Strukturální mechanismus regulace ergosterolu houbovým sterolovým transkripčním faktorem Upc2

Upc2 je specifický receptor pro ergosterol

Upc2 a Ecm22 sdílejí vysokou úroveň sekvenční podobnosti v N-koncových DNA vazebných doménách charakterizovaných konzervovaným motivem zinkového prstu Zn(II)2-Cys621. C-koncová konzervovaná oblast o přibližně 300 aminokyselinových zbytcích obsahuje transkripční aktivační doménu (obr. 1a). Protože transkripční aktivita Upc2 závisí na hladině ergosterolu v buňce, předpokládali jsme, že CTD může sloužit jako LBD pro ergosterol a regulovat transkripční aktivitu Upc2. Dehydroergosterol (DHE) je přírodní sterol s vlastními fluorescenčními vlastnostmi, který se v S. cerevisiae vyskytuje v malém množství22,23 . DHE je strukturními a chemickými vlastnostmi velmi podobný ergosterolu, liší se pouze jednou dvojnou vazbou a může v kvasinkách nahradit ergosterol bez jakéhokoli funkčního zásahu24. Abychom otestovali, zda se Upc2 přímo váže na steroly kvasinek, provedli jsme fluorescenční test vazby DHE s použitím purifikovaných CTD rekombinantního Upc2 (zbytky 598-913). Tryptofanové zbytky Upc2 byly excitovány při vlnové délce 285 nm a bylo sledováno fluorescenční spektrum DHE. Spektrální analýza odhalila, že zhášení tryptofanu při 340 nm bylo doprovázeno vznikem tří emisních píků při 354, 373 a 393 nm (obr. 1b). Tyto píky jsou charakteristické pro DHE, což naznačuje fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET) z LBD Upc2 na vázaný DHE25,26. Upc2 LBD váže volný DHE s nanomolární afinitou, jak bylo změřeno pomocí rovnovážných vazebných experimentů (obr. 1b). Upc2 LBD také extrahuje a váže DHE zabudovaný v liposomech DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin), jak bylo sledováno zvýšením emise fluorescence při 375 nm, když byl Upc2 LBD přidán k liposomům DOPC:DHE (obr. 1c,d). Když byl ke směsi obsahující Upc2 navázaný na DHE přidán nefluoreskující ergosterol, emise fluorescence se snížila, což naznačuje, že ergosterol soutěží s DHE o vazbu na Upc2. Přidání cholesterolu však vazbu DHE neovlivnilo, což naznačuje, že Upc2 cholesterol neváže. Jiné steroly, jako 20-hydroxycholesterol, 25-hydroxycholesterol, hydrokortizon a β-estradiol, s DHE nekonkurovaly, což naznačuje, že Upc2 LBD je specifický receptor pro houbové steroly, jako je ergosterol a DHE (obr. 1e). Kromě toho, abychom prozkoumali vlastnosti extrakce DHE a ergosterolu Upc2 z liposomů s fyziologickým lipidovým složením plasmatických membrán kvasinek27 , sledovali jsme extrakci DHE z liposomů s fosfatidylcholinem/fosfatidyletanolaminem/fosfatidylinositolem/fosfatidylserinem/DHE (40. Příklad:40:10:8:2, mol %) a kompetitivní vazbu ergosterolu s následným přidáním liposomů s fosfatidylcholinem/fosfatidylethanolaminem/fosfatidylinositolem/fosfatidylserinem/ergosterolem (25:25:10:10:30, mol %) při 6. teplotě.5 μM a 23 nM liposomů a proteinu (doplňkový obr. 1). Upc2 váže DHE a ergosterol podobným způsobem jako liposomy DOPC/DHE. Ecm22, blízký homolog Upc2, se také váže na volný DHE stejným způsobem jako Upc2 (obr. 1f).

(a) Schematické znázornění doménových struktur Upc2 a Ecm22 v S. cerevisia (S.c.) a C. albicans (C.a.). (b) Vazebné křivky DHE pro divoký typ Upc2 LBD a C-terminální zkrácenou mutantu Upc2 LBD (Δ878-913). Intenzity emise fluorescence při vlnové délce 375 nm vzorků (λex=285 nm) byly vykresleny s rostoucím množstvím koncentrace DHE. Každý zobrazený datový bod je průměrem tří měření s chybovými úsečkami představujícími s.d. Fit křivky k datovým bodům byly vypočteny na základě modelu vazby na jedno místo. V pravém panelu byla zobrazena jedna sada fluorescenčních emisních spekter pro LBD divokého typu Upc2. Pět tryptofanových zbytků, které se nacházejí do 15 Å od vazebné kapsy, bylo na pravém panelu označeno červenými kuličkami. (c) Měření extrakce DHE v reálném čase pomocí Upc2 LBD z velkých liposomů DOPC. Liposomy obsahovaly celkem 124 μM fosfatidylcholinu a DHE v molárním poměru 98:2. Na začátku kinetického měření byl do liposomů přidán Upc2 LBD o konečné koncentraci 0,73 μM. Nefluoreskující ergosterol nebo cholesterol byl přidán na konečnou koncentraci 2,5 μM ve 40. minutě pro kompetitivní vazbu na DHE. (d) Fluorescenční emisní spektra (λex=285 nm) vzorků během a na konci kinetiky jsou znázorněna pro c. (e) Fluorescenční emisní spektra (λex=285 nm) různých sterolů pro kompetitivní vazbu na DHE. LBD Upc2 o koncentraci 0,6 μM byl zatížen 2,5 μM volného DHE. Tři různé linie v každém experimentu představují různé koncentrace kompetitivních ligandů (25-hydroxycholesterol, 20-hydroxycholesterol, hydrokortizon a β-estradiol) s 2,5, 4 a 10 μM. β-estradiol je přirozeně fluoreskující sloučenina. Hvězdička označuje vlastní fluorescenční emisi β-estradiolu při 310 nm (λex=285 nm). (f) Fluorescenční emisní spektra Ecm22 LBD při vazbě DHE.

Pro porovnání sterolových ligandů identifikovaných pomocí experimentů in vitro s přirozeným ligandem zachyceným Upc2 z lyzátu kvasinkových buněk jsme charakterizovali ligand extrahovaný Upc2 pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (HPLC) a analýz kapalinovou chromatografií s hmotnostní spektroskopií (obr. 2). Zachyceným ligandem byl výhradně ergosterol bez detekovatelných druhů jiných lipidů. Vzhledem k podobnosti strukturních a chemických vlastností ergosterolu a DHE a k tomu, že ergosterol je v kvasinkových buňkách mnohem hojnější než DHE, jsme dospěli k závěru, že ergosterol je fyziologickým ligandem pro Upc2.

(a) Eluční profil HPLC s obrácenou fází čistého standardu ergosterolu (Sigma 45480) a ligandu extrahovaného z LBD Upc2. (b) Hmotnostní spektroskopická analýza standardu ergosterolu a ligandu extrahovaného z Upc2 LBD. Identifikace ligandu zachyceného z Upc2 byla provedena porovnáním chromatografických vlastností a hmotnostní spektroskopie s referenčním standardem a literárními údaji56. AMU – atomová hmotnostní jednotka; UV – ultrafialové záření.

Upc2 LBD vykazuje nový α-helikální záhyb

Pro zkoumání struktury C-konce LBD Upc2 jsme provedli krystalografické studie na různých C-koncových konstrukcích. Krystaly apo Upc2 LBD a Upc2 LBD vázané na ergosterol byly vykrystalizovány, ale nedifraktovaly při synchrotronovém záření. Abychom zlepšili kvalitu difrakce krystalů Upc2 LBD, vytvořili jsme fúzní protein (Upc2 LBD-T4L), ve kterém T4 lysozym nahrazuje variabilní smyčku (zbytky 715-725) v Upc2 (ref. 28). Fúzní protein Upc2-T4L byl exprimován stabilně a vykazoval dobré vazebné vlastnosti pro DHE (obr. 3a), což naznačuje, že fúze s T4 lysozymem nenarušuje vazbu ligandu a skládání proteinu. Struktura C-koncové LBD apo Upc2 (zbytky 598-878)-T4L bez C-koncových 35 zbytků byla určena s rozlišením 2,9 Å metodou jednoduché anomální disperze pomocí krystalů značených selenometioninem. Konečná struktura obsahující dvě molekuly Upc2-T4L a 29 molekul vody v asymetrické jednotce byla rafinována s R-faktorem 24,9 % (Tabulka 1).

(a) Fluorescenční emisní spektra fúzního konstruktu Upc2 LBD-T4L (zbytky 598-913) při vazbě DHE. (b) Celková struktura Upc2 LBD. Struktura byla podbarvena červenou až modrou barvou na základě posloupnosti sekundární struktury. T4 lysozym fúzovaný ve smyčce α5-α6 nebyl pro přehlednost zobrazen. (c) Celková struktura Upc2 LBD-T4L dimeru s cylindrickým znázorněním. Umístění hluboké hydrofobní kapsy v jednom z protomerů Upc2 je vyznačeno černým kroužkem. (d) Povrchové znázornění monomeru Upc2 LBD. Zbytky tvořící stěnu hydrofobní kapsy jsou znázorněny tyčinkami. Hydrofobní kapsa je znázorněna šedým povrchovým znázorněním. Koncentrace, koncentrace; C-term, C-terminál; N-term, N-terminál.

Struktura apo Upc2 LBD vykazuje globulární α-helikální záhyb oválného tvaru (obr. 3b). LBD Upc2 se skládá z 11 α-šroubovic a spojovacích smyček. V oblasti C-koncové smyčky se nachází malý předpovězený α-helix (α12, zbytky 889-896), který nebyl zahrnut do krystalizovaného konstruktu. Jedenáct α-heliků je uspořádáno tak, že tvoří uzavřenou svorku, která vytváří hlubokou kapsu v jádře proteinu. První tři α-helices tvoří N-terminální prsty a helices α8-α9, α7 a α11 tvoří ostatní prsty svorky. Čtyři šroubovice α3-α6 tvoří centrální dlaň jako šroubovicový svazek. Smyčka α7-α8 (zbytky 760-799) obklopuje šroubovice α8-α9 jako nejdelší náhodná spirála ve struktuře. Lysozym T4 nahrazující devět zbytků ve smyčce α5-α6 se nachází těsně na povrchu Upc2 LBD (obr. 3c).

Struktura Upc2 LBD odhaluje centrální hydrofobní kapsu obklopenou šroubovicemi α (obr. 3d). Hluboká hydrofobní kapsa má objem 287 Å3. Šroubovice α5 a α6 tvoří dno kapsy a šroubovice α1-α2, α7, α9 a α11 tvoří stěnu hydrofobní vazebné kapsy. Kapsa je přístupná rozpouštědlu pomocí malého póru na povrchu. Přítomnost hydrofobní kapsy nám naznačila, že může sloužit jako vazebné místo pro malé lipofilní molekuly. Strukturní srovnání Upc2 se známými strukturami v PDB pomocí serveru DALI nenalezlo příbuzné struktury se Z skóre >7, což naznačuje, že Upc2 LBD představuje nové složení LBD.

Upc2 LBD tvoří konstitutivní homodimer

Analýza pomocí chromatografie vylučující velikost (SEC) prokázala, že rekombinantní Upc2 LBD nebo Upc2 LBD-T4L je homogenní dimer bez detekovatelné monomerní formy, což naznačuje, že dimerní Upc2 je biologicky relevantní forma. Dimer Upc2 LBD obsahuje dvě vazebná místa pro steroly a vazba ligandu neovlivnila oligomerní stav Upc2 analyzovaný pomocí SEC (obr. 4a). V asymetrické jednotce krystalů byly dvě molekuly Upc2 LBD-T4L spojené nekrystalografickou dvojnásobnou osou. Upc2 LBD dimerizuje pomocí šroubovic α1 a α2, které tvoří čtyřšroubovicový svazek na rozhraní dimeru (obr. 4b). N-konce dimeru Upc2 LBD jsou vystaveny na stejné straně poblíž středu dimerního rozhraní. Rozhraní dimeru je tvořeno převážně hydrofobními zbytky, které pohřbívají 1 562 Å2 povrchu na rozhraní (obr. 4c). Met610 se nachází ve středu dimerního rozhraní. Mutant M610R je v roztoku analyzovaném metodou SEC monomer, což naznačuje, že dimer pozorovaný v krystalové struktuře je v souladu s dimerem pozorovaným v roztoku (obr. 4a). LBD C. albicans Upc2 a S. cerevisiae Ecm22 jsou v roztoku také dimery a mutace M506R C. albicans Upc2 vedla k monomerizaci LBD. Zachování zbytků tvořících dimerní rozhraní u homologů Upc2 naznačuje, že homodimerizace LBD je obecnou vlastností těchto proteinů (doplňkový obr. 2).

(a) Profily SEC pro LBD S. cerevisiae (S.c.) Upc2, C. albicans (C.a.) Upc2 a S. cerevisiae Ecm22. Profily divokého typu a mutantů dimerního rozhraní (M610R u S. cerevisiae Upc2 a L506R u C. albicans Upc2) jsou zobrazeny modře a zeleně. Profily Upc2 a Ecm22 LBD vázaných na ergosterol jsou znázorněny červenými čarami. LBD vázané na ergosterol byly připraveny smícháním purifikovaných LBD a ergosterolu v molárním poměru 1:5 a směs byla před analýzou SEC inkubována přes noc. (b) Boční pohled na dimer Upc2 LBD. (c) Detailní pohled na rozhraní dimeru Upc2. Jeden protomer je zobrazen duhovou barvou a druhý bílou.

C-terminální smyčka je nezbytná pro vazbu ligandu

Většina konstitutivních aktivačních mutací u Upc2 S. cerevisiae a Upc2 C. albicans je soustředěna v C-terminální smyčce mezi šroubovicí α11 a předpokládanou šroubovicí α1221,29 . Krystalová struktura tuto C-terminální aktivační smyčku o 35 zbytcích neobsahuje. Abychom prozkoumali funkční význam této C-terminální smyčky, provedli jsme testy vazby ligandů na C-terminálních delečních mutantech Upc2 LBD (obr. 5a). Zkrácení C-koncových 14 zbytků (Δ900-913) nemělo vliv na vazbu ligandu. Avšak delece C-koncových 35 zbytků (Δ879-913), včetně předpokládaného α12, zrušila vazbu DHE, což naznačuje, že C-koncová smyčka bohatá na glycin a šroubovice α12 jsou pro vazbu ligandu nezbytné (obr. 5b). Navíc G888D, konstitutivní aktivační mutace ve smyčce α11-α12, významně inhibovala vazbu DHE.

(a) Fluorescenční emisní spektra různých mutantů na vazbu DHE. Emisní spektra v několika časových bodech byla znázorněna různými barvami. (b) Páskové znázornění hydrofobní kapsy. Hydrofobní kapsa je znázorněna šedým povrchovým znázorněním. Spekulativní stopa C-koncové aktivační smyčky, která nebyla zahrnuta do krystalizovaného konstruktu, je znázorněna červenými tečkami.

Krystalová struktura Upc2 LBD ukazuje hlubokou hydrofobní kapsu, která by mohla pojmout jednu molekulu sterolu. Velikost vazebné kapsy u apo Upc2 LBD postrádající C-terminální aktivační smyčku je však o něco menší než rozměry ergosterolu, což znamená, že Upc2 LBD musí při vazbě ligandu projít konformační změnou. Abychom identifikovali strukturní determinanty pro vazbu sterolu na Upc2, pokusili jsme se o ko-krystalizaci Upc2 LBD s ergosterolem. Vzhledem ke špatné difrakci krystalů Upc2 vázaných na sterol však nebylo možné určit strukturu komplexu s ligandem. Alternativně jsme testovali vliv několika mutací v hydrofobní kapse na vazbu sterolu. Mutace zbytků vzdálených od kapsy, V699Y a R752A, neměly na vazbu ligandu vliv. Mutace zbytků v hydrofobní vazebné kapse na objemná rezidua (L703F a L820W) významně snížily vazbu DHE, což potvrdilo, že hydrofobní kapsa pojme sterol (obr. 5b). Mutace M610R navíc zcela zrušila vazbu sterolů, což znamená, že pro vazbu sterolů je nutná dimerizace LBD Upc2. LBD všech homologů Upc2 u houbových druhů vykazují vysoký stupeň zachování sekvence (doplňkový obr. 2). Konkrétně jsou přísně konzervovány zbytky nacházející se v dimerizačním rozhraní, kapse pro vazbu ligandu a C-koncové aktivační smyčce.

Cytosolová Upc2 se při aktivaci relokalizuje do jádra

Unikátní strukturní a ligand-vazebné vlastnosti Upc2 nám naznačily, že Upc2 se může při vazbě ligandu v cytosolu relokalizovat do jádra. Zkoumali jsme buněčnou lokalizaci Upc2 plné délky a jeho mutantů za podmínek bohatých na ergosterol nebo s jeho nedostatkem. Dříve se objevilo několik protichůdných zpráv o lokalizaci Upc2 v jádře, cytoplazmě a perinukleárních fúzích s využitím C-koncového zeleného fluorescenčního proteinu (GFP)30,31,32 . Klíčové determinanty lokalizace Upc2 však nebyly experimentálně definovány. V této studii, aby se zabránilo funkční interferenci GFP s C-koncovou aktivační smyčkou a vazbou ligandu, byl GFP značen na N-konec Upc2. Divoký typ Upc2 je přítomen převážně v cytosolu s mírnou jadernou lokalizací u 30 % buněčné populace. Když byly kvasinkové buňky pěstovány v přítomnosti 5 mM ergosterolu, byl Upc2 lokalizován téměř výhradně v cytoplazmě. Přídavek 4 μg ml-1 flukonazolu do kultivačního média, který inhibuje biosyntézu ergosterolu, však posunul lokalizaci Upc2 do jádra v celé populaci buněk (obr. 6). Upc2 obsahuje dvoustranný jaderný lokalizační signál (NLS) před svou sekvencí klastru Zn2-Cys6, který mu propůjčuje vlastní jadernou lokalizační vlastnost. Delecí NLS (zbytky 2-43) se Upc2 stal zcela cytosolickým. Kromě toho izolovaná LBD (zbytky 598-913) nebo konstrukt postrádající NLS-DBD (konstrukt zbytky 283-913) byly zcela cytosolické bez ohledu na hladiny sterolů. Naproti tomu delece C-koncové LBD (ΔLBD, konstrukt zbytků 1-559) vykazovala silnou jadernou lokalizaci nezávisle na hladinách sterolů. Tato data naznačují, že C-koncová LBD vázaná na ergosterol potlačuje jaderný transport Upc2 inhibicí funkce NLS. Disociace sterolového ligandu od Upc2 může vést k expozici NLS nebo k uvolnění Upc2 ze záchytu cytosolickými proteiny pro jaderný transport. Delece C-koncové smyčky (Δ879-913), která narušuje vazbu ergosterolu, vedla ke skromné jaderné lokalizaci Upc2. G888D nebo mutace v kapse vázající sterol (L820W nebo L703F) vedly k silné konstitutivní jaderné lokalizaci Upc2. Mutace M610R, která narušuje dimerizaci LBD a vazbu ligandu, vykazuje převážně jadernou lokalizaci bez ohledu na hladinu sterolu, což naznačuje, že dimerizace Upc2 je nezbytná pro jeho regulační funkci. Závěrem lze říci, že tato pozorování spolu s testy vazby ligandů naznačují, že klíčovým mechanismem při regulaci lokalizace TF je vazba sterolů. Za podmínek bohatých na steroly je Upc2 vázán na ergosterol a je přítomen v cytosolu jako potlačená forma. Při vyčerpání ergosterolu se nevázaný Upc2 aktivuje a přesouvá se do jádra k transkripční aktivaci příbuzných genů.

Buňky byly pěstovány ve 4 μg ml-1 flukonazolu nebo 5 mM ergosterolu po dobu 12 h před vizualizací pomocí fluorescenční mikroskopie. Horní panely ukazují lokalizaci GFP-Upc2. DAPI barví jadernou DNA jako kuličky a mitochondriální DNA jako světlé skvrny, které zakrývají rysy segregace jaderné DNA. Jadernou DNA lze odlišit od mitochondriální DNA podle její velikosti a tvaru. Jaderná lokalizace Upc2 se jeví jako jasně zelené kuličky uvnitř buněk. Měřítko, 3 μm.

Upc2 reguluje hladinu ergosterolu v kvasinkových buňkách

Upc2 a Ecm22 se vážou na konzervovaný 7-bp sterolový regulační element v promotorech většiny genů ERG včetně ERG2, ERG3 a ERG11 (cit.2, 21). Abychom prozkoumali mechanismus transkripční regulace Upc2, ověřili jsme transkripční aktivitu různých konstruktů Upc2 pomocí ERG2-LacZ jako reportéru (obr. 7a). Divoký typ Upc2 vykazoval za normálních růstových podmínek mírnou transkripční aktivitu. Léčba flukonazolem zvyšuje transkripční aktivitu více než dvojnásobně. Prázdný plazmid nebo delece C-koncové LBD však vykazovaly velmi slabou transkripční aktivitu, což naznačuje, že LBD je pro transkripční aktivitu Upc2 nezbytná. Mutace G888D bez ohledu na ošetření flukonazolem vykazovala plnou konstitutivní aktivaci Upc2, která je 1,2krát vyšší než indukovaná u divokého typu. Toto pozorování je v souladu s předchozí zprávou, že CTD je nezbytná pro aktivaci transkripce Upc2 (cit.21 ). M610R nevykazovala žádné zvýšení transkripční aktivity při depleci sterolů, což naznačuje, že dimerizace je pro regulační funkci nezbytná. Delece C-koncové aktivační smyčky (ΔCT), která vykazuje konstitutivní jadernou lokalizaci, však vykazovala nejméně o 30 % nižší transkripční aktivitu než neindukovaný divoký typ. Kromě toho se transkripční aktivita ΔCT nezvýšila při léčbě flukonazolem. Tato data naznačují, že C-terminální aktivační smyčka je nezbytná nejen pro regulaci lokalizace proteinu, ale i pro plnou transkripční aktivitu Upc2. Přerušení vazby sterolu pomocí L703F nebo L820W ukázalo konstitutivní jadernou lokalizaci. Transkripční aktivita těchto mutantů však byla o 40 % nižší než u divokého typu a nebyla významně zvýšena při indukci flukonazolem. Zdá se, že zavedení objemných zbytků do sterolové vazebné kapsy nejen narušuje vazbu sterolu, ale také narušuje správnou konformaci Upc2 pro plnou transkripční aktivitu. Tato pozorování spolu s experimenty s vazbou ligandů a buněčnou lokalizací naznačují, že vazba sterolů reguluje nejen lokalizaci proteinu, ale také transkripční aktivitu Upc2. Abychom potvrdili, že se Upc2 podílí na regulaci hladiny ergosterolu v buňkách, kvantifikovali jsme celkový obsah ergosterolu v kvasinkových buňkách obsahujících divoký typ nebo mutantní alely UPC2 (obr. 7b). Protože Upc2 aktivuje expresi genů pro biosyntézu ergosterolu, lze předpokládat, že hladina sterolu v kvasinkových buňkách nepřímo koreluje s transkripční aktivitou Upc2. Při absenci genů UPC2 a ECM22 byly hladiny sterolů kvasinkových buněk slabě detekovatelné a přídavek 4 μg ml-1 flukonazolu silně inhiboval růst kvasinkových buněk. Divoký typ Upc2 vykazoval v nepřítomnosti flukonazolu podobnou hladinu ergosterolu v buňce jako geny L703F a L820W. Ošetření flukonazolem potlačilo hladinu ergosterolu přibližně o 40 % u divokého typu, kmenů L793F a L820W. Delece 35 C-koncových zbytků (ΔCT) vedla k mírně vyšší hladině ergosterolu než u divokého typu buněk. Flukonazol však výrazněji potlačil hladinu sterolu v buňkách mutantů ΔCT a M610R než v buňkách divokého typu. Upc2 postrádající LBD vykazoval určitou bazální úroveň syntézy sterolu v nepřítomnosti flukonazolu. Přítomnost 4 μg ml-1 flukonazolu však hladinu sterolů a růst buněk výrazně inhibovala. Buňky exprimující mutant G888D měly třikrát vyšší hladinu ergosterolu ve srovnání s buňkami exprimujícími Upc2 divokého typu. Hladiny ergosterolu byly vyšší v buňkách mutanta G888D ošetřených flukonazolem ve srovnání s hladinami zjištěnými v buňkách divokého typu pěstovaných bez flukonazolu. Tyto údaje naznačují, že mutace G888D konstitutivně aktivuje Upc2 pro biosyntézu ergosterolu, což vede ke zvýšené odolnosti vůči azolovým antimykotikům. Abychom potvrdili, že Upc2 se podílí na regulaci genové exprese enzymů biosyntetizujících ergosterol, provedli jsme kvantitativní analýzu genové exprese ERG11 pomocí PCR v reálném čase s použitím kmenů s knockoutem Upc2/ecm22 s divokým typem a mutovanými alelami UPC2. Měřili jsme hladiny mRNA genů ERG11, které jsme normalizovali pomocí genu TAF10 jako vnitřní kontroly33. Data ukazují, že hladiny exprese mRNA ERG11 korelují s promotorovou aktivitou ERG2 a hladinou ergosterolu, jak se očekávalo (doplňkový obr. 3).

(a) Transkripční aktivita Upc2. Ke stanovení příspěvku jednotlivých konstruktů Upc2 k regulaci promotoru ERG2 byly použity reportéry ERG2-lacZ. β-Galaktosidázové testy byly provedeny na jednotlivých transformantech poté, co byly 5 ml kultury pěstovány po dobu 16 h buď v minimálním médiu (neindukované), nebo v minimálním médiu obsahujícím 4 μg ml-1 flukonazolu (indukované). Hodnoty testů představují průměr ze tří nezávislých pokusů. Všechny chybové úsečky označují s.d. Hodnoty P byly vyhodnoceny dvouvýběrovým Studentovým t-testem. *P<0,05 oproti divokému typu, #P<0,05 oproti každému mutantu bez flukonazolu. (b) Kvantifikace celkového ergosterolu v kvasinkových buňkách. Kmeny kvasinek upc2Δ ecm22Δ obsahující různé alely UPC2 byly analyzovány na obsah ergosterolu. Každý datový bod je průměrem tří měření. Všechny chybové úsečky označují s.d. Hodnoty P byly vyhodnoceny dvouvýběrovým Studentovým t-testem. *P<0,05 oproti divokému typu, #P<0,05 oproti divokému typu ošetřenému flukonazolem. (c) Citlivost k flukonazolu u kmenů kvasinek exprimujících divoký typ nebo mutantní alelu UPC2. Kmeny byly nejprve kultivovány bez flukonazolu a série ředění byly naneseny na agarové plotny obsahující flukonazol a inkubovány po dobu 36 hodin.

Aktivace Upc2 propůjčuje rezistenci k antimykotikům

Pro zkoumání vztahu mezi aktivací Upc2 a rezistencí k antimykotikům jsme ověřili citlivost k flukonazolu u kmenů upc2Δ ecm22Δ nebo ecm22Δ exprimujících divoký typ nebo mutantní alelu UPC2 (obr. 7c). Protože flukonazol zasahuje do růstu kvasinkových buněk tím, že inhibuje biosyntézu ergosterolu, vykazovaly celkové vzorce růstu buněk korelaci s hladinami sterolů v buňkách ošetřených flukonazolem. Dvojitě knokautované buňky upc2Δ ecm22Δ v přítomnosti flukonazolu nerostly. Vnesení divokého typu UPC2 umožnilo slabý růst buněk při 8 μg ml-1 flukonazolu. Kvasinkové buňky exprimující mutant G888D vykazovaly výrazné zvýšení rezistence vůči flukonazolu při 8 μg ml-1. Mutant G888D však rostl slaběji než divoký typ v nepřítomnosti flukonazolu, což naznačuje, že plná konstitutivní aktivace Upc2 je za neselektivních podmínek nevýhodná tím, že způsobuje metabolickou zátěž34. Mutant ΔLBD postrádající transkripční aktivitu nerostl při nejnižší koncentraci flukonazolu. Mutanty L820W, L703F, M610R a ΔCT, které zasahují do vazby sterolů, byly citlivější k flukonazolu než divoký typ. Jediný upc2Δ-knockout kmen nesoucí alelu ECM22 umožňoval slabý růst při nízké koncentraci flukonazolu, což naznačuje, že ECM22 má částečně překrývající úlohu při aktivaci genů podílejících se na rezistenci k azolům. V koncentracích flukonazolu vyšších než 6 μg ml-1 však kmeny upc2Δ a upc2Δ ecm22Δ nevykazovaly významné rozdíly v citlivosti všech konstruktů Upc2, což naznačuje, že Upc2 hraje dominantní roli v regulaci sterolů. To je v souladu s předchozími pozorováními, že delece UPC2 vede k citlivosti na ketokonazol, zatímco při deleci ECM22 nebyl pozorován žádný účinek, což naznačuje, že Ecm22 a Upc2 mají specifické cíle s některými zásadními překrývajícími se funkcemi35,36.

Upc2 je nová třída TF se zinkovým prstem

Nedávné studie navrhly, že několik členů rodiny houbových transkripčních regulátorů se zinkovým klastrem může představovat funkční analogy metazoánských NR13,18,19,20 .

Ačkoli houbové zinkové klastrové TF nemají žádnou zjevnou sekvenční ani strukturní podobnost s metazoánními NR, Upc2 vykazuje koncepční podobnost se steroidními NR v obecné architektuře domén, vazbě sterolových ligandů, homodimerizaci, transkripční regulaci závislé na ligandu a jaderné translokaci.

Upc2 i metazoánní NR obsahují ve svých N-koncových oblastech DNA vazebné domény zinkových prstů. Zinkové prsty koordinující dva zinečnaté ionty se skládají ze šesti cysteinů u Upc2 a čtyř cysteinů v každém ze dvou prstů u NRs37. DNA vazebné domény NRs a zinkových klastrů TF jsou strukturně podobné a vážou se na DNA jako homo- nebo heterodimery13. TF se zinkovými prsty mají C-koncovou negativní regulační doménu, která u řady členů rodiny zprostředkovává vazbu ligandu nebo odpověď na malé molekuly, jako jsou buněčné metabolity a lipofilní ligandy13. Transkripční aktivita Upc2 je regulována ergosterolem, který je funkčně podobný steroidním NR typu I, pokud jde o ligandovou specifitu. Upc2 i steroidní receptory tvoří homodimery. Upc2 tvoří konstitutivní homodimery bez ohledu na vazbu ligandu. Bylo zjištěno, že estrogenový receptor α existuje jako dimer i v apo stavu a vazba ligandu homodimer dále stabilizuje38.

Strukturní srovnání Upc2 se savčími steroidními NR ukazuje, že Upc2 má od savčích NR odlišné α-helikální složení LBD (doplňkový obr. 4). Oba genové regulátory se skládají převážně z přibližně 12 α-helikálních struktur s podobnými rozměry LBD. LBD Upc2, estrogenových a progesteronových receptorů tvoří dimery pomocí interakcí šroubovicových svazků. Kromě celkové konfigurace dimerů s vazebnými místy pro ligandy umístěnými těsně u rozhraní dimerů však mezi Upc2 a NR neexistuje žádná jasná strukturní homologie. Při vazbě ligandu steroidní receptory disociují od proteinu tepelného šoku Hsp90 v cytosolu a přemisťují se do jádra, kde se vážou na promotory svých cílových genů jako homodimery17. V souladu s tím je translokace Upc2 z cytosolu do jádra regulována v závislosti na ligandu.

LBD Upc2 však vykazuje zcela odlišné strukturní složení ve srovnání s LBD metazoánských NR. Nedostatek sekvenčních a strukturních podobností houbových zinkových klastrových TF a metazoánských NR naznačuje, že architektonické a funkční podobnosti jsou produktem konvergentní evoluce se společnou mechanistickou strategií. Fylogenetická analýza ukazuje, že ortologové Upc2 jsou identifikovatelní pouze v rámci Saccharomycotina a proteiny Upc2/Ecm22 tvoří monofyletický klad, který není blízce příbuzný s žádnými jinými Zn2-Cys6 proteiny Saccharomycotina5. Pupenatá kvasinka S. cerevisiae obsahuje přibližně 50 Zn2-Cys6 TF39. Přestože sekvenční homologie Upc2 s ostatními typy TF se zinkovými prsty je nízká, obsahují konzervovanou sekvenci specifickou pro houby v rámci C-koncové LBD, která byla dříve známá jako MHR (middle homology region)40. C-koncová oblast včetně MHR u zinkových TF běžně obsahuje 13-15 α-šroubovic s prvky sekundární struktury, z čehož vyplývá, že přítomnost LBD je obecným rysem této rodiny proteinů. Závěrem lze říci, že Upc2 představují novou třídu TF se zinkovými prsty, které vykazují funkční analogii s metazoánskými steroidními receptory.

.