Strukturel mekanisme for ergosterolregulering af svampes steroltransskriptionsfaktor Upc2

Upc2 er en specifik receptor for ergosterol

Upc2 og Ecm22 deler en høj grad af sekvensmæssig lighed i de N-terminale DNA-bindingsdomæner, der er karakteriseret ved et bevaret Zn(II)2-Cys6-zinkfingermotiv21. Den C-terminale konserverede region på ca. 300 aminosyrerester indeholder et transkriptionsaktiveringsdomæne (fig. 1a). Da Upc2’s transkriptionelle aktivitet er afhængig af ergosterolniveauet i cellen, antog vi, at CTD’en kan fungere som en LBD for ergosterol og regulere Upc2’s transkriptionelle aktivitet. Dehydroergosterol (DHE) er et naturligt sterol med iboende fluorescerende egenskaber, som findes i lave mængder i S. cerevisiae22,23. DHE ligner ergosterol meget i strukturelle og kemiske egenskaber med kun en enkelt dobbeltbindingsforskel, og det kan erstatte ergosterol i gær uden nogen funktionel interferens24. For at teste, om Upc2 binder direkte til gærsteroler, udførte vi den fluorescerende DHE-bindingsassay ved hjælp af oprensede CTD’er af rekombinant Upc2 (rest 598-913). Tryptophanrester af Upc2 blev exciteret ved 285 nm, og fluorescensspektret af DHE blev overvåget. Spektralanalysen afslørede, at tryptofanudslettelse ved 340 nm var ledsaget af tre emissionstoppe ved 354, 373 og 393 nm (fig. 1b). Disse toppe er karakteristiske for DHE, hvilket tyder på fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) fra Upc2 LBD til bundet DHE25,26. Upc2 LBD binder frit DHE med nanomolær affinitet som målt ved ligevægtsbindingseksperimenter (fig. 1b). Upc2 LBD ekstraherer og binder også DHE, der er indlejret i DOPC-liposomer (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), hvilket blev overvåget ved stigningen i fluorescensemission ved 375 nm, når Upc2 LBD blev tilsat DOPC:DHE-liposomer (fig. 1c,d). Når ikke-fluorescerende ergosterol blev tilsat til blandingen indeholdende DHE-bundet Upc2, blev fluorescensemissionen reduceret, hvilket indikerer, at ergosterol konkurrerer med DHE om bindingen til Upc2. Tilsætning af kolesterol havde imidlertid ingen indflydelse på DHE-bindingen, hvilket tyder på, at Upc2 ikke binder kolesterol. Andre steroler såsom 20-hydroxykolesterol, 25-hydroxykolesterol, hydrokortison og β-estradiol konkurrerede ikke med DHE, hvilket tyder på, at Upc2 LBD er en specifik receptor for svampesteroler såsom ergosterol og DHE (fig. 1e). For at undersøge Upc2’s DHE- og ergosteroludtrækningsegenskaber fra liposomerne med en fysiologisk lipidsammensætning af gærplasmamembraner27 overvågede vi desuden udtrækningen af DHE fra liposomerne med fosfatidylcholin/fosfatidylethanolamin/fosfatidylinositol/fosfatidylserin/DHE (40:40:10:8:2, mol %) og den kompetitive binding af ergosterol ved efterfølgende tilsætning af liposomerne med fosfatidylcholin/fosfatidylethanolamin/fosfatidylinositol/fosfatidylinositol/fosfatidylserin/ergosterol (25:25:10:10:10:30, mol %) ved 6.5 μM og 23 nM af henholdsvis liposomer og protein (Supplerende fig. 1). Upc2 binder DHE og ergosterol på en lignende måde som DOPC/DHE-liposomer. Ecm22, den nære homolog til Upc2, binder også til fri DHE på samme måde som Upc2 (fig. 1f).

(a) Skematisk præsentation af domænestrukturerne af Upc2 og Ecm22 i S. cerevisia (S.c.) og C. albicans (C.a.). (b) Bindingskurver af DHE for Upc2 LBD af wild-type og den C-terminale trunkationsmutant af Upc2 LBD (Δ878-913). Intensiteterne af fluorescensemission ved 375 nm af prøverne (λex=285 nm) blev plottet med stigende mængder DHE-koncentrationer. Hvert vist datapunkt er gennemsnittet af tre målinger med fejlstregninger, der repræsenterer s.d. Fit-kurver til datapunkterne blev beregnet på grundlag af en one-site-bindingsmodel. Et sæt fluorescensemissionsspektre for Upc2 LBD af vild type blev vist i det højre panel. Fem tryptofanrester, der er placeret inden for 15 Å fra bindingslommen, blev angivet med røde kugler i højre panel. (c) Realtidsmåling af DHE-ekstraktion af Upc2 LBD fra store DOPC-liposomer. Liposomerne indeholdt i alt 124 μM fosfatidylcholin og DHE i et 98:2-molforhold. Upc2 LBD blev tilsat til liposomerne med en slutkoncentration på 0,73 μM ved begyndelsen af den kinetiske måling. Ikke-fluorescerende ergosterol eller kolesterol blev tilsat til en slutkoncentration på 2,5 μM ved 40 min med henblik på kompetitiv binding til DHE. (d) Fluorescensemissionsspektre (λex=285 nm) af prøverne under og ved afslutningen af kinetikken er vist for c. (e) Fluorescensemissionsspektre (λex=285 nm) af forskellige steroler til kompetitiv binding til DHE. Den 0,6 μM Upc2 LBD blev belastet med 2,5 μM fri DHE. Tre forskellige linjer i hvert forsøg repræsenterer forskellige koncentrationer af konkurrerende ligander (25-hydroxykolesterol, 20-hydroxykolesterol, hydrokortison og β-estradiol) med henholdsvis 2,5, 4 og 10 μM. β-estradiol er en naturligt fluorescerende forbindelse. Asterisk angiver den iboende fluorescensemission af β-estradiol ved 310 nm (λex=285 nm). (f) Fluorescensemissionsspektre af Ecm22 LBD ved DHE-binding.

For at sammenligne sterol-ligandene identificeret ved in vitro-eksperimenter med den naturlige ligand fanget af Upc2 fra gærcellelysat karakteriserede vi den ligand ekstraheret af Upc2 ved hjælp af reversed-phase højtydende væskekromatografi (HPLC) og væskekromatografi-massespektroskopianalyser (Fig. 2). Den indfangede ligand var udelukkende ergosterol uden nogen påviselige arter af andre lipider. I betragtning af lighederne i strukturelle og kemiske egenskaber mellem ergosterol og DHE, og at ergosterol er langt mere rigeligt forekommende end DHE i gærceller, konkluderede vi, at ergosterol er en fysiologisk ligand for Upc2.

(a) HPLC-elutionsprofil i omvendt fase af ren ergosterolstandard (Sigma 45480) og den ligand, der er ekstraheret fra Upc2 LBD. (b) Massespektroskopianalyse af ergosterolstandard og ligand ekstraheret fra Upc2 LBD. Identifikation af den ligand, der blev fanget af Upc2, blev opnået ved sammenligning af kromatografiske egenskaber og massespektroskopi med referencestandarden og litteraturdata56. AMU, atomisk masseenhed; UV, ultraviolet.

Upc2 LBD viser en ny α-helikal fold

For at undersøge strukturen af den C-terminale LBD af Upc2 udførte vi de krystallografiske undersøgelser på forskellige C-terminale konstruktioner. Krystallerne af apo Upc2 LBD og ergosterol-bundet Upc2 LBD blev krystalliseret, men de blev ikke diffrakteret ved synkrotronstråling. For at forbedre diffraktionskvaliteten af Upc2 LBD-krystaller fremstillede vi et fusionsprotein (Upc2 LBD-T4L), hvor T4-lysozym erstatter den variable loop (resterne 715-725) i Upc2 (ref. 28). Upc2-T4L-fusionsprotein blev udtrykt stabilt og viste gode DHE-bindingsegenskaber (Fig. 3a), hvilket tyder på, at T4-lysozym-fusionen ikke forstyrrer ligandbindingen og proteinfoldningen. Strukturen af den C-terminale LBD af apo Upc2 (rester 598-878)-T4L, der mangler de C-terminale 35 rester, blev bestemt med en opløsning på 2,9 Å ved den enkelte anomale dispersionsmetode ved hjælp af selenomethioninmærkede krystaller. Den endelige struktur, der indeholder to Upc2-T4L-molekyler og 29 vandmolekyler i den asymmetriske enhed, blev raffineret til en R-faktor på 24,9 % (tabel 1).

(a) Fluorescensemissionsspektre af Upc2 LBD-T4L-fusionskonstrukt (rester 598-913) ved DHE-binding. (b) Samlet struktur af Upc2 LBD. Strukturen blev farvet med rød til blå baseret på sekundærstruktursuccessionen. T4-lysozym-fusionen i α5-α6-loop’en blev ikke vist af hensyn til klarheden. (c) Samlet struktur af Upc2 LBD-T4L dimer med cylindrisk repræsentation. Placeringen af den dybe hydrofobiske lomme i en af Upc2-protomererne er angivet med en sort cirkel. (d) Overfladerepræsentation af Upc2 LBD-monomeren. De rester, der udgør væggen af den hydrofobiske lomme, er vist med pinde. Den hydrofobiske lomme er vist i en grå overfladerepræsentation. Conc., koncentration; C-term, C-terminal; N-term, N-terminal.

Strukturen af apo Upc2 LBD viser en kugleformet α-helikal fold med en oval form (Fig. 3b). Upc2 LBD er sammensat af 11 α-helixer og forbindelsessløjfer. Der er en lille forudsagt α-helix (α12, rest 889-896) i den C-terminale loop-region, som ikke var medtaget i det krystalliserede konstrukt. De 11 α-helixer er arrangeret til at danne en lukket klemme, der skaber en dyb lomme i proteinets kerne. De første tre α-helixer udgør de N-terminale fingre, og helixerne α8-α9, α7 og α11 udgør de andre fingre i klemmen. De fire helixer α3-α6 udgør den centrale håndflade som et helikalt bundt. Loop α7-α8-sløjfen (rest 760-799) omgiver helikserne α8-α9 som den længste tilfældige spiral i strukturen. T4-lysozym, der erstatter ni rester i α5-α6-loopen, er tæt placeret på overfladen af Upc2 LBD (fig. 3c).

Strukturen af Upc2 LBD afslører en central hydrofob lomme omgivet af α-helixer (fig. 3d). Den dybe hydrofobiske lomme har et volumen på 287 Å3. Helikserne α5 og α6 udgør bunden af lommen, og helikserne α1-α2, α7, α9 og α11 udgør væggen af den hydrofobiske bindingslomme. Lommen er tilgængelig for et opløsningsmiddel med en lille pore på overfladen. Tilstedeværelsen af en hydrofob lomme tyder på, at den kan fungere som et bindingssted for små lipofile molekyler. En strukturel sammenligning af Upc2 med kendte strukturer i PDB ved hjælp af DALI-serveren fandt ikke beslægtede strukturer med Z-scorer >7, hvilket tyder på, at Upc2 LBD repræsenterer en ny fold af en LBD.

Upc2 LBD danner en konstitutiv homodimer

Størrelseseksklusionskromatografi (SEC)-analyse viste, at det rekombinante Upc2 LBD eller Upc2 LBD-T4L er en homogen dimer uden en påviselig monomer art, hvilket tyder på, at dimer Upc2 er en biologisk relevant form. Dimeren af Upc2 LBD indeholder to sterolbindingssteder, og ligandbindingen påvirkede ikke Upc2’s oligomeriske tilstand som analyseret ved SEC (fig. 4a). Der var to molekyler af Upc2 LBD-T4L, der var forbundet af en ikke-krystallografisk tofoldsakse i krystallernes asymmetriske enhed. Upc2 LBD dimeriseres ved hjælp af helikser α1 og α2, der danner et fire-helix-bundt i dimergrænsefladen (fig. 4b). N-terminalerne af Upc2 LBD-dimeren er eksponeret til den samme side nær midten af dimergrænsefladen. Dimergrænsefladen består hovedsagelig af hydrofobiske rester, der begraver 1 562 Å2 af overfladearealet ved grænsefladen (Fig. 4c). Met610 er placeret i midten af dimergrænsefladen. M610R-mutanten er en monomer i opløsning analyseret ved SEC, hvilket tyder på, at den dimer, der er observeret i krystalstrukturen, er i overensstemmelse med den, der er observeret i opløsning (Fig. 4a). LBD’erne af C. albicans Upc2 og S. cerevisiae Ecm22 er også dimerer i opløsning, og M506R-mutationen af C. albicans Upc2 førte til monomerisering af LBD’et. Bevaringen af de rester, der udgør dimergrænsefladen i Upc2-homologer, tyder på, at homodimerisering af LBD’er er et generelt træk ved disse proteiner (Supplerende figur 2).

(a) Profiler af SEC for LBD’er af S. cerevisiae (S.c.) Upc2, C. albicans (C.a.) Upc2 og S. cerevisiae Ecm22. Profiler for wild type og dimergrænseflademutanterne (M610R i S. cerevisiae Upc2 og L506R i C. albicans Upc2) er vist i henholdsvis blå og grøn. Profilerne for ergosterolbundne Upc2- og Ecm22 LBD’er er vist med røde linjer. Ergosterolbundne LBD’er blev fremstillet ved at blande oprensede LBD’er og ergosterol i et molforhold på 1:5, og blandingen blev inkuberet natten over inden SEC-analyse. (b) Sidebillede af Upc2 LBD-dimeren. (c) Detaljeret visning af Upc2-dimerens grænseflade. Den ene protomer er vist i regnbuefarve og den anden i hvidt.

Den C-terminale loop er essentiel for ligandbinding

Størstedelen af de konstitutive aktiveringsmutationer i S. cerevisiae Upc2 og C. albicans Upc2 er grupperet i den C-terminale loop mellem helix α11 og den forudsagte α12-helix21,29. Krystalstrukturen omfatter ikke denne C-terminale aktiveringsloop på 35 rester. For at undersøge den funktionelle betydning af denne C-terminale loop udførte vi ligandbindingsassays på de C-terminale deletionsmutanter af Upc2 LBD (Fig. 5a). Trunkering af de C-terminale 14 rester (Δ900-913) havde ingen indflydelse på ligandbinding. Imidlertid ophævede deletion af de C-terminale 35 rester (Δ879-913), herunder den forudsagte α12, DHE-binding, hvilket tyder på, at den C-terminale glycinrige loop og helix α12 er afgørende for ligandbinding (Fig. 5b). Desuden hindrede G888D, en konstitutiv aktiveringsmutation i α11-α12-loopen DHE-binding signifikant.

(a) Fluorescensemissionsspektre af forskellige mutanter på DHE-binding. Emissionsspektre på flere tidspunkter blev vist i forskellige farver. (b) Båndrepræsentation af den hydrofobiske lomme. Den hydrofobiske lomme er vist i grå overfladerepræsentation. Det spekulative spor af den C-terminale aktiveringsloop, der ikke var inkluderet i den krystalliserede konstruktion, er vist med røde prikker.

Krystalstrukturen af Upc2 LBD viser en dyb hydrofob lomme, der kan rumme et enkelt sterolmolekyle. Størrelsen af bindingslommen i apo Upc2 LBD, der mangler den C-terminale aktiveringsloop, er imidlertid lidt mindre end dimensionerne af ergosterol, hvilket indebærer, at Upc2 LBD må undergå en konformationsændring ved ligandbinding. For at identificere de strukturelle determinanter for Upc2’s sterolbinding forsøgte vi at co-krystallisere Upc2 LBD med ergosterol. På grund af den dårlige diffraktion af sterolbundne Upc2-krystaller var det imidlertid ikke muligt at bestemme strukturen af ligandkomplekset. Alternativt testede vi effekten af flere mutationer i den hydrofobiske lomme på sterolbinding. Mutation af rester distalt fra lommen, V699Y og R752A, havde ingen indflydelse på ligandbindingen. Mutation af rester i den hydrofobiske bindingslomme til voluminøse rester (L703F og L820W) reducerede DHE-binding signifikant, hvilket bekræftede, at den hydrofobiske lomme rummer sterol (Fig. 5b). Desuden ophævede M610R-mutationen helt sterolbindingen, hvilket antyder, at dimeriseringen af Upc2 LBD er nødvendig for sterolbinding. LBD’erne af alle Upc2-homologer i svampearter viser en høj grad af sekvensbevaring (Supplerende figur 2). Specifikt er de rester, der er placeret i dimeriseringsgrænsefladen, ligandbindingslommen og den C-terminale aktiveringsloop strengt konserveret.

Cytosolisk Upc2 relokaliserer til kernen ved aktivering

De unikke strukturelle og ligandbindende egenskaber ved Upc2 foreslog os, at Upc2 kan relokalisere til kernen ved ligandbinding i cytosolen. Vi undersøgte den cellulære lokalisering af Upc2 i fuld længde og dens mutanter under ergosterol-rige eller ergosterol-mangelfulde forhold. Tidligere var der flere modstridende rapporter om lokalisering af Upc2 i kernen, cytoplasmaet og perinukleære foci ved hjælp af den C-terminale grøn fluorescerende protein (GFP)-fusion30,31,32. De vigtigste determinanter for Upc2-lokalisering er imidlertid ikke blevet eksperimentelt defineret. For at undgå den funktionelle interferens af GFP med den C-terminale aktiveringsloop og ligandbinding blev GFP i denne undersøgelse mærket til Upc2’s N-terminus for at undgå funktionel interferens af GFP med den C-terminale aktiveringsloop og ligandbinding. Wild-type Upc2 er for det meste til stede i cytosolen med let nukleær lokalisering i 30% af cellepopulationen. Når gærcellerne blev dyrket i tilstedeværelse af 5 mM ergosterol, blev Upc2 lokaliseret næsten udelukkende til cytoplasmaet. Tilsætning af 4 μg ml-1 fluconazol til kulturmediet, som hæmmer biosyntesen af ergosterol, flyttede imidlertid lokaliseringen af Upc2 til kernen i en hel cellepopulation (Fig. 6). Upc2 indeholder et todelt nukleare lokaliseringssignal (NLS) opstrøms for sin Zn2-Cys6-klynge sekvens, der giver en iboende nukleær lokaliseringsegenskab. Deletion af NLS (rester 2-43) gjorde Upc2 fuldstændig cytosolisk. Desuden var den isolerede LBD (rester 598-913) eller konstruktionen uden NLS-DBD (konstruktionsrester 283-913) fuldstændig cytosolisk uanset sterolniveauet. I modsætning hertil viste deletion af det C-terminale LBD (ΔLBD, konstruktrester 1-559) en stærk nukleær lokalisering uafhængigt af sterolniveauet. Disse data tyder på, at det ergosterolbundne C-terminale LBD undertrykker den nukleare transport af Upc2 ved at hæmme NLS-funktionen. Dissociation af sterolligand fra Upc2 kan føre til eksponering af NLS eller frigøre Upc2 fra indfangning af cytosoliske proteiner til nuklear transport. Deletion af den C-terminale loop (Δ879-913), der afbryder ergosterolbindingen, førte til en beskeden nuklear lokalisering af Upc2. G888D eller mutationer i den sterolbindende lomme (L820W eller L703F) førte til stærk konstitutiv nukleær lokalisering af Upc2. M610R-mutationen, der afbryder dimerisering af LBD og ligandbinding, viser hovedsagelig nukleær lokalisering uanset sterolniveauet, hvilket tyder på, at dimerisering af Upc2 er afgørende for dens regulerende funktion. Konklusionen er, at disse observationer sammen med ligandbindingsassays tyder på, at sterolbinding er den vigtigste mekanisme i reguleringen af TF’s lokalisering. I en sterolrig tilstand er Upc2 bundet til ergosterol og er til stede i cytosolen som en undertrykt form. Ved udtømning af ergosterol aktiveres ubundet Upc2 og bevæger sig til kernen til transkriptionel aktivering af relaterede gener.

Cellerne blev dyrket i 4 μg ml-1 fluconazol eller 5 mM ergosterol i 12 timer før visualisering ved fluorescensmikroskopi. Øverste paneler viser lokaliseringen af GFP-Upc2. DAPI farvelægger både nukleært DNA som kugler og mitokondrie-DNA som lyse pletter, der skjuler træk af nukleær DNA-segregation. Kerne-DNA kan adskilles fra mitokondrie-DNA på grund af sin størrelse og form. Upc2’s nukleare lokalisering fremstår som lysegrønne kugler inde i cellerne. Skala bar, 3 μm.

Upc2 regulerer ergosterolniveauet i gærceller

Upc2 og Ecm22 binder til et konserveret 7-bp sterolregulerende element inden for promotorer af de fleste ERG-gener, herunder ERG2, ERG3 og ERG11 (refs 2, 21). For at undersøge mekanismen for transkriptionel regulering af Upc2 kontrollerede vi den transkriptionelle aktivitet af forskellige Upc2-konstruktioner ved hjælp af ERG2-LacZ som reporter (Fig. 7a). Wild-type Upc2 udviste en moderat transkriptionel aktivitet under normale vækstbetingelser. Fluconazolbehandling øger transkriptionsaktiviteten mere end to gange. Tomt plasmid eller deletion af det C-terminale LBD viste imidlertid en meget svag transkriptionsaktivitet, hvilket tyder på, at LBD er afgørende for Upc2’s transkriptionelle aktivitet. G888D-mutation viste, uanset fluconazolbehandling, en fuld konstitutiv aktivering af Upc2, som er 1,2 gange højere end den inducerede vildtype. Denne observation er i overensstemmelse med den tidligere rapport om, at CTD’en er afgørende for transkriptionsaktiveringen af Upc2 (ref. 21). M610R viste ingen stigning i transkriptionel aktivitet ved steroludtømning, hvilket tyder på, at dimerisering er afgørende for den regulerende funktion. Deletion af den C-terminale aktiveringsloop (ΔCT), der viser konstitutiv nukleær lokalisering, viste imidlertid mindst 30 % lavere transkriptionel aktivitet end uinduceret vild type. Desuden steg ΔCT’s transkriptionsaktivitet ikke ved fluconazolbehandling. Disse data tyder på, at den C-terminale aktiveringsloop ikke kun er afgørende for reguleringen af proteinlokalisering, men også for den fulde transkriptionsaktivitet af Upc2. Afbrydelse af sterolbinding med L703F eller L820W viste konstitutiv nukleær lokalisering. Transkriptionsaktiviteterne af disse mutanter var imidlertid 40 % mindre end den vilde type og blev ikke øget væsentligt ved fluconazolinduktion. Det ser ud til, at introduktion af voluminøse rester til sterolbindingslommen ikke kun forstyrrer sterolbindingen, men også forstyrrer den korrekte konformation af Upc2 for fuld transkriptionel aktivitet. Disse observationer sammen med ligandbindings- og cellelokaliseringsforsøg tyder på, at sterolbinding ikke kun regulerer proteinlokalisering, men også regulerer transkriptionel aktivitet af Upc2. For at bekræfte, at Upc2 er involveret i reguleringen af ergosterolniveauet i cellerne, kvantificerede vi det samlede ergosterolindhold i gærceller indeholdende wild-type eller mutant UPC2-alleler (Fig. 7b). Da Upc2 aktiverer ekspressionen af ergosterolbiosyntetiske gener, er det tænkeligt, at gærcellernes sterolniveau indirekte korrelerer med Upc2’s transkriptionelle aktivitet. I fravær af UPC2- og ECM22-generne var gærcellers sterolniveauer svagt påviselige, og tilsætning af 4 μg ml-1 fluconazol hindrede gærcellers vækst alvorligt. Wild-type Upc2 viste et lignende ergosterolniveau i cellen som L703F- og L820W-niveauerne i fravær af fluconazol. Fluconazolbehandlingen undertrykte ergosterolniveauet med omkring 40 % i vildtypen, L793F- og L820W-stammerne. Udskillelse af de C-terminale 35 rester (ΔCT) resulterede i et lidt højere ergosterolniveau end vildtypeceller. Fluconazol undertrykte imidlertid sterolniveauet i ΔCT- og M610R-mutantcellerne mere markant end i vildtypecellerne. Upc2, der manglede LBD, viste et vist basalniveau af sterolsyntese i fravær af fluconazol. Tilstedeværelsen af 4 μg ml-1 fluconazol hæmmer imidlertid sterolniveauet og cellevæksten betydeligt. Cellerne, der udtrykker G888D-mutanten, har tre gange højere ergosterolniveauer sammenlignet med cellerne, der udtrykker Upc2 af vildtypen. Ergosterolniveauerne var højere i fluconazolbehandlede G888D-mutantceller sammenlignet med dem, der blev fundet i wild-type celler dyrket uden fluconazol. Disse data tyder på, at G888D-mutationen konstitutivt aktiverer Upc2 til biosyntese af ergosterol, hvilket fører til en øget resistens over for azolsvampemidler. For at bekræfte, at Upc2 er involveret i reguleringen af genekspressionen af ergosterolbiosyntetiske enzymer, udførte vi kvantitativ genekspressionsanalyse af ERG11 ved realtids-PCR ved hjælp af upc2/ecm22-knockout-stammer med wild-type og muterede UPC2-alleler. Vi målte mRNA-niveauerne af ERG11-gener, der blev normaliseret med TAF10-genet som en intern kontrol33. Dataene viser, at mRNA-ekspressionsniveauerne af ERG11 korrelerer med promotoraktiviteterne af ERG2 og ergosterolniveauerne som forventet (Supplerende fig. 3).

(a) Transkriptionel aktivitet af Upc2. ERG2-lacZ-reportere blev anvendt til at bestemme bidraget fra hver Upc2-konstruktion til reguleringen af ERG2-promotoren. Der blev udført β-galactosidaseassays på hver enkelt transformant, efter at 5 ml kulturer var vokset i 16 timer enten i minimalt medium (uinduceret) eller i minimalt medium indeholdende 4 μg ml-1 fluconazol (induceret). Testværdierne repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter. Alle fejlstænger angiver s.d. P-værdier blev vurderet ved tosidet Student’s t-test. *P<0,05 i forhold til vild type, #P<0,05 i forhold til hver mutant uden fluconazol. (b) Kvantificering af total ergosterol i gærceller. Gær upc2Δ ecm22Δ-stammer, der indeholdt forskellige UPC2-alleler, blev analyseret for deres ergosterolindhold. Hvert datapunkt er et gennemsnit af tre målinger. Alle fejlstænger angiver s.d. P-værdier blev vurderet ved tosidet Student’s t-test. *P<0,05 i forhold til vild type, #P<0,05 i forhold til fluconazolbehandlet vild type. (c) Modtagelighed for fluconazol af gærstammer, der udtrykker wild-type eller mutant UPC2-allel. Stammerne blev oprindeligt dyrket uden fluconazol, og fortyndingsrækkerne blev spottet på agarpladerne indeholdende fluconazol og inkuberet i 36 timer.

Aktivering af Upc2 giver resistens over for svampemiddel

For at undersøge forholdet mellem aktivering af Upc2 og resistens over for svampemidler kontrollerede vi fluconazolmodtageligheden af upc2Δ ecm22Δ eller ecm22Δ stammer, der udtrykker wild-type eller mutant UPC2 alleles (fig. 7c). Da fluconazol interfererer med gærcellevækst ved at hæmme ergosterolbiosyntese, viste de overordnede mønstre af cellevækst en korrelation med sterolniveauerne i de celler, der blev behandlet med fluconazol. Dobbelt knockout-celler af upc2Δ ecm22Δ voksede ikke i tilstedeværelse af fluconazol. Indførelse af wild-type UPC2 tillod svag cellevækst ved 8 μg ml-1 fluconazol. De gærceller, der udtrykker en G888D-mutant, viste en betydelig forøgelse af resistens over for fluconazol ved 8 μg ml-1. G888D-mutanten voksede dog svagere end vildtypen i fravær af fluconazol, hvilket tyder på, at fuld konstitutiv aktivering af Upc2 er ufordelagtig under ikke-selektive forhold ved at pålægge en metabolisk byrde34. ΔLBD-mutanten, der mangler transkriptionsaktivitet, voksede ikke ved den laveste fluconazolkoncentration. L820W-, L703F-, M610R- og ΔCT-mutanter, der forstyrrer sterolbindingen, var mere modtagelige over for fluconazol end vildtypen. En enkelt upc2Δ-knockout-stamme med ECM22-allel tillod svag vækst i en lav koncentration af fluconazol, hvilket tyder på, at ECM22 har en delvis overlappende rolle i aktiveringen af gener, der er involveret i azolresistens. I fluconazolkoncentrationer højere end 6 μg ml-1 viste upc2Δ- og upc2Δ ecm22Δ-stammer imidlertid ikke signifikante forskelle i modtagelighed for alle Upc2-konstruktioner, hvilket tyder på, at Upc2 spiller en dominerende rolle i sterolreguleringen. Dette er i overensstemmelse med de tidligere observationer, at deletion af UPC2 resulterer i ketoconazolfølsomhed, mens der ikke blev observeret nogen effekt med ECM22-deletion, hvilket tyder på, at Ecm22 og Upc2 har specifikke mål med nogle væsentlige overlappende funktioner35,36.

Upc2 er en ny klasse af zinkfinger-TF’er

Den seneste undersøgelse foreslog, at flere medlemmer af svampezinkclusterfamilien af transkriptionsregulatorer kan repræsentere funktionelle analoger af metazoers NR’er13,18,19,20.

Mens svampes zinkcluster-TF’er ikke har nogen tilsyneladende sekvens- eller strukturel lighed med metazoernes NR’er, viser Upc2 konceptuelle ligheder med steroid NR’er i generelle domænearkitekturer, sterolligandbinding, homodimerisering, ligandafhængig transkriptionel regulering og nukleær translokation.

Upc2 og metazoernes NR’er indeholder begge zinkfinger DNA-bindingsdomæner i deres N-terminale regioner. Zinkfingre, der koordinerer to zinkioner, er sammensat af seks cysteiner for Upc2 og fire cysteiner i hver af de to fingre for NRs37. De DNA-bindende domæner for NR’er og Zink Cluster TF’er er strukturelt ens, og de binder til DNA som homo- eller heterodimere13. Zinkfinger-TF’er har et C-terminalt negativt reguleringsdomæne, som for en række familiemedlemmer formidler ligandbinding eller respons på små molekyler som f.eks. cellulære metabolitter og lipofile ligander13. Upc2’s transkriptionelle aktivitet reguleres af ergosterol, som funktionelt ligner type I steroid NR’er med hensyn til ligandspecificiteter. Upc2 og steroidreceptorer danner begge homodimere. Upc2 danner konstitutive homodimere uafhængigt af ligandbinding. Østrogenreceptor α er blevet rapporteret til at eksistere som en dimer selv i apo-tilstand, og ligandbindingen stabiliserer homodimeren yderligere38.

Strukturel sammenligning af Upc2 med pattedyrs steroid NR’er afslører, at Upc2 har en karakteristisk α-helikal fold af LBD fra pattedyrs NR’er (Supplerende figur 4). Begge genregulatorer er hovedsageligt sammensat af omkring 12 α-helikale strukturer med lignende dimensioner af LBD’er. LBD’er af Upc2, østrogen- og progesteronreceptorer danner dimere ved hjælp af helixbundtinteraktioner. Men bortset fra den overordnede konfiguration af dimere med ligandbindingssteder tæt på dimergrænsefladen er der ingen klar strukturel homologi mellem Upc2 og NR’erne. Ved ligandbinding dissocieres steroidreceptorer fra heat shock-proteinet Hsp90 i cytosolen og translokaliseres til kernen, hvor de binder sig til deres målgenpromotorer som homodimere17. Tilsvarende reguleres translokationen af Upc2 fra cytosol til kernen på en ligandafhængig måde.

Opc2 LBD viser imidlertid en helt anden strukturel fold sammenlignet med LBD’erne af metazoernes NR’er. Manglen på sekvens- og strukturelle ligheder mellem svampes Zink Cluster TF’er og metazoernes NR’er tyder på, at de arkitektoniske og funktionelle ligheder er et produkt af konvergent evolution med en fælles mekanistisk strategi. En fylogenetisk analyse viser, at Upc2’s ortologer kun kan identificeres inden for Saccharomycotina, og Upc2/Ecm22-proteinerne danner en monofyletisk klade, som ikke er nært beslægtet med andre Zn2-Cys6-proteiner fra Saccharomycotina5. Den spirende gær, S. cerevisiae, indeholder omkring 50 Zn2-Cys6 TF’er39. Selv om Upc2’s sekvenshomologi med andre typer zinkfinger-TF’er er lav, har de en konserveret svampespecifik sekvens inden for de C-terminale LBD’er, som tidligere var kendt som MHR (middle homology region)40. Den C-terminale region, herunder MHR, i zinkfinger-TF’er indeholder almindeligvis 13-15 α-helixer af sekundære strukturelementer, hvilket indebærer, at tilstedeværelsen af en LBD er et generelt træk ved denne proteinfamilie. Det kan konkluderes, at Upc2 repræsenterer en ny klasse af zinkfinger-TF’er, der udviser en funktionel analogi med metazoernes steroidreceptorer.