Articles / augusztus 31, 2021

A cikloheximid hatása a riboszóma profilalkotási kísérletek értelmezésére Schizosaccharomyces pombe-ban

Kísérleti tervezés és reprodukálhatóság

A CHX riboszóma profilalkotási kísérletekre gyakorolt hatásának vizsgálatára ezt a technikát alkalmaztuk S. pombe sejtek exponenciális növekedését (stressz nélkül) és 1 órás nitrogén éhezést (táplálkozási stressz) követően. Minden tenyészetet két részre osztottunk, és az egyiket a gyűjtés előtt 5 percig 100 µg/ml koncentrációjú CHX-szel inkubáltuk (ez a publikált kísérletek többségében használt “standard′ koncentráció). A sejteket szűréssel gyűjtöttük, és a további transzláció megakadályozása érdekében azonnal folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk. Megjegyzendő, hogy a CHX minden minta esetében jelen volt a lízispufferekben. Így az alábbiakban a CHX-kezelésre tett minden utalás csak a táptalajhoz való hozzáadására vonatkozik. Mind a négy kísérlethez (plusz/mínusz nitrogén, plusz/mínusz CHX) két független biológiai ismétlést végeztünk. Minden egyes minta esetében riboszóma-védett fragmentumokat (RPF-ek vagy riboszóma-lábnyomok) készítettünk és izoláltunk a Módszerek című fejezetben leírtak szerint, és nagy áteresztőképességű Illumina szekvenálással elemeztük őket. Mind a nyolc mintából rRNS-mentesített RNS-t is szekvenáltunk (RNS-seq). A technika reprodukálhatóságának értékeléséhez minden kísérlet esetében számszerűsítettük az S. pombe genom minden egyes annotált kódoló szekvenciájához leképeződő RPF- és RNA-seq-olvasatok számát. Az adatok nagymértékben reprodukálhatók voltak, a független biológiai ismétlések közötti átlagos korreláció 0,97 volt (1. táblázat). Az alábbiakban arra összpontosítunk, hogy a CHX hogyan befolyásolja a riboszóma profilalkotási kísérleteket. A S. pombe sejtek nitrogén-éhségre adott válaszának biológiájáról szóló teljesebb elemzést máshol fogjuk közzétenni.

Táblázat 1. Korreláció a független ismétlések között.

A CHX hatásának vizsgálatához a transzláció négy aspektusát vizsgáltuk: 1] a teljes riboszómasűrűség az egyes gének kódoló szekvenciáira, 2] a riboszómák jelenléte az 5′ vezető szekvenciákon, 3] a riboszómák elhelyezkedésének torzulásai a kódoló szekvenciákon és 4] a riboszómák eloszlása az egyes kodonok mentén.

Riboszómasűrűség

Kvantitatív módon meghatároztuk az RPF olvasatok számát az egyes annotált gének kódoló szekvenciáin a CHX-szel kezelt vagy a mockkezelt sejtekben. Nitrogén-éheztetéses körülmények között a két kezelés közötti korreláció nagyon magas volt (átlagos R = 0,96), de a gének ~4,5%-a következetesen magasabb riboszómasűrűséget mutatott CHX jelenlétében (2-szeres vagy magasabb mindkét ismétlésben, 1a. ábra és S1. kiegészítő ábra). Hasonló változások nem voltak megfigyelhetők az mRNS-mintákban (átlagos R = 0,98), ami arra utal, hogy ez a hatás a transzlációban és nem a transzkriptomban bekövetkező változásoknak köszönhető (1a. ábra, S1. kiegészítő ábra).

Meglepő módon ebbe a csoportba tartozott a legtöbb riboszómális fehérjéket kódoló gén (RP-k, 1a. ábra és S1. kiegészítő ábra, zöld pontok). Annak kizárására, hogy a CHX finom változásokat okoz az mRNS-szintekben, összehasonlítottuk a nitrogénéhség által kiváltott változásokat CHX jelenlétében vagy hiányában (S2. kiegészítő ábra). Az RP-gének mRNS-szintjének medián hajtásváltozása 0,25 volt a CHX-szel kezelt mintákban és 0,24 a kezeletlen sejtekben, ami megerősíti, hogy az RP-gének riboszómasűrűségének nitrogénéhség hatására bekövetkező változásai a transzlációban bekövetkező változásoknak köszönhetőek.

A RP-gének általában meglehetősen rövidek, hosszuk mediánja 447 nukleotid, szemben az összes gén 1131 hosszával. Ezért ennek a feldúsulásnak az lehet az egyszerű magyarázata, hogy a CHX megakadályozza a riboszómák “elfolyását” a rövid génekről a sejtgyűjtés során, és így növeli a látszólagos riboszómasűrűségüket. Bár volt egy kis tendencia, hogy a rövidebb gének riboszómasűrűsége magasabb volt a CHX jelenlétében, ez csak egy kisebb hatás volt, és nem magyarázza a riboszómális fehérje gének viselkedését (1b. ábra). Az e gének által kódolt mRNS-ek szintén hajlamosak rövidebb 5′ vezető szekvenciákkal rendelkezni (68,5 nukleotid mediánja az összes gén 173 nukleotidjával szemben), de nem volt általános korreláció az 5′ vezető hossz és a magasabb riboszómasűrűség között CHX jelenlétében (1c. ábra). Csak 9 nukleárisan kódolt gén (~0,2%) mutatott csökkenést a riboszómasűrűségben CHX alatt (1a. ábra és S1. kiegészítő ábra), és ezekben nem volt semmilyen közös jellemző.

Ezzel szemben nem stressz körülmények között a gyógyszer nagyon gyenge hatást gyakorolt a riboszómasűrűségre (átlagos R = 0,98), a gének kevesebb mint 1%-a mutatott 2-szeresnél nagyobb különbséget a sűrűségben (23 gén magasabb CHX alatt és 9 alacsonyabb, 1a. ábra és S1. kiegészítő ábra). Érdekes módon a CHX-szel kezelt sejtekben alacsonyabb sűrűséget mutató gének kis csoportja a riboszómális fehérjék génjeiben is feldúsult (12/23 mRNS).

Azt a következtetést vontuk le, hogy a RP-ket kódoló mRNS-ek különösen érzékenyek a CHX jelenlétére, és hogy ez a jelenség nem magyarázható kizárólag rövid 5′ vezető és kódoló szekvenciájukkal. Ráadásul a hatás csak táplálkozási stressz alatt erős. Ezekből az eredményekből azonban nem derül ki, hogy a két minta (CHX-kezelt vagy kezeletlen) közül melyik tükrözi jobban az in vivo helyzetet. Az RP gének például gazdagok optimális kodonokban, ami arra utal, hogy a transzlációs elongáció nagy sebességgel történik. Ez a tulajdonságuk, rövid hosszúságukkal együtt érzékenyebbé teheti őket a riboszómák elfolyására a gyűjtés során. Ebben az esetben a CHX stabilizálná az in vivo eloszlást. Alternatív megoldásként az is lehetséges, hogy a CHX közvetlen hatással van ezeknek az mRNS-eknek a transzlációjára, ami nem fiziológiás riboszómasűrűséghez vezet.

Ezután megvizsgáltuk, hogy a CHX által okozott riboszómasűrűség-változások befolyásolják-e a nitrogénéhségre adott transzlációs/transzkripciós válasz értelmezését. A transzlációs hatékonyságokat (TE-k) úgy számszerűsítettük, hogy az RPF-számokat az mRNS-szintekkel normalizáltuk, és kiszámítottuk a TE- és transzkript-szintek logaritmikus változását a nitrogéntartalmú közegben és a nitrogénéheztetett sejtek között (1c. ábra és S1B kiegészítő ábra). CHX jelenlétében a nitrogénéhség az RP-ket kódoló mRNS-ek szintjének egyértelmű csökkenéséhez vezetett, de nem befolyásolta a TE-jüket. Ezzel szemben a CHX hiányában végzett kísérletekben ezek az mRNS-ek mind mRNS-, mind TE-szinten lefelé szabályozottnak tűntek. Így a CHX-szel való előinkubálás a közegben befolyásolhatja a gének specifikus csoportjainak TE-jét. Az RP-ket kódoló mRNS-ek mennyisége nagyon szorosan ko-szabályozott22,23,24; eredményeink azt mutatják, hogy ezek az mRNS-ek a transzlációs hatékonyság szintjén is összehangolt viselkedést mutatnak. Ezen mRNS-ek CHX-re való rendkívüli érzékenységének oka még tisztázásra vár.

A gének többségénél azonban a CHX-kezelésnek nincs hatása a riboszómasűrűségre, függetlenül a növekedési körülményektől. Hasonló eredményekről számoltak be tenyésztett emlőssejtek esetében is, ahol a CHX-nek nincs jelentős hatása a génspecifikus riboszómasűrűségre. Ezt azonban csak stresszmentes sejtekben vizsgálták13.

Változások az upstream nyílt olvasókeretek használatában

A S. cerevisiae sejtekben az 5′ vezető szekvenciák riboszómanyomainak felhalmozódása stresszhelyzetben megnövekszik, ami az uORF-ek nagyobb mértékű használatára utal1, 9, 10 . Ezeket a következtetéseket azonban vitatták, és a CHX sejtkultúrában történő használatának tulajdonították8.

A kérdés megválaszolásához S. pombe esetében összehasonlítottuk az 5′ vezető és kódoló szekvenciákban (2a. ábra) a nitrogén éhezés előtt és után felhalmozódott olvasatokat. Ezt az értéket kezdetben úgy számszerűsítettük, hogy megmértük az 5′ vezető és a kódoló szekvenciákban lévő riboszóma lábnyomok teljes száma közötti arányt. A CHX-szel kezelt sejtekben a nitrogénéhség átlagosan 5,5-szeres növekedést okozott, míg a kezeletlen sejtekben átlagosan 2,1-szeres növekedést (mindkét dúsulás konzisztens volt a biológiai ismétlések között, 2b. ábra). Mivel a teljes arányokat a kisszámú, nagy gyakoriságú génben bekövetkező változások dominálhatják, az 5′-vezető és a kódoló szekvenciák lábnyomai közötti arányokat is számszerűsítettük az összes olyan egyedi transzkript esetében, amely átlépte az expressziós küszöbértéket (a részleteket lásd a Módszereknél, az eredményeket lásd a 2c. ábrán és a Kiegészítő S3. ábrán). Az előző eredménnyel összhangban a gének többségénél a nitrogénéhség hatására egyértelműen nőttek a riboszóma lábnyomok az 5′ vezető szekvenciákban (2c. ábra és S3. kiegészítő ábra; megjegyzendő, hogy a második ismétlésben a növekedés kisebb, de még mindig jelentős), a növekedés átlagos aránya 3,8 és 1,9 volt plusz/mínusz CHX esetén (2d. ábra, megjegyzendő a két ismétlés hasonló viselkedése). A S. cerevisiae eredményeivel ellentétben tehát az 5′ vezető riboszómasűrűségeket minden kísérletben növelte a táplálkozási stressz, bár a CHX-szel kezelt sejtekben a hatás lényegesen nagyobb volt. Egy lehetséges fenntartás természetesen az, hogy a S. cerevisiae vizsgálatban más típusú stresszt alkalmaztak8. Mindazonáltal, mivel mind gyógyszeres kezeléssel, mind anélkül is megfigyelhető némi felhalmozódás, arra következtethetünk, hogy a S. pombe-ban a nitrogén éhezés magasabb riboszómasűrűségeket eredményez az 5′ vezető szekvenciákon. Ez a sűrűségnövekedés az uORF-ok transzlációja miatt következhet be, bár nem zárhatjuk ki, hogy a stresszes mintákban megnövekedett zajt tükrözi. Az S4. kiegészítő ábra két példát mutat be a nitrogénéhség hatására indukált uORF-okra. Ennek a jelenségnek a biológiai jelentősége és mechanikai alapja (valamint az, hogy általános-e minden stresszhelyzetre) még nem ismert.

Distribution of ribosomes along coding sequences

S. A cerevisiae sejtek aszimmetrikus riboszóma-eloszlást mutatnak a kódoló szekvenciák mentén, a kódoló szekvencia kezdeti ~300-400 nukleotidjainál egy széles, magasabb riboszóma-foglaltságú csúccsal1, 9, 14, 20, amelyet különböző stresszhatások erősen fokoznak1, 8, 12.

Ezt a jelenséget vizsgáltuk S. pombe kétféleképpen vizsgáltuk: először a 10-400 és a 401-800 nukleotidok közötti lábnyomok arányának kiszámításával (3a-c. ábra, az első 9 nukleotidot nem vettük figyelembe, hogy elkerüljük a riboszómáknak a kezdő AUG-nál történő felhalmozódása által okozott torzításokat); másodszor egy olyan metagen viselkedésének vizsgálatával, amely az egész genomra kiterjedő riboszómasűrűséget reprezentálja a kódoló szekvenciák mentén (3a-c. ábra). 3d és kiegészítő ábra S5).

Stressz hiányában a S. pombe sejtek kis vállakat mutattak a hatóanyag jelenlétében és hiányában is, hasonlóan a CHX nélküli S. cerevisiae esetében közöltekhez1, 14, 20 (3d. ábra és S5. kiegészítő ábra). Táplálkozási stressz hatására a S. pombe hasonlóan viselkedett, mint a S. cerevisiae 12. CHX jelenlétében a gének többségében egyértelműen felhalmozódtak a leolvasások a kódoló szekvencia 5′ részében (3c. ábra és S5. kiegészítő ábra, bal oldali ábra), ami az mRNS első 400 nukleotidjának ~2,0-szoros átlagos sűrűségnövekedésében is megmutatkozott (3b. ábra). Ezzel szemben ez a növekedés elhanyagolható volt a gyógyszer hiányában, mind az egyes gének vizsgálatakor (3c. ábra (jobb oldali plot) és a Kiegészítő S5. ábra), mind az átlagos arányok mérésekor (3b. ábra, megjegyzendő, hogy mindkét replikátum következetesen viselkedett). Továbbá, az olvasatok felhalmozódásának CHX-függését nitrogénéhség hatására a metagén adatok is megerősítették (3d. ábra és Kiegészítő ábra S5). Végül az mRNS-seq adatokon alapuló metagén ábrázolásával megállapítottuk, hogy ez a hatás specifikus az RPF-ekre (Kiegészítő ábra S5).

Megfontoltuk azt is, hogy ezek a megfigyelések a kisebb génekre is érvényesek-e. Ezzel a céllal metageneket generáltunk az RP-génekre és az RP-gének kivételével a kis méretű (200 kodonnál kevesebb) génekre. Mindkét esetben a CHX egyértelmű növekedést okozott a kódoló szekvenciák 5′ oldalán (különösen az RP-gének esetében), ami mind a nitrogénéhségtől, mind a CHX-kezeléstől függött (Kiegészítő ábra S5).

Mellett a riboszómák felhalmozódását tapasztaltuk az iniciációs kodonokon (Kiegészítő ábra S6). Ez a jellemző már a kezeletlen sejtekben is jelen volt, bár CHX inkubációval megemelkedett (mind a kontroll, mind a nitrogénéheztetett sejtekben). Ez a feldúsulás a nitrogén-éheztetett sejtekben kissé nagyobb volt, függetlenül a CHX-kezeléstől (Kiegészítő ábra S6).

A riboszómák egyértelmű felhalmozódása figyelhető meg tehát a kódoló szekvenciák kezdeti részén, amely konzervált a S. pombe-ban és a S. cerevisiae-ben, és amely CHX-előkezeléssel és anélkül is megfigyelhető. Ezzel szemben a stressz által kiváltott fokozódás nem figyelhető meg következetesen CHX hiányában mindkét élesztőben, és így nincs elegendő bizonyíték arra, hogy ez in vivo is előfordul. A jövőben az in vivo keresztkötési stratégiák25 alkalmazása segíthet különbséget tenni e két értelmezés között.

Kodonfoglaltság

Az egyes kodonok normalizált riboszómafoglaltsága elvileg összefügg azzal az idővel, amelyet a riboszóma az egyes kodonoknál tölt, és így felhasználható az átlagos kodon-specifikus transzlációs sebesség becslésére. A jelenséget vizsgáló kezdeti kísérletek azonban ellentmondásos eredményeket hoztak17,18,19,20. Hussmann és munkatársai elegáns tanulmánya, amely új kísérleteket, számos S. cerevisiae-ből származó riboszóma profilalkotási kísérlet metaanalízisét és matematikai modellezést9 tartalmazott, megállapította, hogy ezek az ellentmondások a CHX-nek a kodon-specifikus riboszóma-foglaltságok meghatározására gyakorolt hatásával magyarázhatók. A különböző csoportok különböző, CHX jelenlétében végzett kísérletei hasonló riboszómakódon-foglaltságot mutattak egymáshoz, mint a gyógyszer nélkül végzett kísérletek. A CHX-szel és a CHX nélkül végzett kísérletek közötti korrelációk azonban nagyon alacsonyak voltak. Ráadásul a CHX-szel végzett kísérletek olyan kodon-specifikus transzlációs rátákat eredményeztek, amelyek negatív korrelációt mutattak a kognitív tRNS-bőséggel, míg a CHX-kezelést nem tartalmazó kísérletek a várt pozitív korrelációt mutatták9, 20 . Hussmann és munkatársai azt javasolták, hogy a riboszómák nem állítják le azonnal a transzlációt CHX jelenlétében a közegben. Ehelyett a transzláció néhány kodon esetében kodon-specifikus transzlációs sebességgel folytatódik9 , ami artefaktuális kodon-foglaltságokat okoz.

A jelenség vizsgálatára a Módszerek pontban leírtak szerint elemeztük a kodon-specifikus riboszóma-foglaltságokat az A-sitesben. Röviden, minden olyan olvasatot, amely egy kódoló szekvenciára leképeződött, a riboszóma A-helyéhez rendeltünk (ami egy riboszómavédett fragmentum 16-os nukleotidjának felel meg). Ezután kiszámítottuk az egyes kodonok normalizált foglaltságát a genomban (úgy, hogy a riboszóma egyes kodonokon való elhelyezkedésének gyakoriságát elosztottuk az mRNS-en lévő kodon gyakoriságával). Torzítások hiányában ez az érték várhatóan azt az átlagos időt tükrözné, amelyet a riboszóma az egyes kodonokon tölt.

Először összehasonlítottuk a CHX hatását a kodon-specifikus riboszóma-foglaltságra (4. ábra, S7 és S8 kiegészítő ábra). Meglepő módon a két kísérlet közötti korreláció nagyon magas volt, az átlagos értékek 0,82 a nitrogén-éheztetés (4a. ábra és S7. kiegészítő ábra) és 0,86 a stresszmentes sejtek esetében (4b. ábra és S7. kiegészítő ábra). Az S. cerevisiae hasonló összehasonlításaiban a korrelációk többsége negatív volt9. Például az olyan ritka kodonok, mint a CCG (prolin) és a CGG (arginin) a CHX hiányában a legmagasabb foglaltságúak közé tartoztak, de CHX-kezelt mintákban elvesztették ezt a feldúsulást9. Ezzel szemben a S. pombe adatkészletben mind a CCG, mind a CGG a CHX jelenlététől függetlenül feldúsult (bár a kezeletlen sejtekben kevésbé erősen, 4c. ábra és S7. kiegészítő ábra). Ezenkívül a táplálkozási stressz nagyon kevés hatással volt a kodon-specifikus riboszóma-foglaltságokra mind CHX jelenlétében (4c. ábra és S7. kiegészítő ábra, átlagos R = 0,96), mind pedig annak hiányában (4c. ábra és S7. kiegészítő ábra). 4d és Kiegészítő ábra S7, átlagos R = 0,98).

Végül megvizsgáltuk a tRNS-bőség és a kodon-specifikus foglaltságok közötti összefüggést. Ehhez a tRNS-adaptációs indexet (tRNS Adaptation Index, tAI) használtuk, amely az egyes kodonok tRNS-használatának mérőszáma, részben a tRNS-kópiaszám alapján (a magasabb számok hatékonyabb transzlációt jeleznek előre)26 . A tenyészetben CHX jelenlétében végzett S. cerevisiae-kísérletek negatív korrelációt mutatnak a tAI inverze (1/tAI) és a kodon-specifikus foglaltságok között, ami azt jelzi, hogy az alacsony tAI-val (és így alacsony tRNS-bőséggel) rendelkező kodonok gyorsabban transzlálódnak. Ezzel szemben a CHX-szel nem előkezelt sejtekkel végzett kísérletek a várt pozitív korrelációt mutatták az 1/tAI között (bár a tényleges értékek nagyon eltérőek voltak a kísérletek között)9 . S. pombe-ban azt találtuk, hogy a nyolc riboszóma-profilkészítési kísérlet mindegyikében a kodon-specifikus foglaltság pozitív korrelációt mutatott az 1/tAI-val, átlagosan 0,39-et (2. táblázat).

2. táblázat A relatív kodonfoglaltság és az 1/tAI közötti korrelációk.

Eredményeink azt mutatják, hogy S. pombe-ban a CHX viszonylag kis mértékben befolyásolja a riboszómák pozícióját a specifikus kodonokon. Ez azzal magyarázható, hogy az S. pombe sejtek különösen érzékenyek a CHX-re, így a CHX gyorsabban és teljesebben blokkolja a riboszómák mozgását, mint az S. cerevisiae-ben. Ez a tulajdonság megakadályozná a riboszómák megváltozott sebességű mozgását (ami az S. cerevisiae-ben feltételezhetően megtörténik), és ahhoz a helyzethez vezetne, hogy a CHX-szel kezelt és a kezeletlen S. pombe sejtek hasonló riboszóma-eloszlással rendelkeznének állandósult állapotban. Az a tény azonban, hogy a ritka kodonok kevésbé gazdagodnak CHX jelenlétében, arra utal, hogy a CHX-et el kell hagyni a kodon-specifikus riboszóma-eloszlások meghatározására irányuló kísérletekben.

Universe