FLNB:n mutaatiot aiheuttavat bumerangin dysplasiaa | Journal of Medical Genetics

Bumerangin dysplasia (OMIM #112310) on kuolemaan johtava luuston dysplasia, jolle on ominaista luuston epäjärjestynyt luutuminen.1 Tyypillisiä radiologisia löydöksiä ovat raajojen luiden ja nikamien epäsäännöllinen luutuminen, acetabulumin alikehittyneisyys ja hypoplastiset, bumerangin muotoiset reisiluut, mistä häiriö on saanut nimensä.1 Kirjallisuudessa on tähän mennessä kuvattu ainakin kahdeksan tapausta.1-8 Samankaltaista kuolemaan johtavaa luuston dysplasiaa, Piepkornin dysplasiaa,9 on ehdotettu bumerangin dysplasian alleeliksi.2,7 Rustohistologiassa on havaittavissa sekä kehittyvän pitkän luun epäjärjestäytyneitä rustoaineksia että kasvulevyn reservivyöhykkeessä usein esiintyviä monitumaisia kondrosyyttejä.1 Muitakin luuston ulkopuolisia kehityshäiriöitä on kuvattu, mukaan lukien omphalocele ja encephalocele.

Bumerangin dysplasian ja atelosteogeneesi I:n (AOI; OMIM #108720) ja III:n (AOIII; OMIM #108721) röntgenkuvauksen ja histologisten löydösten samankaltaisuudet ovat antaneet viitteitä siitä, että näissä häiriöissä vallitsee allelismi2,10 . Kaikissa kolmessa tapauksessa röntgenologisiin löydöksiin kuuluu luiden ja nikamavartaloiden puutteellinen ja epäsäännöllinen luutuminen, johon liittyy distaalinen humeraalihypoplasia ja nivelten sijoiltaanmeno kraniofaktisten poikkeavuuksien lisäksi.11 Lisäksi sekä AOI:ssa että bumerangidysplasiassa on havaittu monitumaisia kondrosyyttejä. Boomerangin dysplasia eroaa AO:sta sen perusteella, että mineralisaatiovirhe on vakavampi ja luutuminen puuttuu kokonaan joistakin raajojen osista ja nikamasegmenteistä.3 Raportoitujen boomerangin dysplasiatapausten7 enemmistö on miehiä, ja jotkin fenotyyppiset yhtäläisyydet FLNA-geenin mutaatioiden12,13 aiheuttamien otopalatodigitaalisen oireyhtymän spektrihäiriöiden kanssa viittasivat joillakin kirjoittajilla X-tautiin kytkeytyvään etiologiaan.7

Kuvasimme hiljattain, että 280 kDa:n sytoskelettiproteiinia filamiini B:tä koodaavan geenin mutaatioilla on yhteys useisiin häiriöihin, joille on ominaista luustoviat ja nivelten sijoiltaanmeno.14 Filamiini B on modulaarinen proteiini. Sen aminoterminaalissa on aktiinia sitova domeeni, joka koostuu kahdesta kalponiinihomologisesta domeenista (CH1 ja CH2), jota seuraa sauvadomeeni, joka koostuu 24 rakenteellisesti homologisesta toistosta ja päättyy karboksiterminaaliseen dimerisaatiodomeeniin.15 Filamiini B:n aktiinia sitova domeeni on samankaltainen kuin muilla sytoskelettiproteiineilla, kuten β-spektriinillä, dystrofiinilla ja α-aktiniini-4:llä.

FLNB:n mutaatioihin on liitetty neljä erilaista sairautta: AOI, AOIII, resessiivisesti periytyvä spondyloottinen kartiopotilaiden oireyhtymä (OMIM #272460) ja Larsenin oireyhtymän dominoiva muoto (OMIM #150250). Henkilöillä, joilla on AOI, AOIII ja dominoivasti periytyvä Larsenin oireyhtymä, todettiin olevan heterotsygoottisia FLNB:n missense-mutaatioita.14 Suurin osa mutaatioista, jotka johtavat AOI:hin tai AOIII:een, johtavat substituutioihin, jotka sijaitsevat filamiini B:n aktiinia sitovan domeenin CH2-domeenissa. Ainoana poikkeuksena on mutaatio 2251G→C, joka sijaitsee eksonissa 15 ja jonka ennustetaan johtavan substituutioon G751R toistossa 6, ja joka todettiin henkilöllä, jolla oli AOIII.14 . Työn aikana, jossa tunnistettiin FLNB:n mutaatioista johtuvien häiriöiden ryhmä, yksi yksilö, jolla oli bumerangin dysplasia, arvioitiin mutaatioiden varalta suoralla sekvensoinnilla, mutta mutaatiota ei havaittu.14 .

Kun otetaan huomioon radiografiset, fenotyyppiset ja histologiset todisteet, jotka viittaavat siihen, että bumerangidysplasia liittyy häiriöihin, jotka johtuvat mutaatioista filamiineja koodaavissa geeneissä, tutkimme kahta bumerangidysplasiaa sairastavaa yksilöä mutaatioiden varalta FLNA:n ja FLNB:n mutaatioiden varalta käyttäen seulontatekniikkana denaturoivaa korkeatehoista nestekromatografianestemääritystä (denaturating high performance liquid chromatography -analyysi, DHPLC).

Ihminen 1 oli tapaus, joka oli aiemmin tutkittu suoralla sekvensoinnilla. Tämä miespuolinen sikiö oli ei-veriteitse syntyneiden, terveiden vanhempien ensimmäinen lapsi. Toisen raskauskolmanneksen ultraäänitutkimuksessa havaittiin rintakehän hypoplasiaa ja kaikkien raajojen merkittävää lyhenemistä sekä useiden luuston osien epäsäännöllistä luutumista. Sikiö synnytettiin 22 raskausviikolla. Post mortem -analyysi osoitti merkittävää rintakehän hypoplasiaa, lyhyitä raajoja ja tyypillistä kasvojen dysmorfiaa, joka liittyy bumerangin dysplasiaan. Enkefalokoleeta tai omphalokoleeta ei esiintynyt. Röntgenlöydökset olivat tyypillisiä bumerangin dysplasialle (kuva 1).

Henkilö 2 oli 17 raskausviikon ikäinen sikiö, josta Wessels ym. ovat aiemmin raportoineet yksityiskohtaisesti.8 Tällä sikiöllä todettiin vakava mikromelia, ja kaksi kolmesta pitkästä putkiluusta puuttui kaikista neljästä raajasta. Röntgentutkimuksessa jäljelle jääneet sädeluut olivat bumerangin muotoisia, sääriluut olivat segmenttimäisiä, selkäranka oli heikosti luutunut ja rintakehä oli hypoplastinen. Histologisesti rustomatriisi oli hyposellulaarinen, ja siinä esiintyi monitumaisia jättiläiskondrosyyttejä.

Sekä FLNA:n että FLNB:n koodausalueet ja introni-eksonien liitoskohdat monistettiin kummastakin tapauksesta saadusta genomisesta DNA:sta aiemmin kuvatuilla introni-alukkeilla13,14 (reaktio-olosuhteet ja alukesekvenssit ovat saatavissa pyynnöstä). FLNA:n analysointia varten amplikonituotteet visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja sekoitettiin sitten ennen heterodupleksin muodostamista samansuuruisiin määriin PCR:llä monistettuja PCR-tuotteita, jotka saatiin sukuun kuulumattomasta terveestä urospuolisesta kontrollista. Näytteet käsiteltiin DHPLC:llä WAVE DNA-fragmenttianalyysijärjestelmässä (Transgenomic Inc.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Amplikonit, jotka osoittivat poikkeavia jälkimuotoja, monistettiin uudelleen ja sekvensoitiin ABI 3100 -sekvensointilaitteella. Tunnistetut mutaatiot vahvistettiin monistetun DNA:n restriktioentsyymidigestillä, ja vanhemmuus vahvistettiin tapauksen 1 osalta ilmoitetuksi kuuden linkittymättömän mikrosatelliittimarkkerin segregaation avulla. Vanhempien näytteitä ei ollut saatavilla tapauksen 2 osalta. Otagon eettinen komitea hyväksyi tämän tutkimuksen.

FLNB:n (eksonit 1-46) tutkimuksessa havaittiin mutaatioita molemmilla koehenkilöillä. Tapauksessa 1 henkilö osoittautui heterotsygoottiseksi mutaatiolle 512T→G, jonka ennustetaan johtavan substituutioon L171R. Tämä mutaatio luo paikan restriktioentsyymille HpaII, minkä ansiosta voitiin osoittaa, että mutaatio oli syntynyt de novo tässä perheessä (kuva 2), mikä antoi geneettisen näytön patogeenisyydestä. Jälkikäteen tarkasteltuna tämä mutaatio oli mukana alkuperäisessä analyysissä, mutta se jätettiin huomiotta. Toinen mutaatio, 703T→C, löydettiin eksonista 4 tapauksessa 2, ja se ennustaa substituutiota S235P (kuva 2). Vanhempien näytteitä ei ollut saatavilla, mutta tätä mutaatiota ei esiintynyt 100 kontrollikromosomissa. Molempien mutaatioiden ennustetaan muuttavan filamiini B:n aktiinia sitovan domeenin CH2-alueen jäännöksiä. Nämä jäännökset ovat evolutiivisesti erittäin konservoituneita selkärankaisten filamiinien keskuudessa (kuva 3). Mutaatiot viittaavat siihen, että näillä aminohapoilla on kriittinen rooli aktiinia sitovan domeenin toiminnassa. 703T→C-mutaation osalta sama substituutio on havaittu analogisessa jäännöksessä ACTN4:ssä, geenissä, joka koodaa sytoskelettisovitinproteiinia α-aktiniini-4 (kuva 3), potilaalla, jolla oli fokaalinen ja segmentaalinen glomeruloskleroosi. 16

Tautiin liittyvät substituutiot filamiini B:n aktiinia sitovassa domeenissa johtavat erilaisiin fenotyyppeihin. Aiemmin olemme raportoineet substituutioista, jotka johtavat AOI:een (n = 3), AOIII:een (n = 1) ja Larsenin oireyhtymään (n = 2).14 Kaikkiin näihin fenotyyppeihin liittyy puutteita luuston ja nivelten muodostuksessa. Mutaatioiden tunnistaminen, jotka johtavat filamiini B:n aktiinia sitovan domeenin sisällä tapahtuviin substituutioihin kahdella potilaalla, joilla on bumerangidysplasia, vahvistaa, että tämä sairaus on alleelinen näille häiriöille, mikä heijastaa aiempia kliinisiä epäilyjä sukulaisuussuhteesta.2,3

Osa mutaatioista, jotka aiheuttavat otopalatodigitaalisten luustohäiriöiden kirjoa, sijaitsee FLNA:n vastaavalla CH2-alueella. Myös nämä mutaatiot johtavat laajaan fenotyyppisen vaikeusasteen kirjoon.13 Näiden mutaatioiden sijainnin ja niistä johtuvien luuston luutumisvaurioiden vaikeusasteen välillä ei ole yksinkertaista korrelaatiota. Vaikka otopalatodigitaalinen oireyhtymä tyyppi 1 ilmenee lievempänä kuin otopalatodigitaalinen oireyhtymä tyyppi 2, nämä tilat voivat johtua substituutioista lähellä toisiaan olevissa jäännöksissä tai jopa samassa jäännöksessä.13,17 Havainto siitä, että FLNB:n aktiinia sitovassa domeenissa esiintyvät mutaatiot voivat niin ikään johtaa laajaan vakavuusasteikkoon, kuvastaa tätä mallia. Yksilöltä 1 löydetyn mutaation ennustama substituutio, L171R, on lähellä substituutiokohtaa (A173V), joka aiheuttaa AOI:n.14 Vastaavasti tässä raportoitu S235P-substituutio on samassa proteiinin kertauskohdassa kuin E227K, substituutio, joka liittyy lievempään, ei-tappavaan fenotyyppiin, Larsenin oireyhtymään.14 Vaikka on raportoitu tautiin liittyvistä substituutioista dystrofiinin, α-aktiniini-4:n,17 filamiini A:n,13 ja filamiini B:n aktiinia sitovan domeenin CH2:n sisällä olevissa jäännöksissä,14 tämän proteiinipoimun toiminnallista roolia ei ole lopullisesti selvitetty. Koska CH2-domeeneilla ei ole mitään synnynnäisiä aktiinia sitovia ominaisuuksia yksinään, on esitetty, että CH2:n rooli aktiinin sitoutumisessa on parhaimmillaankin epäsuora.18

Filamiinit toimivat ensisijaisesti stabiloidakseen aktiiniä solun sisällä joko samansuuntaisina nippuina tai ortogonaalisina geeliverkostoina.19,20 Filamiini A:lle on tunnistettu useita sitoutumiskumppaneita, joista suurin osa assosioituu filamiinin toistojen 16-24 välityksellä (katsaus teoksessa Stossel ym.21). Viiden sitoutumiskumppanin on osoitettu assosioituvan filamiini B:n kanssa: aktiini, FBLP-1,22 preseniliini (PS1 ja PS2)23 ja GPIβα24. Nähtäväksi jää, vaikuttavatko mutaatiot filamiini A:n ja B:n aktiinia sitovilla domeeneilla patogeenisesti ensisijaisesti häiritsemällä aktiiniiniin sitoutumista vai siten, että aktiiniassosiaatio ja sitoutumisvuorovaikutukset muiden proteiinien kanssa ovat toiminnallisesti riippuvaisia toisistaan.

Boomerangin dysplasiaa sairastavien henkilöiden kasvulevyn kondrosyyttien joukossa esiintyy monitumaisia jättiläissoluja. Nämä esiintymät voivat johtua epifyysisen kasvulevyn kondrosyyttien proliferaation aikana tapahtuvasta puutteellisesta solujen pilkkoutumisesta. Aiemmin olemme osoittaneet FLNB:n laajalle levinneen ilmentymisen kasvulevyssä ja erityisesti jakautuvien kondrosyyttien pilkkoutumiskourussa14. Muuttunut solujen pilkkoutumisprosessi, joka johtaa sekä luuston virheelliseen mallinnukseen että mineralisaatioon bumerangidysplasia/atelosteogeneesi-häiriöryhmässä, on vielä selvittämättä.

Bumerangidysplasiaa aiheuttavien mutaatioiden tunnistaminen FLNB:ssä vahvistaa bumerangidysplasian osana kondrodysplasian kirjoa, johon kuuluvat myös AOI- ja III-oireyhtymät ja ei-kuolemaan johtava Larsenin syndrooma. Fenotyyppinen päällekkäisyys bumerangidysplasian ja AO:n välillä, kuten tässä ja aiemmin on raportoitu, sekä näiden tautien taustalla olevien mutaatioiden yhteisesiintyminen FLNB:n aktiinia sitovaa domeenia koodaavissa eksoneissa viittaavat näiden sairauksien kliinispatologiseen spektriin. Tämä FLNB:n mutaatioihin liittyvän fenotyyppisen spektrin laajentuminen entisestään korostaa toimivan aktiinisytoskeletin merkitystä monille normaaleille morfogeneettisille prosesseille, myös luuston synnylle.