Mutationer i FLNB orsakar boomerangdysplasi | Journal of Medical Genetics

Boomerangdysplasi (OMIM #112310) är en dödlig skelettdysplasi som kännetecknas av oorganiserad skelettförbening.1 Karakteristiska radiologiska fynd inkluderar oregelbunden ossifiering av extremitetsbenen och kotorna, underutveckling av acetabulum och hypoplastiska, boomerangformade femora, varifrån sjukdomen har fått sitt namn.1 Minst åtta fall har hittills beskrivits i litteraturen.1-8 En liknande dödlig skelettdysplasi, Piepkorn dysplasi,9 har föreslagits vara allelisk till boomerang dysplasi.2,7 Broskhistologin visar både desorganiserade broskanlagor i det långa benet som utvecklas och frekventa flerkärniga kondrocyter i tillväxtplattans reservzon.1 Andra utvecklingsavvikelser utanför skelettet har beskrivits, bland annat omfalocele och encefalocele.

Similariteter i de radiografiska och histologiska fynden av boomerangdysplasi och atelosteogenes I (AOI; OMIM #108720) och III (AOIII; OMIM #108721) har föreslagit allelism för dessa störningar.2,10 I alla tre enheterna omfattar röntgenfynden bristfällig och oregelbunden förbening av ben och kotkroppar med distal humerushypoplasi och leddislokationer utöver kraniofaciala avvikelser.11 Dessutom har multinuklade kondrocyter observerats i både AOI och boomerangdysplasi. Boomerangdysplasi skiljer sig från AO på grundval av en allvarligare defekt i mineraliseringen, med fullständig avsaknad av förbening i vissa lemmar och kottsegment.3 En övervikt av män bland rapporterade fall av boomerangdysplasi7 och vissa fenotypiska likheter med otopalatodigitala syndromspektrumstörningar som orsakas av mutationer i FLNA-genen12,13 föreslog för vissa författare en X-anknuten etiologi.7

Nyligen beskrev vi sambandet mellan mutationer i genen som kodar för det 280 kDa cytoskeletala proteinet filamin B och flera sjukdomar som kännetecknas av skelettdefekter och ledförskjutningar.14 Filamin B är ett modulärt protein. En aktinbindande domän som består av två calponinhomologidomäner (CH1 och CH2) finns vid aminoterminen, följt av en stavdomän som består av 24 strukturellt homologa upprepningar och som avslutas i en karboxyterminal dimeriseringsdomän.15 Den aktinbindande domänen i filamin B liknar de som finns i andra cytoskeletala proteiner, såsom β-spektrin, dystrofin och α-actinin-4.

Fyra distinkta tillstånd har tillskrivits mutationer i FLNB: AOI, AOIII, recessivt nedärvda spondylcarpotarsala syndromet (OMIM #272460) och en dominant form av Larsens syndrom (OMIM #150250). Individer med AOI, AOIII och dominant ärftligt Larsens syndrom visade sig vara heterozygota för missense-mutationer i FLNB.14 Majoriteten av de mutationer som leder till AOI eller AOIII leder till substitutioner som är lokaliserade till CH2-domänen i filamin B:s aktinbindande domän. Det enda undantaget är mutationen 2251G→C, som är lokaliserad i exon 15, och som förutspås leda till substitutionen G751R i repetitionsupprepning 6, och som hittades hos en individ med AOIII.14 Under det arbete som identifierade gruppen av sjukdomar som beror på mutationer i FLNB bedömdes en individ med boomerangdysplasi för mutationer genom direkt sekvensering, men ingen mutation identifierades.14

Med tanke på de radiografiska, fenotypiska och histologiska bevisen som tyder på att bumerangdysplasi är relaterad till störningar som orsakas av mutationer i gener som kodar för filaminer, undersökte vi två individer med bumerangdysplasi för mutationer i FLNA och FLNB med hjälp av denaturerande högpresterande vätskekromatografi (DHPLC-analys) som screeningsmetod.

Individen 1 var det fall som tidigare undersökts genom direktsekvensering. Detta manliga foster var det första barnet till icke-konsanguina, friska föräldrar. Ultraljudsundersökningar i andra trimestern avslöjade thorakal hypoplasi och markant förkortning av alla lemmar med oregelbunden förbening av flera skelettelement. Fostret föddes vid 22 veckors graviditet. Post mortem-analysen visade på en uttalad thorakal hypoplasi, korta lemmar och den karakteristiska ansiktsdysmorfism som förknippas med boomerangdysplasi. Det fanns ingen encefalocoele eller omfalocoele. De radiografiska fynden var typiska för boomerangdysplasi (fig 1).

Individen 2 var ett foster i 17 veckors graviditet, som tidigare rapporterats i detalj av Wessels et al.8 Detta foster uppvisade allvarlig mikromeli med två av de tre långa tubulära benen som saknades i alla fyra lemmarna. Vid röntgenundersökning var de återstående strålbenen boomerangformade, skenbenen var segmentliknande, ryggraden var dåligt förbenad och bröstkorgen var hypoplastisk. Histologiskt var broskmatrisen hypocellulär med förekomst av multinukleära jättekondrocyter.

De kodande regionerna och intron-exon-splitsförbindelserna för både FLNA och FLNB amplifierades från genomiskt DNA som erhållits från båda fallen med hjälp av introniska primers som beskrivits tidigare13,14 (reaktionsbetingelser och primersekvenser finns tillgängliga på begäran). För analys av FLNA visualiserades amplikonprodukterna genom agarosgelelektrofores och blandades sedan med lika stora mängder PCR-amplifierade produkter från en obesläktad frisk manlig kontroll före heteroduplexbildning. Proverna genomgick DHPLC på ett WAVE DNA-fragmentanalyssystem (Transgenomic Inc.) i enlighet med tillverkarens anvisningar. Amplikoner som uppvisar onormala spårformer amplifierades på nytt och sekvenserades i en ABI 3100-sekvensator. Identifierade mutationer bekräftades genom restriktionsenzymdigest av amplifierat DNA, och föräldraskapet bekräftades som deklarerat för fall 1 genom segregering av sex obundna mikrosatellitmarkörer. Föräldraprover fanns inte tillgängliga för fall 2. Denna studie godkändes av Otagos etiska kommitté.

Undersökning av FLNB (exoner 1-46) avslöjade mutationer hos båda personerna. I fall 1 visade sig individen vara heterozygot för mutationen 512T→G, som förutspås leda till substitutionen L171R. Denna mutation skapar en plats för restriktionsenzymet HpaII, vilket gjorde det möjligt att visa att den hade uppstått de novo i denna familj (fig. 2), vilket ger genetiska bevis för patogenicitet. I efterhand kan man konstatera att denna mutation fanns med i den ursprungliga analysen, men att den förbisågs. Den andra mutationen, 703T→C, hittades i exon 4 i fall 2 och förutsäger substitutionen S235P (fig 2). Föräldraprover fanns inte tillgängliga, men denna mutation fanns inte i 100 kontrollkromosomer. Båda mutationerna förutspås förändra rester inom CH2-regionen i filamin B:s aktinbindande domän. Dessa rester är mycket evolutionärt konserverade bland filaminer från vertebrater (fig. 3). Mutationerna tyder på att dessa aminosyror spelar en kritisk roll i aktinbindningsdomänens funktion. För 703T→C-mutationen har samma substitution observerats vid den analoga restsubstansen i ACTN4, en gen som kodar för cytoskelettets adapterprotein α-actinin-4 (fig. 3), hos en patient med fokal och segmentell glomeruloskleros.16

Sjukdomsrelaterade substitutioner inom filamin B:s aktinbindande domän leder till en mångfald av fenotyper. Tidigare har vi rapporterat substitutioner som leder till AOI (n = 3), AOIII (n = 1) och Larsens syndrom (n = 2).14 Alla dessa fenotyper är förknippade med defekter i skeletogenes och ledbildning. Identifieringen av mutationer som leder till substitutioner inom filamin B:s aktinbindande domän hos två patienter med boomerangdysplasi bekräftar att detta tillstånd är alleliskt till dessa störningar, vilket återspeglar tidigare kliniska misstankar om släktskap.2,3

En del av de mutationer som orsakar det otopalatodigitala spektrumet av skelettstörningar ligger inom den analoga CH2-regionen i FLNA. Dessa mutationer leder också till ett brett spektrum av fenotypisk svårighetsgrad.13 Det finns ingen enkel korrelation mellan placeringen av dessa mutationer och svårighetsgraden av de resulterande defekterna i skelettets ossifikation. Även om otopalatodigitalt syndrom typ 1 manifesterar sig mildare än otopalatodigitalt syndrom typ 2, kan dessa tillstånd resultera av substitutioner på rester i nära anslutning till varandra eller till och med på samma rest.13,17 Observationen att mutationer i FLNB:s aktinbindande domän också kan leda till ett brett spektrum av allvarlighetsgrad rekapitulerar detta mönster. Den substitution som förutsägs av den mutation som hittades hos individ 1, L171R, ligger i nära anslutning till platsen för en substitution (A173V) som orsakar AOI.14 På samma sätt ligger S235P-substitutionen som rapporteras här inom samma proteinveck som E227K, en substitution som är förknippad med den mindre allvarliga, icke-dödliga fenotypen, Larsens syndrom.14 Trots rapporter om sjukdomsrelaterade substitutioner i rester inom CH2 i den aktinbindande domänen för dystrofin, α-aktinin-4,17 filamin A,13 och filamin B,14 har en funktionell roll för detta proteinveck inte slutgiltigt klarlagts. Eftersom CH2-domäner inte har några inneboende aktinbindande egenskaper i isolering har det postulerats att CH2:s roll i aktinbindningen i bästa fall är indirekt.18

Filaminer agerar i första hand för att stabilisera aktin i cellen, antingen som parallella buntar eller ortogonala gelenätverk.19,20 Flera bindningspartners har identifierats för filamin A, varav den stora majoriteten associerar genom filaminrepetitioner 16-24 (granskad i Stossel et al21). Fem bindningspartners har visat sig associera med filamin B: aktin, FBLP-1,22 presenilin (PS1 och PS2),23 och GPIβα.24 Det återstår att se om mutationer inom de aktinbindande domänerna hos filamin A och B utövar sin patogena effekt främst genom att störa aktinbindningen eller genom ett funktionellt beroende mellan aktinassociation och bindningsinteraktioner med andra proteiner.

Multinukleära jätteceller hittas bland kondrocyter i tillväxtplattan hos individer med boomerangdysplasi. Dessa utseenden kan bero på defekt cellklyvning under proliferationen av kondrocyter inom den epifysiska tillväxtplattan. Vi har tidigare påvisat ett utbrett uttryck av FLNB i tillväxtplattan och framför allt i klyvningsfåran hos delande kondrocyter.14 Processen med förändrad cellklyvning som leder till både defekt skelettmönster och mineralisering i gruppen av störningar med boomerangdysplasi/atelosteogenes återstår att belysa.

Identifieringen av mutationer som orsakar boomerangdysplasi i FLNB bekräftar att boomerangdysplasi är en del av kondrodysplasispektrumet, inklusive AOI och III, och det icke-dödliga Larsen-syndromet. Fenotypisk överlappning mellan boomerangdysplasi och AO, som rapporterats här och tidigare, och samlokaliseringen av mutationer som ligger till grund för dessa sjukdomar i exoner som kodar för den aktinbindande domänen i FLNB tyder på ett klinisk-patologiskt spektrum för dessa sjukdomar. Denna ytterligare breddning av det fenotypiska spektrum som är förknippat med mutationer i FLNB belyser betydelsen av ett funktionellt aktincytoskelett för många normala morfogenetiska processer, inklusive skeletogenes.