleáris lokalizációs jelet (NLS) tartalmaz, amely belső nukleáris lokalizációs tulajdonságot kölcsönöz. Az NLS (2-43. maradékok) deléciója az Upc2-t teljesen citoszolissá tette. Ezenkívül az izolált LBD (598-913 maradékok) vagy az NLS-DBD-t nélkülöző konstrukció (konstrukció 283-913 maradékok) teljesen citoszolikus volt, függetlenül a szterinszintektől. Ezzel szemben a C-terminális LBD deléciója (ΔLBD, a konstrukció 1-559. maradékai) erős nukleáris lokalizációt mutatott, függetlenül a szterolszintektől. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ergoszterolhoz kötött C-terminális LBD elnyomja az Upc2 nukleáris transzportját az NLS funkció gátlásával. A szterol ligandumnak az Upc2-ről történő disszociációja az NLS expozíciójához vezethet, vagy felszabadíthatja az Upc2-t a citoszolikus fehérjék általi befogás alól a nukleáris szállításhoz. Az ergoszterolkötést megszakító C-terminális hurok (Δ879-913) deléciója az Upc2 mérsékelt nukleáris lokalizációjához vezetett. A G888D vagy a szterolkötő zsebben lévő mutációk (L820W vagy L703F) az Upc2 erős konstitutív nukleáris lokalizációjához vezettek. Az M610R mutáció, amely megszakítja az LBD dimerizációját és a ligandumkötést, többnyire nukleáris lokalizációt mutatott, függetlenül a szterinszinttől, ami arra utal, hogy az Upc2 dimerizációja elengedhetetlen a szabályozó funkciójához. Összefoglalva, ezek a megfigyelések a ligand-kötési próbákkal együtt arra utalnak, hogy a szterolkötés a kulcsmechanizmus a TF lokalizációjának szabályozásában. Sterolban gazdag állapotban az Upc2 ergoszterolhoz kötődik és elnyomott formában van jelen a citoszolban. Az ergoszterin kimerülésekor a nem kötött Upc2 aktiválódik és a sejtmagba vándorol a kapcsolódó gének transzkripciós aktiválása céljából.

6. ábra: GFP-Upc2 konstrukciók celluláris lokalizációja.

Az Upc2 szabályozza az ergoszterinszintet az élesztősejtekben

Az Upc2 és az Ecm22 egy konzervált 7 bp hosszúságú szterinszabályozó elemhez kötődik a legtöbb ERG gén, köztük az ERG2, ERG3 és ERG11 promóterében (hivatkozások 2, 21). Az Upc2 transzkripciós szabályozásának mechanizmusát vizsgálva különböző Upc2 konstrukciók transzkripciós aktivitását ellenőriztük ERG2-LacZ riporterrel (7a. ábra). A vad típusú Upc2 normál növekedési körülmények között mérsékelt transzkripciós aktivitást mutatott. A flukonazol kezelés több mint kétszeresére növeli a transzkripciós aktivitást. Az üres plazmid vagy a C-terminális LBD deléciója azonban nagyon gyenge transzkripciós aktivitást mutatott, ami arra utal, hogy az LBD nélkülözhetetlen az Upc2 transzkripciós aktivitásához. A G888D mutáció, függetlenül a flukonazol kezeléstől, az Upc2 teljes konstitutív aktivációját mutatta, ami 1,2-szer nagyobb, mint az indukált vad típusé. Ez a megfigyelés összhangban van azzal a korábbi jelentéssel, amely szerint a CTD nélkülözhetetlen az Upc2 transzkripciós aktiválásához (hivatkozás 21). Az M610R nem mutatta a transzkripciós aktivitás növekedését a szterol-depléció hatására, ami arra utal, hogy a dimerizáció elengedhetetlen a szabályozó funkcióhoz. A C-terminális aktivációs hurok (ΔCT) deléciója, amely konstitutív nukleáris lokalizációt mutat, azonban legalább 30%-kal alacsonyabb transzkripciós aktivitást mutatott, mint az indukálatlan vad típus. Emellett a ΔCT transzkripciós aktivitása nem nőtt fluconazol kezelés hatására. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a C-terminális aktivációs hurok nemcsak a fehérje lokalizációjának szabályozásához, hanem az Upc2 teljes transzkripciós aktivitásához is elengedhetetlen. A szterolkötés L703F vagy L820W általi megszakítása konstitutív nukleáris lokalizációt mutatott. E mutánsok transzkripciós aktivitása azonban 40%-kal kisebb volt, mint a vad típusé, és fluconazol indukcióra nem fokozódott jelentősen. Úgy tűnik, hogy a terjedelmes maradékok bevezetése a szterolkötő zsebbe nemcsak a szterolkötést zavarja meg, hanem az Upc2 megfelelő konformációját is megzavarja a teljes transzkripciós aktivitáshoz. Ezek a megfigyelések a ligandumkötési és sejtlokalizációs kísérletekkel együtt arra utalnak, hogy a szterolkötés nemcsak a fehérje lokalizációját, hanem az Upc2 transzkripciós aktivitását is szabályozza. Annak megerősítésére, hogy az Upc2 részt vesz a sejtek ergoszterinszintjének szabályozásában, számszerűsítettük a vad típusú vagy mutáns UPC2 allélokat tartalmazó élesztősejtek teljes ergoszterintartalmát (7b. ábra). Mivel az Upc2 aktiválja az ergoszterol bioszintetikus gének expresszióját, elképzelhető, hogy az élesztősejtek szterolszintje közvetve korrelál az Upc2 transzkripciós aktivitásával. Az UPC2 és ECM22 gének hiányában az élesztősejtek szterolszintje gyengén kimutatható volt, és 4 μg ml-1 fluconazol hozzáadása erősen gátolta az élesztősejtek növekedését. A vad típusú Upc2 hasonló ergoszterinszintet mutatott a sejtben, mint az L703F és L820W esetében fluconazol hiányában. A flukonazol kezelés a vad típusú, az L793F és az L820W törzsek ergoszterinszintjét mintegy 40%-kal csökkentette. A C-terminális 35 maradék törlése (ΔCT) a vad típusú sejtekhez képest kissé magasabb ergoszterolszintet eredményezett. A flukonazol azonban a vad típusú sejteknél jelentősebben elnyomta a ΔCT és az M610R mutáns sejtek szterolszintjét. Az LBD-t nélkülöző Upc2 mutatott némi alapszintű szterolszintézist flukonazol hiányában. A 4 μg ml-1 fluconazol jelenléte azonban jelentősen gátolta a szterinszintet és a sejtnövekedést. A G888D mutánst expresszáló sejtek háromszor magasabb ergoszterinszintet mutattak a vad típusú Upc2-t expresszáló sejtekhez képest. A flukonazollal kezelt G888D mutáns sejtekben magasabb volt az ergoszterolszint, mint a flukonazol nélkül nevelt vad típusú sejtekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a G888D mutáció konstitutívan aktiválja az Upc2-t az ergoszterin bioszintézisére, ami fokozott rezisztenciához vezet az azolos gombaölő szerekkel szemben. Annak megerősítésére, hogy az Upc2 részt vesz az ergoszterol bioszintetikus enzimek génexpressziójának szabályozásában, az ERG11 kvantitatív génexpressziós elemzését valós idejű PCR segítségével végeztük el vad típusú és mutáns UPC2 alléllal rendelkező upc2/ecm22-knockout törzsek felhasználásával. Megmértük az ERG11 gének mRNS-szintjét, amelyet a TAF10 génnel mint belső kontrollal33 normalizáltunk. Az adatok azt mutatják, hogy az ERG11 mRNS-expressziós szintjei a várakozásoknak megfelelően korrelálnak az ERG2 promotor-aktivitásával és az ergoszterolszintekkel (3. kiegészítő ábra).

7. ábra: Ergoszterolszint és antibiotikum-rezisztencia.

Az Upc2 aktiválása rezisztenciát kölcsönöz a gombaellenes szerrel szemben

Az Upc2 aktiválása és a gombaellenes szerekkel szembeni rezisztencia közötti kapcsolat vizsgálatához ellenőriztük a vad típusú vagy mutáns UPC2 allélt kifejező upc2Δ ecm22Δ vagy ecm22Δ törzsek flukonazolérzékenységét (7c. ábra). Mivel a flukonazol az ergoszterol bioszintézis gátlásával zavarja az élesztősejtek növekedését, a sejtnövekedések általános mintázata összefüggést mutatott a flukonazollal kezelt sejtek szterolszintjével. Az upc2Δ ecm22Δ kettős knockout sejtek nem növekedtek flukonazol jelenlétében. A vad típusú UPC2 bevezetése 8 μg ml-1 fluconazol mellett gyenge sejtnövekedést tett lehetővé. A G888D mutánst expresszáló élesztősejtek 8 μg ml-1 flukonazollal szemben jelentősen megnövekedett rezisztenciát mutattak 8 μg ml-1 esetén. A G888D mutáns azonban gyengébben növekedett, mint a vad típus fluconazol hiányában, ami arra utal, hogy az Upc2 teljes konstitutív aktiválása nem szelektív körülmények között hátrányos, mivel metabolikus terhet ró rájuk34. A transzkripciós aktivitást nélkülöző ΔLBD mutáns nem növekedett a legalacsonyabb fluconazol koncentrációban. A szterolkötést zavaró L820W, L703F, M610R és ΔCT mutánsok érzékenyebbek voltak a flukonazolra, mint a vad típus. Az ECM22 allélt hordozó egyetlen upc2Δ-knockout törzs gyenge növekedést tett lehetővé alacsony fluconazol-koncentrációban, ami arra utal, hogy az ECM22-nek részben átfedő szerepe van az azolrezisztenciában szerepet játszó gének aktiválásában. A 6 μg ml-1-nél nagyobb fluconazol-koncentrációban azonban az upc2Δ és upc2Δ ecm22Δ törzsek nem mutattak szignifikáns különbséget az összes Upc2-konstrukció érzékenységében, ami arra utal, hogy az Upc2 domináns szerepet játszik a szterolszabályozásban. Ez összhangban van a korábbi megfigyelésekkel, miszerint az UPC2 deléciója ketokonazol érzékenységet eredményez, míg az ECM22 deléciója esetén nem volt megfigyelhető hatás, ami arra utal, hogy az Ecm22-nek és az Upc2-nek specifikus célpontjai vannak, amelyek bizonyos lényeges átfedő funkciókkal rendelkeznek35,36.

Az Upc2 a cink-ujj TF-ek új osztálya

A közelmúltban végzett vizsgálatok azt javasolták, hogy a gombák cink-klaszter transzkripciós regulátor családjának számos tagja a metazoa NR-ek funkcionális analógjai lehetnek13,18,19,20 .

Míg a gombák cink-klaszter TF-jei nem mutatnak nyilvánvaló szekvencia- vagy szerkezeti hasonlóságot a metazoai NR-ekkel, az Upc2 koncepcionális hasonlóságot mutat a szteroid NR-ekkel az általános doménarchitektúra, a szterol ligand-kötés, a homodimerizáció, a ligand-függő transzkripciós szabályozás és a nukleáris transzlokáció tekintetében.

Az Upc2 és a metazoai NR-ek egyaránt tartalmaznak cink-ujj DNS-kötő doméneket az N-terminális régiójukban. A két cinkiont koordináló cinkujjak az Upc2 esetében hat ciszteinből, az NRs37 esetében pedig a két ujj mindegyikében négy ciszteinből állnak. Az NR-ek és a cink-klaszter TF-ek DNS-kötő doménjei szerkezetileg hasonlóak, és homo- vagy heterodimerként kötődnek a DNS-hez13. A cink-ujj TF-ek C-terminális negatív szabályozó doménnel rendelkeznek, amely a család számos tagja esetében közvetíti a ligandumkötést vagy a kis molekulákra, például a sejtek metabolitjaira és a lipofil ligandumokra adott választ13. Az Upc2 transzkripciós aktivitását ergoszterin szabályozza, amely funkcionálisan hasonló az I. típusú szteroid NR-ekhez a ligand-specifitás tekintetében. Az Upc2 és a szteroid receptorok egyaránt homodimereket alkotnak. Az Upc2 konstitutív homodimereket képez, függetlenül a ligandumkötéstől. Az ösztrogén receptor α-ról azt jelentették, hogy még apo állapotban is dimerként létezik, és a ligandumkötés tovább stabilizálja a homodimert38.

Az Upc2 és az emlős szteroid NR-ek szerkezeti összehasonlítása azt mutatja, hogy az Upc2 az emlős NR-ektől eltérő α-hélixes LBD hajtással rendelkezik (4. kiegészítő ábra). Mindkét génregulátor főleg körülbelül 12 α-hélix szerkezetből áll, hasonló méretű LBD-kkel. Az Upc2, az ösztrogén- és a progeszteronreceptorok LBD-i a hélixköteg kölcsönhatások révén dimereket alkotnak. A dimerek általános konfigurációját leszámítva azonban, ahol a ligandumkötő helyek szorosan a dimer határfelületen helyezkednek el, nincs egyértelmű szerkezeti homológia az Upc2 és az NR-ek között. Ligandkötéskor a szteroid receptorok disszociálnak a citoszolban lévő Hsp90 hősokkfehérjéről, majd transzlokálódnak a sejtmagba, és homodimerként kötődnek a célgén promóteréhez17. Következésképpen az Upc2 transzlokációja a citoszolból a sejtmagba ligandfüggő módon szabályozott.

Az Upc2 LBD azonban teljesen más szerkezeti hajtást mutat, mint a metazoai NR-ek LBD-jei. A gombák cink-klaszter TF-jei és a metazoai NR-ek szekvencia- és szerkezeti hasonlóságának hiánya arra utal, hogy az architekturális és funkcionális hasonlóságok közös mechanikai stratégiával rendelkező konvergens evolúció termékei. A filogenetikai elemzés azt mutatja, hogy az Upc2 ortológjai csak a Saccharomycotina-n belül azonosíthatók, és az Upc2/Ecm22 fehérjék monofiletikus kládot alkotnak, amely nem áll szoros rokonságban a Saccharomycotina5 más Zn2-Cys6 fehérjéivel. A bimbós élesztő, az S. cerevisiae körülbelül 50 Zn2-Cys6 TF-et tartalmaz39. Bár az Upc2 szekvencia-homológiája más típusú cink-ujjas TF-ekkel alacsony, a C-terminális LBD-kben található egy konzervált, gombaspecifikus szekvencia, amelyet korábban MHR (middle homology region)40 néven ismertek. A C-terminális régió, beleértve az MHR-t is, a cink TF-ekben általában 13-15 α-hélix másodlagos szerkezeti elemet tartalmaz, ami arra utal, hogy az LBD jelenléte általános jellemzője ennek a fehérjecsaládnak. Összefoglalva, az Upc2 a cink-ujj TF-ek egy új osztályát képviselik, amelyek funkcionális analógiát mutatnak a metazoai szteroid receptorokkal.

Universe