Effects of cycloheximide on interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe

実験デザインと再現性

To examine effects of CHX on ribosome profiling experiments we applied this technique to S. Pombe.The S. Robosome profiling experiment. pombe の指数関数的に成長する細胞（ストレスなし）と窒素飢餓（栄養ストレス）1 時間後にこの手法を適用しました。 各培養物を2つに分け、そのうちの1つを、回収前に100 µg/mlの濃度で5分間CHXとともにインキュベートした（これは、発表された実験の大部分で使用されている「標準」濃度である）。 細胞はろ過によって集められ、さらなる翻訳を防ぐために直ちに液体窒素で瞬間凍結された。 CHXはすべてのサンプルの溶解バッファーに含まれていたことに注意。 従って、以下のCHX処理への言及はすべて、培養液への添加のみに適用される。 つの実験（プラス／マイナス窒素、プラス／マイナスCHX）それぞれについて、2つの独立した生物学的複製を実施した。 各サンプルについて、Methodsに記載したようにリボソーム保護断片（RPFまたはリボソームフットプリント）を調製し単離し、ハイスループットイルミナシーケンスを用いて分析した。 また、8つのサンプルのそれぞれからrRNAを除去したRNAの配列決定も行った（RNA-seq）。 技術の再現性を評価するために、各実験について、S. pombeゲノムの各注釈付きコーディング配列にマッピングされたRPFおよびRNA-seqリードの数を定量化した。 データの再現性は高く、独立した生物学的複製間の平均相関は0.97であった（表1）。 以下では、CHXがリボソームプロファイリング実験にどのような影響を与えるかに焦点を当てる。 窒素飢餓に対するS. pombe細胞の反応の生物学のより完全な分析は、別の場所で発表される予定である。

CHXの効果を調べるために、翻訳の4側面を調べた。 1] 個々の遺伝子のコーディング配列におけるリボソーム密度、2] 5′リーダー配列におけるリボソームの存在、3] コーディング配列におけるリボソームの位置の偏り、4] 個々のコドンにおけるリボソームの分布である。 窒素飢餓条件下では、両処理間の相関は非常に高かったが（平均R = 0.96）、全遺伝子のうち〜4.5%がCHX存在下で常に高いリボソーム密度を示した（両複製で2倍以上、図1aおよび補図S1）。 同様の変化はmRNAサンプルでは観察されず（平均R = 0.98）、この効果はトランスクリプトームではなく、翻訳の変化に起因することが示された（図1a、補足図S1）

コーディング配列上の全体のリボソーム密度に対するCHXの効果。 (a) 未処理とCHX処理細胞のmRNAレベル（上）とリボソーム密度（下）を比較した散布図。 データは、窒素源の存在下（+N）または窒素飢餓（-N）で成長する細胞について提示されている。 リボソームタンパク質をコードする遺伝子は緑色で示されている。 すべてのデータはRPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）で正規化されている。 (b) 左：コーディング配列の平均長を示した遺伝子群について、未処理細胞とCHX処理細胞とのリボソーム密度を比較した箱ひげ図。 右：5′リーダー配列の長さを示した場合の類似データ。 赤いボックスは、リボソームタンパク質をコードするmRNAの挙動を示す。 (c) 窒素飢餓細胞（-N）と非窒素飢餓細胞（+N）の間のmRNAレベルおよびリボソーム密度の変化の比較。 データはCHX処理細胞（左）および未処理細胞（左）について示している。 リボソームタンパク質をコードする遺伝子は緑色で示した。

意外にも、このグループにはリボソームタンパク質（RP、図1aおよび補足図S1、緑の点）をコードする遺伝子がほとんど含まれていた。 CHX が mRNA レベルの微妙な変化を引き起こす可能性を排除するために、CHX の存在下または非存在下で窒素飢餓によって誘発される変化を比較した (補足図 S2)。 RP遺伝子のmRNAレベルの変化量の中央値は、CHX処理サンプルで0.25、未処理細胞で0.24であり、窒素飢餓によるRP遺伝子のリボソーム密度の変化は、翻訳の変化に起因することが確認された

RP 遺伝子は一般に非常に短く、長さの中央値は、全遺伝子が1131であるのに対し447 nucleotideだった。 したがって、この濃縮の単純な説明は、CHXが細胞収集中に短い遺伝子からのリボソームの「流出」を防ぎ、その結果、見かけのリボソーム密度が増加することであると考えられる。 しかし、CHX存在下では短い遺伝子のリボソーム密度が高くなる傾向がわずかに見られたが、これはわずかな効果であり、リボソームタンパク質遺伝子の挙動を説明することはできなかった（図1b）。 これらの遺伝子によってコードされるmRNAは、5′リーダー配列も短い傾向にある（中央値68.5ヌクレオチド対全遺伝子173）が、5′リーダー長さとCHXにおけるリボソーム密度の高さの間には全体として相関は見られなかった（Fig. 1c）。 一方、非ストレス条件下では、薬剤のリボソーム密度への影響は非常に弱く（平均R = 0.98）、2倍以上の密度の差を示した遺伝子は1%未満であった（CHXで高い23遺伝子と低い9遺伝子、図1aおよび補足図S1）。 興味深いことに、CHXで処理した細胞で低い密度を示した小さな遺伝子群は、リボソームタンパク質遺伝子にも富んでいた（12/23 mRNA）。

我々は、RPをコードするmRNAはCHXの存在に特に敏感であり、この現象はその短いリーダーおよびコード配列だけでは説明できないことを結論づけた。 また、この効果は栄養ストレス下でのみ強く現れる。 しかし、これらの結果は、2つのサンプル（CHX処理と-未処理）のどちらがよりよく生体内の状況を反映しているかを明らかにするものではありません。 例えば、RP遺伝子は最適コドンが豊富で、翻訳伸長が高速で行われることを示唆している。 この特性は、その短い長さとともに、収集中のリボソームの流出に対してより敏感である可能性がある。 この場合、CHXはin vivoでの分布を安定化させるだろう。 あるいは、CHXがこれらのmRNAの翻訳に直接影響を与え、生理的でないリボソーム密度をもたらす可能性もある。

次に、CHXによるリボソーム密度の変化が窒素飢餓に対する翻訳/転写反応の解釈に影響を与えるか否かを検討した。 RPF 数を mRNA レベルで正規化することで翻訳効率 (TE) を定量化し、窒素含有培地で培養した細胞と窒素飢餓状態の細胞との TE および転写レベルの対数変化を計算した (図 1c および補足図 S1B)。 CHX存在下、窒素飢餓はRPをコードするmRNAのレベルを明らかにダウンレギュレーションさせたが、そのTEには影響を与えなかった。 一方、CHX非存在下で行った実験では、これらのmRNAはmRNAレベルおよびTEレベルの両方でダウンレギュレートされているように見えた。 このように、培地中のCHXによるプレインキュベーションは、特定の遺伝子群のTEに影響を与えることができる。 RP をコードする mRNA の存在量は、非常に厳密に共同制御されている22,23,24; 今回の結果は、これらの mRNA が翻訳効率レベルでも協調的な挙動を示すことを示している。 これらのmRNAがCHXに極めて敏感である理由は、まだ解明されていない。

しかし、大部分の遺伝子について、CHX処理は増殖条件にかかわらずリボソーム密度に影響を及ぼさない。 同様の結果は、培養で成長した哺乳類細胞でも報告されており、CHXは遺伝子固有のリボソーム密度に大きな影響を及ぼさない。 しかし、これはストレスのない細胞でしか調べられていない13。

Changes in the use of upstream Open Reading Frames

S. cerevisiae細胞では、ストレス条件下で5′リーダー配列のリボソームフットプリントの蓄積が増加し、uORFの使用率が高いことが示されている1, 9, 10. しかし、これらの結論には異論もあり、細胞培養におけるCHXの使用に起因するとされている8。

この疑問に答えるため、S. pombeでは窒素飢餓の前後で5′リーダーおよびコーディング配列（図2a）のリードの蓄積を比較した。 まず、5′リーダー配列とコーディング配列のリボソームフットプリントの総数の比率を測定することにより、この値を定量化した。 CHX処理細胞における窒素飢餓は、平均5.5倍の増加を引き起こし、未処理細胞は平均2.1倍の増加を示した（両方の濃縮は生物学的複製間で一貫していた、図2b）。 総比率は少数の高濃度遺伝子の変化に支配される可能性があるため、発現閾値を通過したすべての個々の転写産物について、5′リーダーにおけるフットプリントとコーディング配列間の比率も定量した（詳細は方法、結果は図2cと補足図S3参照）。 前回の結果と同様に、大部分の遺伝子で窒素飢餓に伴い5′リーダー配列のリボソームフットプリントが明らかに増加し（図2cおよび補足図S3；2番目の複製での増加は小さいが依然として有意であることに注意）、プラス／マイナスCHXでそれぞれ平均増加比が3.8および1.9であった（図2d；両方の複製で同様の挙動であることに注意）。 このように、S. cerevisiaeの結果とは対照的に、5′リーダーリボソーム密度は、すべての実験で栄養ストレスにより増加したが、その効果はCHX処理した細胞で大幅に高かった。 もちろん、S. cerevisiaeの研究では、異なるタイプのストレスが使用されていることが注意点として考えられる8。 しかしながら、薬物処理の有無にかかわらず、ある程度の蓄積が観察されることから、S. pombeでは窒素飢餓が5′リーダー配列上のリボソーム密度を高くすると結論づけることができる。 この密度の増加は、uORFの翻訳に起因する可能性があるが、ストレスのかかったサンプルのノイズの増加を反映している可能性は排除できない。 補足図S4は、窒素飢餓に応答して誘導されるuORFの2つの例を示している。 この現象の生物学的重要性とメカニズム的基礎（また、すべてのストレス条件に一般的であるかどうか）はまだ不明である。

5′ リーダー配列上のリボソーム密度に対するCHXの効果。 (a)実験デザイン。 コード配列（CDS）と5′リーダー配列のRPFは、異なる実験条件で定量される。 (b)非ストレス細胞（+N）と窒素飢餓細胞（-N）、およびCHXで処理した細胞と処理していない細胞（±CHX）のコーディング配列（CDS）にマッピングされた全リードに対する5′リーダー配列への全リード数の比率。 数字は、-Nと+Nのサンプルペア間の倍率差を示す。 データは2つの生物学的複製について提示されている。 (c）個々の遺伝子について、5′リーダー配列にマッピングされたリードとコーディング配列（CDS）にマッピングされたリードの比率を比較する散布図であり、各プロットは、ストレスなしの細胞（+N）と窒素飢餓細胞（-N）を比較する。 データは、CHXで処理した細胞（左）または未処理の細胞（右）について示されている。 赤線は比率が1に相当する。 (d) (c)で示した比率の平均値。 数字は、-Nと+Nのサンプルの組の間の倍率差を示す。 4969>

Distribution of ribosomes along coding sequences

S． S. cerevisiaeの細胞は、コーディング配列に沿って非対称なリボソーム分布を示し、コーディング配列の最初の約300-400ヌクレオチドに高いリボソーム占有率の広いピークがあり1, 9, 14, 20、これは異なるストレスによって強く増強される1, 8, 12。 一つは、ヌクレオチド 10 から 400 と 401 から 800 のフットプリントの比率を計算する方法（図 3a-c、開始 AUG でのリボソームの蓄積によって生じる偏りを避けるために最初の 9 ヌクレオチドは考慮しない）、もう一つは、コーディング配列に沿ってゲノム全体のリボソーム密度を表すメタ遺伝子の挙動を調べる方法（図 3a-c）である。 3dおよび補足図S5）。

Effects of CHX on ribosome distribution across coding sequences.図3はリボソームの分布に与える影響について示している。 (a)実験デザイン。 ヌクレオチド10〜400およびヌクレオチド401〜800上のRPFを異なる実験条件で定量し、両数の比率を計算する。 (b）全てのコーディング配列について、窒素源の有無（±N）およびCHX処理の有無（±CHX）で、Aに記載したように計算した平均比を示す。 数字は、対になった-Nと+Nのサンプル間の倍率差を示す。 データは、2つの生物学的複製について提示されている。 (c) 個々の遺伝子についてAで定義したように得られた比率を比較する散布図；各プロットは、非ストレス細胞（+N）と窒素飢餓細胞（-N）を比較する。 データは、CHXで処理した細胞（左）または未処理の細胞（右）について提示されている。 (d) 4つの実験条件におけるコーディング配列に沿ったRPFの平均分布を示すメタジーン。 プロットした線を平滑化するために60ヌクレオチドのランニングウィンドウを用いた。

ストレスがない場合、S. pombe細胞はCHXなしのS. cerevisiaeで報告されたものと同様に薬剤存在、不在ともに小さな肩の動きを見せた1, 14, 20（図3d、補遺図S5）。 栄養ストレスに対しては、S. pombeはS. cerevisiaeと同様の挙動を示した12。 CHX存在下では、大部分の遺伝子でコーディング配列の5′部分に明確なリードの蓄積が見られ（図3c、補足図S5、左図）、これはmRNAの最初の400塩基における平均密度の約2.0倍増加にも反映されていた（図3b）。 一方、薬剤非存在下では、個々の遺伝子を調べた場合（図3c（右図）、補足図S5）、および平均比率を測定した場合（図3b、両複製とも一貫した挙動を示したことに注意）の両方で、この増加は無視できるものであった。 さらに、窒素飢餓に伴うリードの蓄積のCHX依存性はメタ遺伝子データでも確認された（図3d、補足図S5）。 最後に、この効果がRPFに特異的であることを、mRNA-seqデータに基づくメタ遺伝子をプロットすることで確認した（補図S5）。

また、これらの観察がより小さな遺伝子にも当てはまるかどうかを検討した。 この目的で、RP遺伝子と、RP遺伝子を除く小型遺伝子（コドン数200以下）のメタジェネを作成した。 いずれの場合も、CHXはコーディング配列の5′側に明らかな増加をもたらし（特にRP遺伝子）、これは窒素飢餓とCHX処理の両方に依存していた（補足図S5）

さらに、開始コドン上にリボソームの集積が見られた（補足図S6）。 この特徴は、CHX インキュベーションで上昇したが、未処理細胞ですでに存在していた (コントロールおよび窒素飢餓細胞の両方で)。 この濃縮は、CHX処理とは無関係に窒素飢餓細胞でわずかに高かった（補足図S6）。

したがって、コーディング配列の初期部分にリボソームの明確な蓄積があり、これはS. pombeおよびS. cerevisiaeで保存され、CHX前処理の有無にかかわらず観察することができた。 一方、ストレスによる増強は、両酵母ともCHX非存在下では一貫して観察されず、生体内で起こっていることを示す十分な根拠はない。 将来的には、in vivoでの架橋戦略25の利用が、これら2つの解釈の区別に役立つかもしれない。

コドン占有率

原理的には、個々のコドンに対する正規化リボソーム占有率は、リボソームが各コドンにおいて費やす時間と関連しており、したがって平均コドン特異的翻訳率の推定に用いることが可能である。 しかし、この現象を調べるための最初の実験では、相反する結果が得られた17,18,19,20。 Hussmannらによる新規実験、S. cerevisiaeの多数のリボソームプロファイリング実験のメタ解析、数学的モデリングを含むエレガントな研究は、これらの矛盾がコドン特異的リボソーム占有率の決定に対するCHXの効果によって説明できることを見いだした9。 CHXの存在下で行われた異なるグループの実験では、薬剤なしで行われた実験と同様に、リボソームのコドン占有率が互いに類似していたのです。 しかし、CHX-と非CHXのアッセイ間の相関は非常に低かった。 さらに、CHXを用いた実験では、コドン特異的翻訳率は同族tRNAの存在量と負の相関を示したが、CHX処理を行わない実験では期待通りの正の相関を示した9, 20。 Hussmannらは、培地中にCHXが存在しても、リボソームはすぐに翻訳を停止しないことを提案した。 この現象を調べるために、メソッドに記載したように、Aサイトのコドン特異的リボソーム占有率を分析した。 簡単に言うと、コード配列にマッピングされた各リードをリボソームのAサイト（リボソームで保護された断片のヌクレオチド16に対応する）に割り当てたのである。 次に、ゲノム全体の各コドンの正規化占有率を計算した（各コドン上にリボソームが配置される頻度をmRNA上のコドンの存在量で割ったもの）。 この値は、偏りがなければ、リボソームが各コドンに滞在する平均時間を反映していると考えられる。 驚いたことに、両実験の相関は非常に高く、窒素飢餓の平均値は 0.82 (Fig. 4a and Supplementary Fig. S7) 、非ストレスの細胞では 0.86 (Fig. 4b and Supplementary Fig. S7) であった。 S. cerevisiaeにおける同様の比較では、相関の大部分は負の値であった9。 例えば、CCG（プロリン）やCGG（アルギニン）などの希少コドンは、CHX非存在下で最も占有率が高かったが、CHX処理したサンプルではこの占有率は失われた9。 対照的に、S. pombeのデータセットでは、CCGとCGGの両方がCHXの存在に関係なく濃縮されていた（未処理細胞ではより弱いが、Fig. 4cと補図S7参照）。 さらに、栄養ストレスは、CHX存在下（図4cおよび補足図S7、平均R = 0.96）および非存在下の両方で、コドン特異的リボソーム占有率にほとんど影響を与えなかった（図4c）。 図4

相対コドン占有率に対するCHXの影響。 方法」に記載したように得られた相対的コドン占有率を表示した散布図。 各ドットは1つのコドンに対応する。 終止コドンは表示されていない。 希少コドンであるCCGとCGGの位置が示されている。 点線は1.5倍の差に相当する。 データセット間のピアソン相関を示す。 (a)窒素飢餓細胞におけるCHX処理の効果の比較。 (b) (a)と同様に、窒素源で培養した細胞に対するもの。 (c) CHX存在下での窒素飢餓の効果の比較。 (d）（c）と同様に、CHX非存在下での比較。

最後に、tRNAの存在量とコドン特異的占有率の相関を評価した。 これは、tRNAのコピー数に基づいて、各コドンに対するtRNAの使用率を部分的に示す指標であるtRNA Adaptation Index (tAI) を用いて行われた (コピー数が多いほど、より効率的な翻訳を予測できる)26。 CHX存在下で行われたS. cerevisiaeの実験では、tAIの逆数（1/tAI）とコドン特異的占有率の間に負の相関が見られ、tAIが低い（つまりtRNA量が少ない）コドンは速く翻訳されると予想される。 一方、CHXで前処理していない細胞を用いた実験では、1/tAIの間に予想される正の相関が見られた（ただし、実際の値は実験によって非常にばらつきがあった）9。 S. pombeでは、8つのリボソームプロファイリング実験のそれぞれにおいて、コドン特異的占有率が1/tAIと正の相関を示し、平均0.39であることがわかった（表2）

S. pombeにおいてCHXが特定のコドンにおけるリボソームの位置に対して比較的小さい影響を有することを示す結果である。 これは、S. pombe細胞がCHXに対して特に感受性が高く、CHXがS. cerevisiaeよりも迅速かつ完全にリボソームの動きを阻害するためであると説明できる。 この性質により、リボソームの移動速度が変化すること（S. cerevisiaeで起こると仮定）を防ぎ、S. pombeのCHX処理細胞と未処理細胞の定常状態でのリボソーム分布が同じになる状況を導くことができる。 しかし、CHX存在下で希少コドンの濃縮が少ないという事実は、コドン特異的なリボソーム分布の決定を目的とした実験ではCHXを省略すべきことを示唆している

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