Mutaciones en FLNB causan displasia en bumerán | Journal of Medical Genetics
La displasia en bumerán (OMIM #112310) es una displasia esquelética letal caracterizada por una osificación desorganizada del esqueleto.1 Los hallazgos radiológicos característicos incluyen la osificación irregular de los huesos de las extremidades y las vértebras, el subdesarrollo del acetábulo y los fémures hipoplásicos en forma de boomerang, de donde deriva el nombre del trastorno.1 Hasta la fecha se han descrito al menos ocho casos en la literatura.1-8 Se ha propuesto que una displasia esquelética letal similar, la displasia de Piepkorn,9 es alélica de la displasia en bumerán.2,7 La histología del cartílago demuestra tanto la desorganización del anlagen cartilaginoso del hueso largo en desarrollo como frecuentes condrocitos multinucleados en la zona de reserva de la placa de crecimiento.1 Se han descrito otras anomalías del desarrollo más allá del esqueleto, como el onfalocele y el encefalocele.
Las similitudes en los hallazgos radiográficos e histológicos de la displasia en bumerán y la atelosteogénesis I (AOI; OMIM #108720) y III (AOIII; OMIM #108721) han sugerido alelismo para estos trastornos.2,10 En las tres entidades, los hallazgos radiográficos incluyen una osificación deficiente e irregular de los huesos y cuerpos vertebrales con hipoplasia distal del húmero y dislocaciones articulares, además de anomalías craneofaciales.11 Además, se han observado condrocitos multinucleados tanto en la AOI como en la displasia en bumerán. La displasia en bumerán se distingue de la AO por un defecto más grave en la mineralización, con ausencia completa de osificación en algunos elementos de las extremidades y segmentos vertebrales.3 La preponderancia de los varones entre los casos notificados de displasia en bumerán7 y algunas similitudes fenotípicas con los trastornos del espectro del síndrome otopalatodigital causados por mutaciones en el gen FLNA12,13 sugieren a algunos autores una etiología ligada al cromosoma X.7
Recientemente se describió la asociación de mutaciones en el gen que codifica la proteína citoesquelética filamina B de 280 kDa con varios trastornos caracterizados por defectos esqueléticos y dislocaciones articulares.14 La filamina B es una proteína modular. Un dominio de unión a la actina compuesto por dos dominios de homología a la calponina (CH1 y CH2) se encuentra en el extremo amino, seguido de un dominio de varilla compuesto por 24 repeticiones estructuralmente homólogas y que termina en un dominio de dimerización carboxiterminal.15 El dominio de unión a la actina en la filamina B es similar a los encontrados en otras proteínas del citoesqueleto, como la β-espectrina, la distrofina, y la α-actina-4.
Cuatro condiciones distintas han sido atribuidas a mutaciones en la FLNB: AOI, AOIII, síndrome espondilocarpotarsal heredado recesivamente (OMIM #272460), y una forma dominante del síndrome de Larsen (OMIM #150250). Los individuos con AOI, AOIII y síndrome de Larsen heredado de forma dominante son heterocigotos para mutaciones sin sentido en FLNB.14 La mayoría de las mutaciones que conducen a AOI o AOIII conducen a sustituciones localizadas en el dominio CH2 del dominio de unión a la actina de la filamina B. La única excepción es la mutación 2251G→C, localizada en el exón 15, que se predice que conduce a la sustitución G751R en la repetición 6, encontrada en un individuo con AOIII.14 Durante el trabajo que identificó el grupo de trastornos resultantes de mutaciones en FLNB, se evaluó la presencia de mutaciones en un individuo con displasia en bumerán mediante secuenciación directa, pero no se identificó ninguna mutación.14
Dada la evidencia radiográfica, fenotípica e histológica que sugiere que la displasia en bumerán está relacionada con trastornos causados por mutaciones en los genes que codifican las filaminas, examinamos a dos individuos con displasia en bumerán en busca de mutaciones en FLNA y FLNB utilizando el análisis de cromatografía líquida desnaturalizada de alto rendimiento (DHPLC) como técnica de cribado.
El individuo 1 fue el caso previamente examinado por secuenciación directa. Este feto masculino era el primer hijo de padres no consanguíneos y sanos. La ecografía del segundo trimestre reveló una hipoplasia torácica y un marcado acortamiento de todas las extremidades con osificación irregular de múltiples elementos esqueléticos. El feto nació a las 22 semanas de gestación. El análisis post-mortem demostró una marcada hipoplasia torácica, extremidades cortas y el característico dismorfismo facial asociado a la displasia en bumerán. No había encefalocele ni onfalocele. Los hallazgos radiográficos eran típicos de la displasia en bumerán (fig. 1).
Radiografía del caso 1. El calvario, la columna vertebral y el pubis están infraosificados con una escoliosis torácica evidente. Hay una micromelia severa con húmeros no osificados, fémures ausentes y radios, cúbitos y tibias severamente arqueados y acortados. No se observa osificación en las manos ni en los pies.
El individuo 2 era un feto de 17 semanas de gestación, previamente informado en detalle por Wessels et al.8 Este feto demostró una micromelia severa con dos de los tres huesos tubulares largos ausentes en las cuatro extremidades. En el examen radiográfico, los radios restantes tenían forma de boomerang, las tibias eran segmentarias, la columna vertebral estaba poco osificada y el tórax era hipoplásico. Histológicamente, la matriz del cartílago era hipocelular con condrocitos gigantes multinucleados presentes.
Las regiones codificantes y las uniones de empalme intrón-exón tanto del FLNA como del FLNB se amplificaron a partir del ADN genómico obtenido de ambos casos utilizando cebadores intrónicos descritos previamente13,14 (las condiciones de reacción y las secuencias de los cebadores están disponibles bajo petición). Para el análisis del FLNA, los productos del amplicón se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y luego se mezclaron con cantidades iguales de productos amplificados por PCR de un control masculino sano no relacionado antes de la formación del heterodúplex. Las muestras se sometieron a DHPLC en un sistema de análisis de fragmentos de ADN WAVE (Transgenomic Inc.) según las instrucciones del fabricante. Los amplicones que mostraban formas de trazado anómalas se volvieron a amplificar y se secuenciaron por ciclos en un secuenciador ABI 3100. Las mutaciones identificadas se confirmaron mediante la digestión con enzimas de restricción del ADN amplificado, y se confirmó el parentesco declarado para el caso 1 mediante la segregación de seis marcadores de microsatélite no vinculados. En el caso 2 no se disponía de muestras parentales. Este estudio fue aprobado por el comité ético de Otago.
El examen del FLNB (exones 1-46) reveló mutaciones en ambos sujetos. En el caso 1, se demostró que el individuo era heterocigoto para la mutación 512T→G, que se predice que conduce a la sustitución L171R. Esta mutación crea un sitio para la enzima de restricción HpaII, lo que permitió demostrar que había surgido de novo en esta familia (fig. 2), proporcionando evidencia genética de patogenicidad. En retrospectiva, esta mutación estaba presente en el análisis original, pero se pasó por alto. La segunda mutación, 703T→C, se encontró en el exón 4 del caso 2, y predice la sustitución S235P (fig. 2). Las muestras parentales no estaban disponibles, pero esta mutación no estaba presente en 100 cromosomas de control. Se predice que ambas mutaciones alteran residuos dentro de la región CH2 del dominio de unión a la actina de la filamina B. Estos residuos están muy conservados evolutivamente entre las filaminas de los vertebrados (fig. 3). Las mutaciones sugieren que estos aminoácidos juegan un papel crítico en la función del dominio de unión a actina. En el caso de la mutación 703T→C, se ha observado la misma sustitución en el residuo análogo en ACTN4, un gen que codifica la proteína adaptadora del citoesqueleto α-actinina-4 (fig. 3), en un paciente con glomeruloesclerosis focal y segmentaria.16
Cromatogramas y digestiones con endonucleasas de restricción que demuestran las mutaciones asociadas a la displasia en bumerán. (A) Caso 1, que muestra la heterocigosidad para la mutación 512T→G y la digestión con endonucleasas de restricción utilizando HpaII. El análisis de los padres (carriles 1 y 3) se muestra junto al del probando (carril 2). (B) Caso 2, que muestra heterocigosidad para la mutación 703T→C, y digestión con endonucleasas de restricción por DrdI. Análisis del ADN amplificado del probando (carril 1) y de un control sano no relacionado (carril 2). Los tamaños de los fragmentos se indican en pb.
Alineación ClustalW de la filamina y las proteínas con dominios de unión a actina de humanos, ratones, Drosophilia melanogaster, Anopheles gambiae, Dictyostelium discoideum y Caenorhabditis elegans. (A) Contextos de secuencia alrededor de los residuos L171; (B) S235. Hyp-Fln, filamina hipotética.
Las sustituciones asociadas a la enfermedad dentro del dominio de unión a la actina de la filamina B conducen a una diversidad de fenotipos. Anteriormente hemos informado de sustituciones que conducen a AOI (n = 3), AOIII (n = 1) y al síndrome de Larsen (n = 2).14 Todos estos fenotipos están asociados a defectos en la esqueletogénesis y la formación de articulaciones. La identificación de mutaciones que conducen a sustituciones dentro del dominio de unión a la actina de la filamina B en dos pacientes con displasia en bumerán confirma que esta afección es alélica a estos trastornos, lo que refleja las sospechas clínicas previas de parentesco.2,3
Una proporción de mutaciones que causan el espectro otopalatodigital de los trastornos esqueléticos se encuentra dentro de la región CH2 análoga en FLNA. Estas mutaciones también dan lugar a un amplio espectro de gravedad fenotípica.13 No existe una correlación sencilla entre la localización de estas mutaciones y la gravedad de los defectos resultantes en la osificación del esqueleto. Aunque el síndrome otopalatodigital de tipo 1 se manifiesta de forma más leve que el síndrome otopalatodigital de tipo 2, estas afecciones pueden ser el resultado de sustituciones en residuos muy próximos entre sí o incluso en el mismo residuo.13,17 La observación de que las mutaciones en el dominio de unión a la actina de FLNB también pueden dar lugar a un amplio espectro de gravedad recapitula este patrón. La sustitución predicha por la mutación encontrada en el individuo 1, L171R, está muy cerca del sitio de una sustitución (A173V), causante de AOI.14 De manera similar, la sustitución S235P reportada aquí está dentro del mismo pliegue de la proteína que E227K, una sustitución asociada con el fenotipo menos severo y no letal, el síndrome de Larsen.14 A pesar de los informes de sustituciones asociadas a la enfermedad en los residuos dentro del CH2 del dominio de unión a la actina de la distrofina, α-actinina-4,17 filamina A,13 y filamina B,14 un papel funcional para este pliegue de la proteína no ha sido definitivamente dilucidado. Como los dominios CH2 no poseen ninguna propiedad innata de unión a la actina de forma aislada, se ha postulado que el papel del CH2 en la unión a la actina es, en el mejor de los casos, indirecto.18
Las filaminas actúan principalmente para estabilizar la actina dentro de la célula, ya sea en forma de haces paralelos o de redes de gel ortogonales.19,20 Se han identificado múltiples socios de unión para la filamina A, la gran mayoría asociándose a través de las repeticiones de la filamina 16-24 (revisado en Stossel et al21). Se ha demostrado que cinco socios de unión se asocian con la filamina B: actina, FBLP-1,22 presenilina (PS1 y PS2),23 y GPIβα.24 Queda por ver si las mutaciones dentro de los dominios de unión a la actina de las filaminas A y B ejercen su efecto patogénico principalmente por la alteración de la unión a la actina o a través de una dependencia funcional entre la asociación a la actina y las interacciones de unión con otras proteínas.
Se encuentran células gigantes multinucleadas entre los condrocitos de la placa de crecimiento de individuos con displasia en bumerán. Estas apariciones podrían ser el resultado de un clivaje celular defectuoso durante la proliferación de condrocitos dentro de la placa de crecimiento epifisaria. Anteriormente hemos demostrado una amplia expresión de FLNB en el cartílago de crecimiento y, sobre todo, en el surco de clivaje de los condrocitos en división.14 El proceso de clivaje celular alterado que conduce tanto al patrón esquelético defectuoso como a la mineralización en el grupo de trastornos de displasia boomerang/atelosteogénesis aún está por dilucidar.
La identificación de las mutaciones que causan la displasia boomerang en FLNB confirma que la displasia boomerang forma parte del espectro de condrodisplasias, incluyendo AOI y III, y el síndrome de Larsen no letal. El solapamiento fenotípico entre la displasia en bumerán y la AO, como se ha informado aquí y anteriormente, y la colocalización de las mutaciones subyacentes a estas enfermedades en los exones que codifican el dominio de unión a la actina del FLNB es indicativo de un espectro clinicopatológico para estos trastornos. Esta ampliación del espectro fenotípico asociado a las mutaciones en FLNB pone de manifiesto la importancia de un citoesqueleto de actina funcional para muchos procesos morfogenéticos normales, incluida la esqueletogénesis.
Leave a Reply