Effekter av cykloheximid på tolkningen av ribosomprofileringsexperiment i Schizosaccharomyces pombe

Experimentell design och reproducerbarhet

För att undersöka effekterna av CHX på ribosomprofileringsexperiment tillämpade vi denna teknik på S. pombe-celler som växer exponentiellt (ostressade) och efter en timmes kvävesvält (näringsstress). Varje kultur delades upp i två och en av dem inkuberades med CHX i en koncentration på 100 µg/ml i 5 minuter före insamling (detta är den ”standard”-koncentration som används i majoriteten av de publicerade experimenten). Cellerna samlades upp genom filtrering och snabbfrystes omedelbart i flytande kväve för att förhindra ytterligare translation. Observera att CHX fanns i lysisbuffertar för alla prover. Därför gäller alla hänvisningar till CHX-behandling nedan endast tillsättning av CHX i odlingsmediet. Vi utförde två oberoende biologiska replikat för vart och ett av de fyra experimenten (plus/minus kväve, plus/minus CHX). För varje prov framställde och isolerade vi ribosomskyddade fragment (RPF eller ribosomfotspår) enligt beskrivningen i Metoder och analyserade dem med hjälp av Illumina-sekvensering med hög kapacitet. Vi sekvenserade också rRNA-depleterat RNA från vart och ett av de åtta proverna (RNA-seq). För att utvärdera teknikens reproducerbarhet kvantifierade vi för varje experiment antalet RPF- och RNA-seq-avläsningar som kartlades till varje annoterad kodningssekvens i S. pombe-genomet. Data var mycket reproducerbara, med genomsnittliga korrelationer mellan oberoende biologiska replikat på 0,97 (tabell 1). Vi fokuserar nedan på hur CHX påverkar ribosomprofileringsexperiment. En mer fullständig analys av biologin i S. pombe-cellernas svar på kvävehunger kommer att publiceras på annat håll.

För att undersöka effekterna av CHX undersökte vi fyra aspekter av translation: 1] Total ribosomtäthet för kodande sekvenser av enskilda gener, 2] närvaro av ribosomer på 5′-ledarsekvenser, 3] bias i ribosomplacering över kodande sekvenser och 4] fördelning av ribosomer längs enskilda kodoner.

Ribosomtäthet

Vi kvantifierade antalet RPF-läsningar på kodande sekvenser för varje annoterad gen i celler som behandlades med CHX eller mock-behandlade. Under kväve-starnation var korrelationen mellan de båda behandlingarna mycket hög (genomsnittlig R = 0,96), men ~4,5 % av alla gener uppvisade konsekvent högre ribosomtäthet i närvaro av CHX (2-faldigt eller högre i båda replikaten, fig. 1a och kompletterande fig. S1). Liknande förändringar observerades inte i mRNA-prover (genomsnittlig R = 0,98), vilket tyder på att denna effekt berodde på förändringar i translation och inte i transkriptomet (fig. 1a, kompletterande fig. S1).

Effekter av CHX på den totala ribosomtätheten på kodande sekvenser. (a) Scatter plots som jämför mRNA-nivåer (överst) och ribosomtätheter (nederst) mellan obehandlade och CHX-behandlade celler. Data presenteras för celler som växer i närvaro av en kvävekälla (+N) eller som är utsvultna för kväve (-N). Gener som kodar för ribosomala proteiner visas i grönt. Alla data har normaliserats till RPKM (Reads Per Kilobase per Million mappade reads). (b) Till vänster: Boxplots som jämför ribosomtätheter mellan obehandlade och CHX-behandlade celler för grupper av gener med de angivna genomsnittliga längderna på de kodande sekvenserna. Höger: Liknande data för angivna längder av 5′-ledarsekvenser. De röda rutorna visar beteendet hos mRNA som kodar för ribosomala proteiner. (c) Jämförelse av förändringar i mRNA-nivåer och ribosomala tätheter mellan celler som är utsvultna för kväve (-N) och ostressade celler (+N). Data presenteras för CHX-behandlade celler (vänster) och för obehandlade celler (vänster). Gener som kodar för ribosomala proteiner visas i grönt.

Förvånansvärt nog omfattade denna grupp de flesta gener som kodar för ribosomala proteiner (RPs, Fig. 1a och Supplementary Fig. S1, gröna prickar). För att utesluta möjligheten att CHX orsakar subtila förändringar i mRNA-nivåerna jämförde vi de förändringar som inducerades av kvävesvält i närvaro eller frånvaro av CHX (kompletterande figur S2). Medianveckningsförändringen i mRNA-nivåer för RP-gener var 0,25 i CHX-behandlade prover och 0,24 i obehandlade celler, vilket bekräftar att förändringar i ribosomal täthet för RP-gener vid kvävesvält beror på förändringar i translation.

RP-gener är generellt sett ganska korta, med en medianlängd på 447 nukleotider jämfört med 1 131 för alla gener. En enkel förklaring till denna anrikning kan därför vara att CHX förhindrar ribosom-”avrinning” från korta gener under cellinsamling, vilket ökar deras skenbara ribosomtäthet. Även om det fanns en liten tendens till att ribosomtätheten i kortare gener var högre i närvaro av CHX, var detta dock en mindre effekt och kunde inte förklara beteendet hos ribosomala proteingener (fig. 1b). De mRNA som kodas av dessa gener tenderar också att ha kortare 5′-ledarsekvenser (en median på 68,5 nukleotider jämfört med 173 för alla gener), men det fanns ingen övergripande korrelation mellan 5′-ledarlängder och högre ribosomtäthet i CHX (fig. 1c). Endast 9 kärnkodade gener (~0,2 %) uppvisade en minskning av ribosomtätheten i CHX (fig. 1a och kompletterande fig. S1), och de saknade gemensamma drag.

I motsats till detta hade läkemedlet under icke-stressförhållanden en mycket svag effekt på ribosomtätheten (genomsnittlig R = 0,98), med mindre än 1 % av generna som uppvisade skillnader i täthet som var större än 2-faldig (23 gener som var högre i CHX och 9 lägre, fig. 1a och kompletterande fig. S1). Intressant nog var den lilla grupp gener som uppvisade lägre densitet i celler som behandlades med CHX också anrikad på ribosomala proteingener (12/23 mRNA).

Vi drar slutsatsen att mRNA som kodar för RP är särskilt känsliga för närvaron av CHX, och att detta fenomen inte kan förklaras enbart av deras korta 5′-ledare och kodande sekvenser. Dessutom är effekten endast stark under näringsmässig stress. Dessa resultat avslöjar dock inte vilket av de två proverna (CHX-behandlade eller -fria) som bättre återspeglar situationen in vivo. RP-gener är till exempel rika på optimala kodoner, vilket innebär att översättningselongationen sker med hög hastighet. Denna egenskap, tillsammans med deras korta längd, kan göra dem mer känsliga för ribosomavrinning vid insamling. I detta fall skulle CHX stabilisera fördelningen in vivo. Alternativt är det också möjligt att CHX har en direkt effekt på översättningen av dessa mRNA, vilket leder till ofysiologiska ribosomtätheter.

Vi undersökte sedan om förändringarna i ribosomtätheten som orsakas av CHX skulle påverka tolkningen av det translationella/transkriptionella svaret på kvävesvält. Vi kvantifierade translationseffektiviteten (TE) genom att normalisera RPF-räkningar med mRNA-nivåer och beräknade logförändringen i TE- och transkriptnivåer mellan celler som vuxit i kvävehaltigt medium och kvävearmerade celler (fig. 1c och kompletterande fig. S1B). I närvaro av CHX ledde kvävesvält till en tydlig nedreglering av nivåerna av mRNA som kodar för RPs, men påverkade inte deras TE. I experiment som utfördes i avsaknad av CHX verkade däremot dessa mRNA:er vara nedreglerade både på mRNA- och TE-nivå. Förinkubation med CHX i mediet kan således påverka TE för specifika grupper av gener. Mängden mRNA som kodar för RPs är mycket starkt samreglerad22,23,24; våra resultat visar att dessa mRNAs också uppvisar ett samordnat beteende på translationseffektivitetsnivå. Orsaken till dessa mRNA:s extrema känslighet för CHX återstår att klargöra.

För majoriteten av generna har dock behandling med CHX ingen effekt på den ribosomala tätheten oavsett tillväxtförhållande. Liknande resultat har rapporterats för däggdjursceller som odlas i kultur, där CHX inte har någon signifikant effekt på genspecifika ribosomtätheter. Detta har dock endast undersökts i ostressade celler13.

Förändringar i användningen av uppströms öppna läsramar

S. cerevisiae-celler uppvisar en ackumulering av ribosomavtryck i 5′-ledarsekvenser som ökar under stressförhållanden, vilket tyder på en högre användning av uORFs1, 9, 10. Dessa slutsatser har dock ifrågasatts och tillskrivits användningen av CHX i cellodling8.

För att besvara denna fråga i S. pombe jämförde vi ackumuleringen av reads i 5′-ledarsekvenser och kodande sekvenser (Fig. 2a) före och efter kvävesvält. Vi kvantifierade först detta värde genom att mäta förhållandet mellan det totala antalet ribosomavtryck i 5′-ledare och i kodande sekvenser. Kvävesvält i CHX-behandlade celler orsakade en genomsnittlig ökning på 5,5 gånger, medan obehandlade celler hade en genomsnittlig ökning på 2,1 gånger (båda anrikningarna var konsekventa över biologiska replikat, fig. 2b). Eftersom de totala förhållandena kan domineras av förändringar i ett litet antal mycket rikliga gener kvantifierade vi också förhållandena mellan fotspår i 5′-ledare och kodande sekvenser för alla enskilda transkript som klarade uttryckströskeln (se Metoder för detaljer, och Fig. 2c och Supplementary Fig. S3 för resultaten). I överensstämmelse med det tidigare resultatet fanns det en tydlig ökning av ribosomavtrycken i 5′-ledarsekvenser vid kvävesvält för majoriteten av generna (fig. 2c och kompletterande fig. S3; observera att ökningen i den andra replikaten är mindre, men fortfarande signifikant), med genomsnittliga ökningskvoter på 3,8 och 1,9 för plus/minus CHX respektive (fig. 2d, observera det liknande beteendet för båda replikaten). I motsats till resultaten från S. cerevisiae ökade alltså 5′-ledarribosomtätheterna av näringsstress i alla experiment, även om effekten var betydligt större i CHX-behandlade celler. En möjlig invändning är naturligtvis att S. cerevisiae-studien använde en annan typ av stress8. Med tanke på att en viss ackumulering observeras både med och utan läkemedelsbehandling kan vi ändå dra slutsatsen att i S. pombe leder kvävehunger till högre ribosomtätheter på 5′-ledarsekvenser. Denna ökade täthet kan bero på översättning av uORFs, även om vi inte kan utesluta att den återspeglar ökat brus i stressade prover. I kompletterande figur S4 presenteras två exempel på uORFs som inducerats som svar på kvävesvält. Den biologiska betydelsen och den mekanistiska grunden för detta fenomen (samt om det är generellt för alla stressförhållanden) är fortfarande okänd.

Effekter av CHX på ribosomtätheter på 5′-ledarsekvenser. (a) Experimentell utformning: RPF:er i kodande sekvenser (CDS) och 5′ ledarsekvenser kvantifieras i olika experimentella förhållanden. (b) Förhållandet mellan totala läsningar som mappas till 5′ ledarsekvenser och totala läsningar som mappas till kodande sekvenser (CDS) för ostressade celler (+N) och kvävesvultna celler (-N), och för celler som behandlats eller inte behandlats med CHX (±CHX). Siffrorna anger vikdifferensen mellan par av -N- och +N-prover. Data presenteras för två biologiska replikat. (c) Spridningsdiagram som jämför förhållandet mellan läsningar som mappas till 5′-ledarsekvenser och läsningar som mappas till kodande sekvenser (CDS) för enskilda gener; varje diagram jämför ostressade celler (+N) och kvävesvultna celler (-N). Data presenteras för celler som behandlats med CHX (vänster) eller obehandlade (höger). De röda linjerna motsvarar ett förhållande på 1. (d) Medelvärden för de förhållanden som presenteras i (c). Siffrorna anger vikdifferensen mellan par av -N- och +N-prover. Data visas för två biologiska replikat.

Distribution av ribosomer längs kodningssekvenser

S. Cerevisiae-celler uppvisar en asymmetrisk ribosomfördelning över kodningssekvenser, med en bred topp av högre ribosombeläggning i de inledande ~300-400 nukleotiderna i kodningssekvensen1, 9, 14, 20 som är starkt förstärkt av olika påfrestningar1, 8, 12.

Vi undersökte detta fenomen i S. pombe på två sätt: för det första genom att beräkna förhållandet mellan fotavtryck i nukleotiderna 10-400 och 401-800 (fig. 3a-c, de första 9 nukleotiderna togs inte med i beräkningen för att undvika bias som skapas av ackumulationen av ribosomer vid inledande AUG); för det andra genom att undersöka beteendet hos en metagen som representerar ribosomtätheten i hela genomet längs kodningssekvenser (fig. 3d och kompletterande figur S5).

Effekter av CHX på ribosomfördelningen längs kodningssekvenser. (a) Experimentell utformning: RPF på nukleotiderna 10-400 och på nukleotiderna 401-800 kvantifieras i olika experimentella förhållanden, och förhållandet mellan de båda siffrorna beräknas. (b) Medelkvoten beräknad enligt beskrivningen i A för alla kodningssekvenser, i närvaro och frånvaro av en kvävekälla (±N) och i närvaro och frånvaro av CHX-behandling (±CHX). Siffrorna anger vikdifferensen mellan parade -N- och +N-prover. Data presenteras för två biologiska replikat. (c) Spridningsdiagram som jämför de förhållanden som erhållits enligt definitionen i A för enskilda gener; varje diagram jämför ostressade celler (+N) och kvävesvultna celler (-N). Data presenteras för celler som behandlats med CHX (vänster) eller obehandlade (höger). De röda linjerna motsvarar en kvot på 1. (d) Metagene som visar den genomsnittliga fördelningen av RPFs längs kodande sekvenser i fyra experimentella förhållanden. Ett löpande fönster på 60 nukleotider användes för att jämna ut de plottade linjerna.

I avsaknad av stress uppvisade S. pombe-cellerna små skuldror både i närvaro och i avsaknad av läkemedlet, liknande dem som rapporterats för S. cerevisiae utan CHX1, 14, 20 (fig. 3d och kompletterande fig. S5). Vid näringsmässig stress uppförde sig S. pombe på samma sätt som S. cerevisiae 12. I närvaro av CHX fanns det en tydlig ackumulering av läsningar i 5′-delen av den kodande sekvensen i majoriteten av generna (fig. 3c och kompletterande fig. S5, vänster plot), vilket också återspeglades i en ~2,0-faldig ökning av den genomsnittliga tätheten i de första 400 nukleotiderna av mRNA (fig. 3b). Däremot var denna ökning försumbar i frånvaro av läkemedlet, både när enskilda gener undersöktes (fig. 3c (höger plot) och kompletterande fig. S5) och när de genomsnittliga förhållandena mättes (fig. 3b, notera att båda replikaten uppförde sig konsekvent). Dessutom bekräftades CHX-beroendet av ackumuleringen av läsningar vid kvävesvält av metagendata (fig. 3d och kompletterande fig. S5). Slutligen fastställde vi att denna effekt var specifik för RPF:er genom att plotta en metagene baserad på mRNA-seq-data (kompletterande fig. S5).

Vi funderade också på om dessa observationer också skulle gälla för mindre gener. Med detta syfte genererade vi metagenes för RP-gener och för små gener (mindre än 200 kodoner) exklusive RP-gener. I båda fallen orsakade CHX en tydlig ökning på 5′-sidan av de kodande sekvenserna (särskilt för RP-gener), som var beroende både av kvävehunger och CHX-behandling (kompletterande figur S5).

Det fanns dessutom en ackumulering av ribosomer på initieringskodoner (kompletterande figur S6). Denna egenskap fanns redan i obehandlade celler, även om den förhöjdes vid CHX-inkubation (både i kontrollceller och kvävesvultna celler). Denna anrikning var något högre i kväveförsörjda celler, oberoende av CHX-behandling (Supplementary Fig. S6).

Det finns alltså en tydlig anhopning av ribosomer i den inledande delen av kodningssekvenser, som är bevarad i S. pombe och S. cerevisiae, och som kan observeras både med och utan CHX-förbehandling. Däremot observeras den stressinducerade förstärkningen inte konsekvent i avsaknad av CHX i båda jästsvamparna, och därför finns det inte tillräckliga bevis för att den förekommer in vivo. I framtiden kan användningen av in vivo tvärbindningsstrategier25 hjälpa till att skilja mellan dessa två tolkningar.

Kodonbeläggning

I princip är den normaliserade ribosomala beläggningen av enskilda kodoner relaterad till den tid som ribosomen tillbringar vid varje kodon, och kan därför användas för att uppskatta den genomsnittliga kodonspecifika översättningshastigheten. De första experimenten för att undersöka detta fenomen gav dock motstridiga resultat17,18,19,20. I en elegant studie av Hussmann et al. som omfattade nya experiment, metaanalys av många ribosomprofileringsexperiment från S. cerevisiae och matematisk modellering9 konstaterades att dessa motsättningar kunde förklaras av CHX:s effekt på bestämmandet av kodonspecifika ribosomupptagningar. Experiment från olika grupper som utfördes i närvaro av CHX hade liknande ribosomkodonbeläggningar som de som utfördes utan läkemedlet. Korrelationerna mellan CHX- och icke-CHX-analyser var dock mycket låga. Dessutom resulterade experiment med CHX i kodonspecifika översättningshastigheter som uppvisade negativa korrelationer med förekomsten av kognat tRNA, medan de som inte innehöll CHX-behandling uppvisade de förväntade positiva korrelationerna9, 20. Hussmann et al. föreslog att ribosomerna inte omedelbart stoppar översättningen i närvaro av CHX i mediet. Istället fortsätter översättningen för ett fåtal kodoner med kodonspecifika översättningshastigheter9, vilket orsakar artefaktuella kodonbeläggningar.

För att undersöka detta fenomen analyserade vi kodonspecifika ribosomala beläggningar vid A-sites enligt beskrivningen i Metoder. I korthet tilldelade vi varje läsning som kartläggs till en kodande sekvens till A-sidan av en ribosom (som motsvarar nukleotid 16 i ett ribosomskyddat fragment). Vi beräknade sedan den normaliserade beläggningen för varje kodon i hela genomet (genom att dividera frekvensen med vilken ribosomen är placerad på varje kodon med förekomsten av kodonet i mRNA). I avsaknad av bias skulle detta värde förväntas återspegla den genomsnittliga tid som ribosomen tillbringar vid varje kodon.

Vi jämförde först effekten av CHX på kodonspecifika ribosomala ockupationer (Fig. 4, Supplementary Figs S7 och S8). Överraskande nog var korrelationen mellan de båda experimenten mycket hög, med medelvärden på 0,82 för kväve-starnation (fig. 4a och kompletterande fig. S7) och 0,86 för ostressade celler (fig. 4b och kompletterande fig. S7). I liknande jämförelser i S. cerevisiae var majoriteten av korrelationerna negativa9. Till exempel hade sällsynta kodoner som CCG (prolin) och CGG (arginin) bland de högsta beläggningarna i frånvaro av CHX, men förlorade denna berikning i CHX-behandlade prover9. I S. pombe-dataset var däremot både CCG och CGG anrikade oavsett förekomst av CHX (om än mindre starkt i obehandlade celler, fig. 4c och kompletterande fig. S7). Dessutom hade näringsstress mycket liten effekt på kodonspecifika ribosomala beläggningar både i närvaro (Fig. 4c och Supplementary Fig. S7, genomsnittlig R = 0,96) och i frånvaro av CHX (Fig. 4d och kompletterande figur S7, genomsnittlig R = 0,98).

Effekter av CHX på relativa kodonbeläggningar. Spridningsdiagram som visar de relativa kodonbestämningarna som erhållits enligt beskrivningen i Metoder. Varje punkt motsvarar ett enskilt kodon. Terminationskoder visas inte. Positionerna för de sällsynta kodonerna CCG och CGG anges. De streckade linjerna motsvarar 1,5-faldiga skillnader. Pearsonkorrelationerna mellan dataset anges. (a) Jämförelse av effekterna av CHX-behandling i kvävehärjade celler. (b) Som i (a), för celler som odlas med en kvävekälla. (c) Jämförelse av effekterna av kvävesvält i närvaro av CHX. (d) Som i (c), i frånvaro av CHX.

Slutligt bedömde vi korrelationen mellan tRNA-abundans och kodonspecifika beläggningar. Detta gjordes med hjälp av tRNA Adaptation Index (tAI), som är ett mått på tRNA-användning för varje kodon delvis baserat på tRNA-kopieringsantalet (högre antal förutspår effektivare översättning)26 . S. cerevisiae-experiment som utförs i närvaro av CHX i kulturen visar negativa korrelationer mellan den omvända delen av tAI (1/tAI) och kodonspecifik beläggning, vilket förutsäger att kodoner med lågt tAI (och därmed låga tRNA-förekomster) skulle översättas snabbare. Däremot visade experiment med celler som inte förbehandlats med CHX den förväntade positiva korrelationen mellan 1/tAI (även om de faktiska värdena var mycket varierande mellan experimenten)9 . I S. pombe fann vi att i vart och ett av de åtta ribosomprofileringsexperimenten uppvisade kodonspecifika beläggningar en positiv korrelation med 1/tAI, med ett genomsnitt på 0,39 (tabell 2).

Våra resultat visar att CHX i S. pombe har en relativt liten effekt på ribosomernas position på specifika kodoner. Detta skulle kunna förklaras av att S. pombe-celler är särskilt känsliga för CHX, så att CHX skulle blockera ribosomernas rörelser snabbare och fullständigare än i S. cerevisiae. Denna egenskap skulle förhindra att ribosomerna rör sig i ändrade hastigheter (vilket antas ske i S. cerevisiae) och leda till en situation där S. pombe CHX-behandlade och obehandlade celler skulle ha liknande ribosomfördelningar i stationärt tillstånd. Det faktum att sällsynta kodoner är mindre anrikade i närvaro av CHX tyder dock på att CHX bör utelämnas i experiment som syftar till att bestämma kodonspecifika ribosomfördelningar.