ENU

Cílie v signalizaci mezi buňkami obratlovců

V roce 2003 byly pomocí mutageneze ENU nečekaně zapojeny primární řasinky a IFT do signalizace Shh: IFT mutace u myší vedly k fenotypům vzorování neurální trubice a končetinových pupenů podobným těm, které jsou výsledkem přerušení dráhy Shh (Huangfu et al., 2003). Primární řasinky jsou nemotorické organely na bázi mikrotubulů, které vyčnívají z většiny buněk obratlovců. Vystupují z bazálních tělísek a skládají se ze specializovaných membrán (strukturálně oddělených od plazmatické membrány) kolem centrálního axonému, podél kterého mechanismus IFT usnadňuje retrográdní a anterográdní transport mezi základnou a špičkou řasinky. Narušení ciliogeneze nebo IFT vede k širokému spektru syndromů lidských ciliopatií. Primární poruchy řasinek zahrnují polydaktylii, kraniofaciální a mozkové malformace, situs inversus, polycystické onemocnění ledvin, obezitu, diabetes a jemné defekty jater, sleziny a srdce (Nigg a Raff, 2009; Goetz a Anderson, 2010; Hildebrandt et al.,

Ciliogeneze a demontáž primárních řasinek jsou úzce spjaty s mechanismem buněčného cyklu: primární řasinky jsou přítomny na klidových buňkách, ale jejich demontáž je nutná pro přechod do buněčného cyklu. Fgf a Wnt signalizace jsou vyžadovány před ciliogenezí v několika kontextech obratlovců, včetně uzlin/Kupfferova váčku (KV), otických váčků a pronefrických kanálků (Basu a Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Mezi transkripční cíle těchto signálních drah, které zprostředkovávají tvorbu, vzorování nebo funkci řasinek, patří Ift88, Enc1-like a ciliogenní TF Foxj1 a Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Epistázové experimenty studující KV naznačily, že signalizace Wnt funguje v ciliogenezi za Fgfs (Caron et al., 2012).

U obratlovců využívá dráha Shh řasinky jako specializovanou signální organelu, ve které IFT zprostředkovává změny v lokalizaci proteinů nezbytných pro zpracování Gli a následné transkripční odpovědi (obr. 1.1B). Receptor Hh Patched (Ptc) se v nepřítomnosti Hh nachází na bázi primárního řasinky. V přítomnosti Hh Ptc opouští řasinku a vstupuje do ní Smo a dochází ke zvýšení počtu Gli lokalizovaných na špičce. Komplexy Gli-Sufu jsou obohaceny ve špičkách primárních řasinek v závislosti na Smo a pro aktivaci dráhy Shh musí být disociovány (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, jehož ortolog podporuje zpracování Ci/Gli a antagonizuje Sufu u drozofily, podléhá Hh indukovanému anterográdnímu transportu od báze řasinky ke špičce. PKA, která fosforyluje Gli jako předpoklad proteolýzy na GliR, se lokalizuje na bázi primárních řasinek a reguluje hladiny Gli lokalizované na špičce (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studie Shh a řasinek/IFT naznačily, že některé znaky lidské ciliopatie jsou pravděpodobně způsobeny narušenou signalizací Shh. Kromě toho mohou defekty řasinek posílit nebo potlačit onkogenezi v důsledku mutací dráhy Shh (Han et al., 2009). Cilia/IFT mutanti se často podobají LOF nebo GOF Shh mutantům kvůli kontextově specifickým požadavkům na zpracování Gli zprostředkované řasinkami na GliA, respektive GliR. Mezi charakteristické fenotypy patří ventralizace neurální trubice (která využívá GliR) a polydaktylie (končetinové pupeny využívají GliA; diskutováno v Goetz a Anderson, 2010). Mutace v genech pro IFT a ciliopatie pomohly identifikovat nové souvislosti, v nichž jsou řasinky potřebné pro vývojovou buněčnou signalizaci. V některých případech tyto experimenty vnesly světlo do etiologie málo pochopených znaků lidských ciliopatií. Například studie Rpgrip11 (gen pro lidskou ciliopatii) a mutantních myší Ttc21b prokázaly význam primárních řasinek při zprostředkování signálů Shh ve ventrálním předním mozku. Mutanti Ttc21b mají abnormální primární řasinky s částečně defektním retrográdním transportem, ale funkčním anterográdním transportem. To má za následek fenotyp GOF, o čemž svědčí nahromadění signalizačního aparátu Shh ve špičkách řasinek a rozšíření exprese/aktivity Shh ve ventrálním telencefalu a zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Mutanti Rpgrip1l mají neuroepiteliální buňky předního mozku, které postrádají primární řasinky a mají nedostatek produkce zpracovaných Gli, jak se očekává u Shh LOF (Besse et al., 2011). Obě tyto mutace vedou k rozšíření subpalia na úkor palia, podobně jako u mutantů Gli3, protože převažujícím výstupem signalizace Shh ve ventrálním předním mozku je zpracování Gli3 na jeho represorovou formu (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Pokud je geneticky vnesen aktivní protein Gli3R, pak jsou řasinky v tomto kontextu nepotřebné (Besse et al., 2011). Defekty ve ventrálním vzorování předního mozku mohou být základem kognitivních poruch u některých ciliopatií.

Defekty související s Sh nevysvětlují všechny fenotypy u lidských ciliopatií. Ukázalo se, že IFT/cilie jsou v některých souvislostech využívány k usnadnění signalizace jinými cestami. Během vývoje kůže savců jsou primární řasinky nezbytné pro terminální diferenciaci suprabazálních buněk, což je proces iniciovaný signalizací Notch/Delta (obr. 1F; Blanpain et al., 2006). V ∼60-70 % suprabazálních buněk je Notch koncentrován v membránách primárních řasinek a presenilin, protein v komplexu γ-sekretázy, který štěpí Notch, je lokalizován v bazálních tělískách (Ezratty et al., 2011). Vyřazení genů IFT nebo odstranění řasinek in vivo vede ke snížení aktivity Notchova reportéru a k poruše diferenciace suprabazálních buněk. Kromě toho byl NICD, aktivní štěpená forma Notch, pozorován v jádrech řasinkových, ale nikoli neřasinkových buněk v genetických chimérách (Ezratty et al., 2011).

Řasinky byly také zapojeny do signalizace PDGF. V kultivovaných fibroblastech byl PDGFRα pozorován v membránách primárních řasinek a RTK aktivované proteiny přenosu signálu MEK1/2 a Akt jsou lokalizovány podél řasinky, respektive na její bázi (Schneider et al., 2005). Studie divokého typu a mutantních fibroblastů Ift88 (bez primárních řasinek) ukázaly, že primární řasinky vedoucích buněk se orientují směrem k místům poranění a jsou nezbytné pro chemotaxi vyvolanou PDGF-AA a reakce fosfo-Akt in vitro (Schneider et al., 2010). Pozoruhodné je, že myši s mutací Ift88 vykazují defekty při opravě ran (Schneider et al., 2010). Signalizace PDGF prostřednictvím PDGFRα se také podílí na rozpadu řasinek a přechodu mezi fázemi G1 a S (diskutováno v Christensen et al., 2012), ačkoli význam tohoto pozorování in vivo není dosud znám.

Úloha řasinek v kanonické signalizaci Wnt je kontroverzní (přehled v Wallingford a Mitchell, 2011). Studie Ift88 a Ift72 mutantních myší a zebřiček naznačily, že řasinky nejsou pro Wnt signalizaci během embryogeneze nezbytné, a studie Wnt signalizace u Kif3a mutantních myší přinesly rozporuplné výsledky (Huang a Schier, 2009; Ocbina a kol., 2009; Lancaster a kol., 2011b). U retrográdních mutantů IFT jedna skupina nezaznamenala žádnou změnu v signalizaci Wnt, zatímco jiná skupina prokázala snížení aktivity Wnt v kontextech, které zachovávají řasinky, ale zvýšení signalizace Wnt v kontextech, které řasinky ztratily (Ocbina a kol., 2009; Lancaster a kol., 2011b). Studie řasinkových/ciliopatických proteinů inversinu, chibby a jouberinu podporují roli řasinek v kanonické signalizaci Wnt ve specifických vývojových kontextech. Inversin, který je mutován u lidských pacientů s nefronoftýzou typu II, je exprimován v monociliích obratlovců, fyzicky interaguje s Disheveled (Dsh) a narušuje kanonickou Wnt signalizaci za Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Inversin mutantní myši vykazují fenotypy vzorování ledvin a vlasů připomínající fenotypy Wnt/Frz a také fenotypy levopravého vzorování, které jsou pravděpodobně způsobeny defekty ve funkci monocilií uzlu (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, protein bazálního tělíska potřebný pro ciliogenezi a dokování bazálního tělíska, fyzicky interaguje s β-kateninem a negativně reguluje kanonickou Wnt signalizaci u embryí Drosophily, plicních epitelů savců a kultivovaných savčích buněk (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). A konečně lidský protein ciliopatie Jouberin je u myší nezbytný pro normální signalizaci Wnt a proliferaci ve střední čáře mozečku. To pravděpodobně přispívá k defektu fúze mozečkových hemisfér pozorovanému u pacientů s lidským Jouberovým syndromem a u myší s deficitem Jouberinu (Lancaster et al., 2011a). V řasinkových buňkách vystavených působení Wnt je Jouberin sekvestrován s β-kateninem v bazálních tělískách způsobem závislým na IFT. Jouberin usnadňuje jadernou translokaci β-kateninu; jeho sekvestrace v bazálních tělískách brání jaderné translokaci β-kateninu a tlumí kanonické signální reakce Wnt (Lancaster et al., 2011b). Tato zjištění společně naznačují, že řasinky nejsou globálně vyžadovány pro signalizaci Wnt během embryogeneze, ale ovlivňují výsledky signalizace Wnt ve vybraných kontextech.

Byla vyslovena hypotéza, že řasinky poskytují specializovanou senzorickou strukturu, v rámci které je koordinováno více typů signálů. Alternativním modelem je, že řasinky vykazují specifičnost pro jednotlivé dráhy (stejně jako cytonemy, o nichž je pojednáno níže), a tím omezují reaktivitu buněk a/nebo prostorově segregují signální odpovědi. Dráhová specifičnost řasinkové signalizace by mohla být zprostředkována rozdílným zacílením signálních proteinů na řasinky a/nebo využitím odlišných podskupin proteinů IFT nebo adaptérů specifických pro transport nákladu axonem (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).

.