ENU

Cilia i Vertebrate Cell-Cell Signaling

Under 2003 involverade en ENU-mutationsscreen oväntat primära cilier och IFT i Shh-signalering: IFT-mutationer hos möss resulterade i fenotyper för mönsterbildningen i neuralröret och lemknoppen som liknar dem som uppstår vid störningar i Shh-banan (Huangfu et al., 2003). Primära cilier är icke-motila, mikrotubulära organeller som sticker ut från de flesta ryggradsdjursceller. De sträcker sig från basala kroppar och består av specialiserade membran (strukturellt separerade från plasmamembranet) runt ett centralt axonem längs vilket IFT-maskineriet underlättar retrograd och anterograd transport mellan ciliärens bas och spets. Störningar i ciliogenesen eller IFT resulterar i ett brett spektrum av mänskliga ciliopati-syndrom. Primära defekter i samband med ciliensjukdomar omfattar polydaktyli, kraniofaciala missbildningar och missbildningar i hjärnan, situs inversus, polycystisk njursjukdom, fetma, diabetes och subtila defekter i lever, mjälte och hjärta (Nigg och Raff, 2009; Goetz och Anderson, 2010; Hildebrandt m.fl,

Ciliogenesen och nedmonteringen av primära cilier är nära kopplade till cellcykelmaskineriet: primära cilier finns på vilande celler men deras nedmontering krävs för övergång till cellcykeln. Fgf- och Wnt-signalering krävs uppströms för ciliogenes i flera sammanhang hos ryggradsdjur, inklusive noden/Kupffers vesikel (KV), otiska vesiklar och pronefriska kanaler (Basu och Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Transkriptionella måltavlor för dessa signalvägar som medierar bildning, mönstring eller funktion av cilier inkluderar Ift88, Enc1-like och de ciliogena TF:erna Foxj1 och Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Epistasexperiment som studerar KV har föreslagit att Wnt-signalering fungerar nedströms från Fgfs i ciliogenesen (Caron et al., 2012).

I ryggradsdjur använder Shh-vägen cilier som en specialiserad signalorganell där IFT medierar förändringar i proteinlokalisering som är väsentliga för Gli-bearbetning och därav följande transkriptionella reaktioner (figur 1.1B). Hh-receptorn Patched (Ptc) finns vid basen av det primära ciliumet i frånvaro av Hh. I närvaro av Hh lämnar Ptc ciliumet och Smo kommer in, och det sker en ökning av Gli som är lokaliserad i spetsen. Gli-Sufu-komplex anrikas i spetsarna av primära cilier på ett Smo-beroende sätt och måste dissocieras för aktivering av Shh-banan (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, vars ortolog främjar Ci/Gli-bearbetning och antagoniserar Sufu i Drosophila, genomgår Hh-inducerad anterograd transport från ciliumbasen till spetsen. PKA, som fosforylerar Gli som en förutsättning för proteolys till GliR, lokaliseras till basen av primära cilier och reglerar nivåerna av Gli som är lokaliserad i spetsen (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studier av Shh och cilier/IFT har indikerat att vissa egenskaper hos mänsklig cilipati sannolikt beror på störd Shh-signalering. Dessutom kan ciliärdefekter förstärka eller undertrycka onkogenes på grund av mutationer i Shh-banan (Han et al., 2009). Cilia/IFT-mutanter liknar ofta LOF- eller GOF Shh-mutanter på grund av kontextspecifika krav på cilia-medierad bearbetning av Gli till GliA respektive GliR. De utmärkande fenotyperna omfattar ventralisering av neuralröret (som använder GliR) och polydaktyli (lemknopparna använder GliA; diskuteras i Goetz och Anderson, 2010). Mutationer i IFT- och ciliopatigener har bidragit till att identifiera nya sammanhang där cilier krävs för utvecklingens cellsignalering. I vissa fall har dessa experiment kastat ljus över etiologierna för dåligt förstådda mänskliga ciliopatiegenskaper. Studier av Rpgrip11 (en mänsklig ciliopatigen) och Ttc21b-muterade möss visade till exempel att primära cilier är viktiga för att förmedla Shh-signaler i den ventrala framhjärnan. Ttc21b-mutanter har onormala primära cilier med delvis defekt retrograd transport men funktionell anterograd transport. Detta resulterar i en GOF-fenotyp, vilket framgår av ackumulering av Shh-signalmaskineriet i cilenspetsarna och expansion av Shh-uttryck/aktivitet i det ventrala telencefalonet och zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Rpgrip1l-mutanter har neuroepitelceller i framhjärnan som saknar primära cilier och är bristfälliga när det gäller produktion av bearbetade Gli, vilket förväntas för Shh LOF (Besse et al., 2011). Dessa mutationer resulterar båda i expansion av subpallium på bekostnad av pallium, vilket liknar Gli3-mutanter, eftersom det dominerande resultatet av Shh-signalering i den ventrala framhjärnan är bearbetning av Gli3 till dess repressorform (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Om aktivt Gli3R-protein introduceras genetiskt är cilier överflödiga i detta sammanhang (Besse et al., 2011). Defekter i mönstring av ventrala framhjärnan kan ligga till grund för kognitiva försämringar i vissa ciliopatier.

Shh-relaterade defekter förklarar inte alla fenotyper i mänskliga ciliopatier. Det har blivit uppenbart att IFT/cilia används i vissa sammanhang för att underlätta signalering genom andra vägar. Under däggdjurs hudutveckling är primära cilier viktiga för terminal differentiering av suprabasala celler, en process som initieras av Notch/Delta-signalering (figur 1F; Blanpain et al., 2006). I ∼60-70 % av suprabasala celler är Notch koncentrerat i primära ciliarmembran och presenilin, ett protein i γ-sekretaskomplexet som klyver Notch, är lokaliserat vid basala kroppar (Ezratty et al., 2011). Knock down av IFT-gener eller eliminering av cilier in vivo resulterar i minskad Notch-reporteraktivitet och försämrad suprabasal celldifferentiering. Dessutom observerades NICD, den aktiva klyvda formen av Notch, i kärnorna hos cilierade men inte ocilierade celler i genetiska chimärer (Ezratty et al., 2011).

Cilier har också involverats i PDGF-signalering. I odlade fibroblaster har PDGFRα observerats i primära cilimembran, och de RTK-aktiverade signaltransduktionsproteinerna MEK1/2 och Akt är lokaliserade längs ciliumet respektive vid cilibasen (Schneider et al., 2005). Studier av fibroblaster av vildtyp och Ift88-mutanter (inga primära cilier) visade att primära cilier av ledande celler orienterar sig mot sårställen och krävs för PDGF-AA-inducerad kemotaxis och phospho-Akt-svar in vitro (Schneider et al., 2010). Ift88-muterade möss uppvisar framför allt defekter vid sårreparation (Schneider et al., 2010). PDGF-signalering genom PDGFRα har också involverats i ciliernas nedmontering och G1-S-fasövergången (diskuteras i Christensen et al., 2012), även om betydelsen in vivo av denna observation ännu inte är känd.

Ciliernas roll i den kanoniska Wnt-signalering har varit kontroversiell (granskad i Wallingford och Mitchell, 2011). Studier av Ift88- och Ift72-muterade möss och zebrafiskar tyder på att cilier inte är nödvändiga för Wnt-signalering under embryogenes, och studier av Wnt-signalering i Kif3a-muterade möss gav motstridiga resultat (Huang och Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). I retrograda IFT-mutanter rapporterade en grupp ingen förändring i Wnt-signalering, medan en annan grupp påvisade en minskning av Wnt-aktiviteten i sammanhang som bibehåller cilier men en ökning av Wnt-signalering i sammanhang som förlorar cilier (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Studier av ciliär-/ciliopatiproteinerna Inversin, Chibby och Jouberin stöder ciliernas roll i kanonisk Wnt-signalering i specifika utvecklingssammanhang. Inversin, som är muterat hos mänskliga patienter med nefronofytos typ II, uttrycks i vertebrats monocilia, interagerar fysiskt med Disheveled (Dsh) och stör den kanoniska Wnt-signalering nedströms Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Inversin-muterade möss uppvisar njur- och hårmönsterfenotyper som påminner om Wnt/Frz-fenotyper, samt vänster-högermönsterfenotyper som sannolikt beror på defekter i nodmonocilia-funktionen (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, ett basalkroppsprotein som krävs för ciliogenes och basalkroppens dockning, interagerar fysiskt med β-catenin och reglerar negativt den kanoniska Wnt-signaleringen i Drosophila-embryon, däggdjurs lungepitel och odlade däggdjursceller (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Slutligen krävs det humana ciliopatiproteinet Jouberin hos möss för normal Wnt-signalering och proliferation vid den cerebellära mittlinjen. Detta bidrar sannolikt till den defekt i fusionen av cerebellära hemisfärer som observeras hos patienter med Jouberts syndrom och möss med Jouberinbrist (Lancaster et al., 2011a). I cilierade celler som utsätts för Wnt sekonderas Jouberin tillsammans med β-catenin vid basala kroppar på ett IFT-beroende sätt. Jouberin underlättar kärntranslokation av β-catenin; dess sekretering i basala kroppar hindrar kärntranslokation av β-catenin och dämpar kanoniska Wnt-signalsvar (Lancaster et al., 2011b). Tillsammans tyder dessa fynd på att cilier inte är globalt nödvändiga för Wnt-signalering under embryogenesen, men att de påverkar Wnt-signaleringens resultat i utvalda sammanhang.

Det har antagits att cilier tillhandahåller en specialiserad sensorisk struktur inom vilken flera typer av signaler samordnas. En alternativ modell är att cilier uppvisar vägspecificitet (liksom cytonemes, som diskuteras nedan) och därmed begränsar cellulär responsivitet och/eller rumsligt segregerar signalresponser. Signaleringens vägspecificitet hos cilier kan förmedlas genom differentiell inriktning av signalproteiner till cilier och/eller användning av olika undergrupper av IFT-proteiner eller lastspecifika adaptrar för axonemtransport (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).