ENU

Cilia in Vertebrate Cell-Cell Signaling

Vuonna 2003 ENU-mutageneesiseulonta osoitti yllättäen, että primaariset värekarvat ja IFT ovat osallisina Shh-signalointiin: IFT-mutaatiot hiirissä johtivat hermostoputken ja raajojen silmujen kuvioinnin fenotyyppeihin, jotka olivat samankaltaisia kuin ne, jotka johtuvat Shh-reitin häiriöistä (Huangfu ym., 2003). Ensisijaiset värekarvat ovat liikkumattomia, mikrotubuluspohjaisia organelleja, jotka työntyvät ulos useimmista selkärankaisten soluista. Ne ulottuvat tyvitumakkeista, ja ne koostuvat erikoistuneista kalvoista (jotka ovat rakenteellisesti erillään plasmamembraanista) keskeisen aksonemeen ympärillä, jota pitkin IFT-koneisto helpottaa retrogradista ja anterogradista kuljetusta säikeiden tyven ja kärjen välillä. Ciliogeneesin tai IFT:n häiriöt johtavat monenlaisiin ihmisen ciliopatiaoireyhtymiin. Primaarisiin ciliopatiahäiriöihin kuuluvat polydaktylia, kraniofaktiaaliset ja aivojen epämuodostumat, situs inversus, polykystinen munuaissairaus, liikalihavuus, diabetes sekä maksan, pernan ja sydämen hienovaraiset viat (Nigg ja Raff, 2009; Goetz ja Anderson, 2010; Hildebrandt ym., 2010), 2011).

Ciliogeneesi ja primaaristen värekarvojen purkaminen ovat tiukasti kytköksissä solusyklikoneistoon: primaarisia värekarvoja on rauhallisissa soluissa, mutta niiden purkaminen on välttämätöntä solusykliin siirtymiseksi. Fgf- ja Wnt-signalointia tarvitaan ciliogeneesin alkuvaiheessa useissa selkärankaisten konteksteissa, kuten solmussa/Kupfferin vesikkelissä (KV), otuksen vesikkeleissä ja pronefriinikanavissa (Basu ja Brueckner, 2009; Liu ym., 2011; Caron ym., 2012; Qian ym., 2013). Näiden signaalireittien transkriptiokohteisiin, jotka välittävät värekarvojen muodostumista, kuviointia tai toimintaa, kuuluvat Ift88, Enc1-like ja värekarvojen TF:t Foxj1 ja Rfx2 (Neugebauer ym., 2009; Caron ym., 2012; Qian ym., 2013). KV:tä tutkivat epistaasikokeet ovat viitanneet siihen, että Wnt-signalointi toimii Fgfs:n jälkeenpäin ciliogeneesissä (Caron ym., 2012).

Selkärankaisissa Shh-reitti käyttää cilioita erikoistuneena signalointiorganellina, jossa IFT välittää muutoksia proteiinien lokalisaatiossa, jotka ovat välttämättömiä Gli-prosessoinnille ja siitä johtuville transkriptionaalisille vasteille (kuva 1.1B). Hh-reseptori Patched (Ptc) on primaarisen ciliumin pohjalla ilman Hh:ta. Hh:n läsnä ollessa Ptc poistuu ciliumista ja Smo tulee sinne, ja kärkeen lokalisoitunut Gli lisääntyy. Gli-Sufu-kompleksit rikastuvat primaaristen cilioiden kärjissä Smo-riippuvaisella tavalla, ja ne on dissosioitava Shh-reitin aktivoimiseksi (Humke ym., 2010; Tukachinsky ym., 2010). Kif7, jonka ortologi edistää Ci/Gli-prosessointia ja antagonisoi Sufua Drosofiassa, käy läpi Hh:n indusoiman anterogradikuljetuksen ciliumin tyvestä kärkeen. PKA, joka fosforyloi Gli:n proteolyysin edellytyksenä GliR:ksi, lokalisoituu primaaristen värekarvojen tyvelle ja säätelee kärkeen lokalisoituneen Gli:n tasoja (Pan ym., 2006; 2009; Tuson ym., 2011).

Shh:n ja värekarvojen/IFT:n tutkimukset ovat viitanneet siihen, että jotkin ihmisen värekarvojen ominaispiirteet johtuvat luultavasti häiriintyneestä Shh:n signaloinnista. Lisäksi ciliaviat voivat tehostaa tai tukahduttaa Shh-reitin mutaatioiden aiheuttamaa onkogeneesiä (Han ym., 2009). Cilia/IFT-mutantit muistuttavat usein LOF- tai GOF-Shh-mutantteja johtuen kontekstisidonnaisista vaatimuksista, jotka koskevat cilia-välitteistä Gli:n prosessointia GliA:ksi tai GliR:ksi. Tunnusomaisia fenotyyppejä ovat hermostoputken ventralisaatio (joka käyttää GliR:ää) ja polydaktylia (raajojen nuput käyttävät GliA:ta; käsitelty artikkelissa Goetz ja Anderson, 2010). IFT- ja ciliopatia-geenien mutaatiot ovat auttaneet tunnistamaan uusia konteksteja, joissa värekarvoja tarvitaan kehityssolujen signalointiin. Joissakin tapauksissa nämä kokeet ovat valaisseet huonosti ymmärrettyjen ihmisen ciliopatiapiirteiden etiologiaa. Esimerkiksi tutkimukset Rpgrip11:llä (ihmisen ciliopatia-geeni) ja Ttc21b-mutanttihiirillä osoittivat primaaristen värekarvojen merkityksen Shh-signaalien välittämisessä ventraalisissa etuaivoissa. Ttc21b-mutaatioilla on epänormaaleja primaarisia värekarvoja, joiden retrogradinen kuljetus on osittain viallinen mutta anterogradinen kuljetus toimiva. Tämä johtaa GOF-fenotyyppiin, josta on osoituksena Shh-signalointikoneiston kertyminen värekarvojen kärkiin ja Shh-ekspression/aktiivisuuden laajeneminen ventraaliseen telencephaloniin ja zona limitans intrathalamica -alueelle (Tran ym., 2008; Stottmann ym., 2009). Rpgrip1l-mutanteilla on etuaivojen neuroepiteelisoluja, joista puuttuvat primaariset värekarvat ja joissa on puutteita prosessoidun Gli:n tuotannossa, kuten Shh LOF:n osalta odotetaan (Besse et al., 2011). Nämä mutaatiot johtavat kumpikin subpalliumin laajenemiseen palliumin kustannuksella, samoin kuin Gli3-mutantit, koska Shh-signaloinnin hallitseva tuotos ventraalisissa etuaivoissa on Gli3:n prosessointi repressorimuotoonsa (Stottmann ym., 2009; Besse ym., 2011). Jos aktiivinen Gli3R-proteiini tuodaan geneettisesti, sädekehät ovat tässä yhteydessä tarpeettomia (Besse ym., 2011). Ventraalisen etuaivojen kuvioinnin viat voivat olla joidenkin ciliopatioiden kognitiivisten häiriöiden taustalla.

Shh:hen liittyvät viat eivät selitä kaikkia ihmisen ciliopatioiden fenotyyppejä. On käynyt ilmeiseksi, että IFT:tä/cilioita käytetään joissakin yhteyksissä helpottamaan muiden reittien signalointia. Nisäkkäiden ihon kehityksen aikana primaariset säikeet ovat välttämättömiä suprabasaalisten solujen terminaaliselle erilaistumiselle, joka käynnistyy Notch/Delta-signaalin avulla (kuva 1F; Blanpain ym., 2006). ∼60-70 prosentissa suprabasaalisoluista Notch on keskittynyt primaarisiin sädekehäkalvoihin, ja preseniliini, joka on Notchia pilkkovan γ-sekretaasikompleksin proteiini, on lokalisoitunut tyvitumakkeisiin (Ezratty ym., 2011). IFT-geenien alasajo tai värekarvojen eliminointi in vivo johtaa Notch-reportteriaktiivisuuden vähenemiseen ja suprabasaalisten solujen heikentyneeseen erilaistumiseen. Lisäksi NICD:tä, Notchin aktiivista pilkkoutunutta muotoa, havaittiin ciliaattisten mutta ei unciliaattisten solujen ytimissä geneettisissä kimeereissä (Ezratty ym., 2011).

Ciliaattiset solut on myös yhdistetty PDGF-signalointiin. Viljellyissä fibroblasteissa PDGFRα:n on havaittu olevan primaarisissa värekarvojen kalvoissa, ja RTK-aktivoituneet signaalinsiirtoproteiinit MEK1/2 ja Akt ovat lokalisoituneet värekarvojen varrelle ja värekarvojen tyvelle (Schneider ym., 2005). Tutkimukset villityypin ja Ift88-mutaation (ei primaarisia sädekehiä) fibroblasteilla osoittivat, että johtavien solujen primaariset sädekehät suuntautuvat kohti haavakohtia ja että niitä tarvitaan PDGF-AA-indusoituun kemotaksikseen ja fosfo-Akt-vasteisiin in vitro (Schneider ym., 2010). Erityisesti Ift88-mutanttihiirillä on puutteita haavan korjauksessa (Schneider ym., 2010). PDGF-signalointi PDGFRα:n kautta on myös yhdistetty värekarvojen hajoamiseen ja G1-S-vaiheen siirtymiseen (käsitelty artikkelissa Christensen ym., 2012), vaikka tämän havainnon in vivo -merkitystä ei vielä tiedetä.

Värekarvojen rooli kanonisessa Wnt-signaloinnissa on ollut kiistanalainen (tarkasteltu artikkelissa Wallingford ja Mitchell, 2011). Ift88- ja Ift72-mutanttihiirillä ja seeprakaloilla tehdyt tutkimukset viittasivat siihen, että värekarvat eivät ole välttämättömiä Wnt-signaloinnille alkionkehityksen aikana, ja Kif3a-mutanttihiirillä tehdyt tutkimukset Wnt-signaloinnista antoivat ristiriitaisia tuloksia (Huang ja Schier, 2009; Ocbina ym., 2009; Lancaster ym., 2011b). Retrogradan IFT-mutanteissa yksi ryhmä ei raportoinut muutosta Wnt-signaloinnissa, kun taas toinen ryhmä osoitti Wnt-aktiivisuuden vähenevän yhteyksissä, jotka säilyttävät värekarvoja, mutta Wnt-signaloinnin lisääntyvän yhteyksissä, jotka menettävät värekarvoja (Ocbina ym., 2009; Lancaster ym., 2011b). Tutkimukset, jotka koskevat sädekehän/ciliopatian proteiineja Inversin, Chibby ja Jouberin, tukevat sädekehän roolia kanonisessa Wnt-signaloinnissa tietyissä kehityskonteksteissa. Inversiini, joka on mutaantunut ihmispotilailla, joilla on nefronoftiittityyppi II, ilmentyy selkärankaisten monokilioissa, on fysikaalisessa vuorovaikutuksessa Disheveledin (Dsh) kanssa ja häiritsee kanonista Wnt-signalointia Dsh:n alapuolella in vitro (Watanabe ym., 2003; Simons ym., 2005). Inversiinimutaatiohiirillä esiintyy Wnt/Frz-fenotyyppejä muistuttavia munuais- ja karvakuvioinnin fenotyyppejä sekä vasen-oikea-kuvioinnin fenotyyppejä, jotka johtuvat todennäköisesti solmun monosilia-toiminnan puutteista (Watanabe ym., 2003; Simons ym., 2005). Chibby, tyvitumakkeen proteiini, jota tarvitaan ciliogeneesiin ja tyvitumakkeen telakoitumiseen, on fysikaalisessa vuorovaikutuksessa β-kateniinin kanssa ja säätelee negatiivisesti kanonista Wnt-signalointia Drosophilan alkioissa, nisäkkäiden keuhkoepiteeleissä ja viljellyissä nisäkässoluissa (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Lopuksi, ihmisen ciliopatiaproteiinia Jouberinia tarvitaan hiirissä normaaliin Wnt-signalointiin ja proliferaatioon pikkuaivojen keskilinjalla. Tämä todennäköisesti vaikuttaa osaltaan ihmisen Joubertin oireyhtymää sairastavilla potilailla ja Jouberin-puutteisilla hiirillä havaittuun pikkuaivopuoliskojen fuusiovirheeseen (Lancaster ym., 2011a). Wnt:lle altistuneissa sädesoluissa Jouberiini sekvestroituu β-kateniinin kanssa tyvitumakkeisiin IFT-riippuvaisella tavalla. Jouberiini helpottaa β-kateniinin ydintranslokaatiota; sen basaalirungon sekvestraatio estää β-kateniinin ydintranslokaation ja vaimentaa kanonisia Wnt-signaalivasteet (Lancaster ym., 2011b). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että värekarvoja ei tarvita globaalisti Wnt-signalointiin embryogeneesin aikana, mutta ne vaikuttavat Wnt-signaloinnin tuloksiin valikoiduissa yhteyksissä.

On oletettu, että värekarvat tarjoavat erikoistuneen aistirakenteen, jonka sisällä koordinoidaan monenlaisia signaaleja. Vaihtoehtoinen malli on, että värekarvoilla on väyläspesifisyyttä (kuten sytoneemeilla, joita käsitellään jäljempänä) ja että ne siten rajoittavat solujen reagointikykyä ja/tai erottavat signaalivasteet toisistaan alueellisesti. Sädekehän signaloinnin polkuspesifisyyttä voisi välittää signaaliproteiinien erilainen kohdentuminen sädekehiin ja/tai erilaisten IFT-proteiinien osajoukkojen tai rahtispesifisten adaptaattoreiden hyödyntäminen aksoneemikuljetuksessa (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).