ENU

Cilii în semnalizarea celulă-celulă la vertebrate

În 2003, un ecran de mutageneză ENU a implicat în mod neașteptat cili primari și IFT în semnalizarea Shh: Mutațiile IFT la șoareci au dus la apariția unor fenotipuri de modelare a tubului neural și a mugurilor de membre similare cu cele care rezultă din întreruperea căii Shh (Huangfu et al., 2003). Cilii primari sunt organite nemotrice, bazate pe microtubule, care ies din majoritatea celulelor vertebrate. Ei se extind din corpurile bazale și constau din membrane specializate (segregate structural de membrana plasmatică) în jurul unui axonem central de-a lungul căruia mașinăria IFT facilitează transportul retrograd și anterograd între baza și vârful ciliar. Întreruperea ciliogenezei sau a IFT are ca rezultat un spectru larg de sindroame de ciliopatie umană. Defectele primare ale tulburărilor ciliace includ polidactilia, malformațiile cranio-faciale și cerebrale, situs inversus, boala polichistică a rinichilor, obezitatea, diabetul și defecte subtile la nivelul ficatului, splinei și inimii (Nigg și Raff, 2009; Goetz și Anderson, 2010; Hildebrandt și colab, 2011).

Ciliogeneza și dezasamblarea ciliilor primari sunt strâns legate de mecanismul ciclului celular: cili primari sunt prezenți pe celulele quiescente, dar dezasamblarea lor este necesară pentru trecerea în ciclul celular. Semnalizarea Fgf și Wnt este necesară în amonte de ciliogeneză în mai multe contexte de vertebrate, inclusiv în nodul/vezicula lui Kupffer (KV), veziculele otice și canalele pronefrice (Basu și Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Printre țintele transcripționale ale acestor căi de semnalizare care mediază formarea, modelarea sau funcția ciliilor se numără Ift88, Enc1-like și TF-urile ciliogene Foxj1 și Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Experimentele de epistazis care studiază KV au sugerat că semnalizarea Wnt funcționează în aval de Fgfs în ciliogeneză (Caron et al., 2012).

La vertebrate, calea Shh utilizează cilia ca organit de semnalizare specializat în care IFT mediază modificările în localizarea proteinelor esențiale pentru procesarea Gli și răspunsurile transcripționale consecvente (Figura 1.1B). Receptorul Hh Patched (Ptc) se află la baza ciliului primar în absența Hh. În prezența Hh, Ptc iese din ciliu și Smo intră în el, iar la nivelul vârfului se înregistrează o creștere a Gli localizate în vârf. Complexele Gli-Sufu sunt îmbogățite în vârfurile ciliilor primari într-o manieră dependentă de Smo și trebuie să fie disociate pentru activarea căii Shh (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, al cărui ortolog promovează procesarea Ci/Gli și antagonizează Sufu în Drosophila, suferă un transport anterograd indus de Hh de la baza ciliului la vârf. PKA, care fosforilează Gli ca o condiție prealabilă pentru proteoliza la GliR, se localizează la baza ciliilor primari și reglează nivelurile de Gli localizate în vârf (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studiile privind Shh și cilia/IFT au indicat faptul că unele trăsături de ciliopatie umană se datorează probabil unei semnalizări Shh perturbate. În plus, defectele ciliare pot intensifica sau suprima oncogeneza din cauza mutațiilor căii Shh (Han et al., 2009). Mutanții Cilia/IFT se aseamănă adesea cu mutanții Shh LOF sau GOF datorită cerințelor specifice contextului pentru procesarea mediată de cili a Gli în GliA sau GliR, respectiv GliR. Fenotipurile caracteristice includ ventralizarea tubului neural (care utilizează GliR) și polidactilia (mugurii membrelor utilizează GliA; discutat în Goetz și Anderson, 2010). Mutațiile în genele IFT și ciliopatie au ajutat la identificarea unor noi contexte în care cilia sunt necesari pentru semnalizarea celulară de dezvoltare. În unele cazuri, aceste experimente au aruncat lumină asupra etiologiilor trăsăturilor de ciliopatie umană slab înțelese. De exemplu, studiile efectuate pe Rpgrip11 (o genă de ciliopatie umană) și pe șoarecii mutanți Ttc21b au demonstrat importanța ciliacului primar în medierea semnalelor Shh în creierul ventral anterior. Mutanții Ttc21b au cili primari anormali, cu transport retrograd parțial defectuos, dar cu transport anterograd funcțional. Acest lucru are ca rezultat un fenotip GOF, după cum reiese din acumularea mașinăriei de semnalizare Shh în vârfurile ciliare și din extinderea expresiei/activității Shh în telencefalul ventral și în zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Mutanții Rpgrip1l au celule neuroepiteliale ale creierului anterior care nu au cili primari și sunt deficitare în producția de Gli prelucrate, așa cum era de așteptat pentru Shh LOF (Besse et al., 2011). Aceste mutații au ca rezultat atât expansiunea subpalului în detrimentul palului, similar cu mutanții Gli3, deoarece ieșirea predominantă a semnalizării Shh în antebrațul ventral este procesarea Gli3 în forma sa represoare (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Dacă proteina Gli3R activă este introdusă genetic, atunci cilia sunt dispensabili în acest context (Besse et al., 2011). Defectele în modelarea ventrală a creierului anterior pot sta la baza deficiențelor cognitive în unele ciliopatii.

Defectele legate de Shh nu explică toate fenotipurile din ciliopatiile umane. A devenit evident că IFT/cilele sunt folosite în anumite contexte pentru a facilita semnalizarea prin alte căi. În timpul dezvoltării pielii mamiferelor, cilia primari sunt esențiali pentru diferențierea terminală a celulelor suprabasale, un proces inițiat de semnalizarea Notch/Delta (Figura 1F; Blanpain et al., 2006). În ∼60-70% din celulele suprabasale, Notch este concentrat în membranele ciliare primare, iar presenilina, o proteină din complexul γ-secretazei care clivează Notch, este localizată la corpurile bazale (Ezratty et al., 2011). Eliminarea genelor IFT sau eliminarea ciliilor in vivo are ca rezultat scăderea activității reporterilor Notch și afectarea diferențierii celulelor suprabasale. Mai mult decât atât, NICD, forma activă scindată a Notch, a fost observată în nucleele celulelor ciliate, dar nu și a celor neciiliate, în chimeri genetici (Ezratty et al., 2011).

Cilii au fost, de asemenea, implicați în semnalizarea PDGF. În fibroblastele cultivate, PDGFRα a fost observat în membranele ciliare primare, iar proteinele de transducție a semnalului activate de RTK MEK1/2 și Akt sunt localizate de-a lungul ciliului și, respectiv, la baza ciliară (Schneider et al., 2005). Studiile efectuate pe fibroblaste de tip sălbatic și mutante Ift88 (fără cili primari) au indicat faptul că cili primari ai celulelor conducătoare se orientează spre locurile rănilor și sunt necesari pentru chemotaxia indusă de PDGF-AA și răspunsurile fosfo-Akt in vitro (Schneider et al., 2010). În special, șoarecii mutanți Ift88 prezintă defecte în repararea rănilor (Schneider et al., 2010). Semnalizarea PDGF prin PDGFRα a fost, de asemenea, implicată în dezasamblarea ciliacului și în tranziția de fază G1-S (discutată în Christensen et al., 2012), deși semnificația in vivo a acestei observații nu este încă cunoscută.

Rolul ciliacului în semnalizarea Wnt canonică a fost controversat (analizat în Wallingford și Mitchell, 2011). Studiile asupra șoarecilor mutanți Ift88 și Ift72 și asupra peștilor zebră au sugerat că cilia nu sunt esențiali pentru semnalizarea Wnt în timpul embriogenezei, iar studiile privind semnalizarea Wnt la șoarecii mutanți Kif3a au dat rezultate contradictorii (Huang și Schier, 2009; Ocbina și colab., 2009; Lancaster și colab., 2011b). La mutanții IFT retrograzi, un grup nu a raportat nicio modificare a semnalizării Wnt, în timp ce un alt grup a demonstrat o scădere a activității Wnt în contextele care mențin cilia, dar o creștere a semnalizării Wnt în contextele care au pierdut cilia (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Studiile privind proteinele ciliare/ciliopatice Inversin, Chibby și Jouberin susțin rolurile ciliare în semnalizarea Wnt canonică în contexte specifice de dezvoltare. Inversin, care a suferit o mutație la pacienții umani cu nefronoftizie de tip II, este exprimată în monocilii vertebratelor, interacționează fizic cu Disheveled (Dsh) și întrerupe semnalizarea Wnt canonică în aval de Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Șoarecii mutanți Inversin prezintă fenotipuri de modelare renală și a părului care amintesc de fenotipurile Wnt/Frz, precum și fenotipuri de modelare stânga-dreapta datorate probabil unor defecte în funcția monocilară a nodului (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, o proteină a corpului bazal necesară pentru ciliogeneza și andocarea corpului bazal, interacționează fizic cu β-catenina și reglează negativ semnalizarea canonică Wnt în embrionii de Drosophila, în epiteliile pulmonare ale mamiferelor și în celulele de mamifere cultivate (Takemaru și colab., 2003; Voronina și colab., 2009; Love și colab., 2010). În cele din urmă, proteina ciliopatică umană Jouberin este necesară la șoareci pentru semnalizarea Wnt normală și proliferarea la nivelul liniei mediane cerebeloase. Acest lucru contribuie probabil la defectul de fuziune a emisferelor cerebeloase observat la pacienții cu sindrom Joubert uman și la șoarecii cu deficit de Jouberin (Lancaster et al., 2011a). În celulele ciliate expuse la Wnt, Jouberin este sechestrată împreună cu β-catenina la corpurile bazale într-o manieră dependentă de IFT. Jouberin facilitează translocarea nucleară a β-cateninei; sechestrarea sa în corpul bazal împiedică translocarea nucleară a β-cateninei și atenuează răspunsurile canonice de semnalizare Wnt (Lancaster et al., 2011b). Împreună, aceste constatări sugerează că cilia nu sunt necesare la nivel global pentru semnalizarea Wnt în timpul embriogenezei, dar au un impact asupra rezultatelor semnalizării Wnt în anumite contexte.

A fost emisă ipoteza că cilia oferă o structură senzorială specializată în cadrul căreia sunt coordonate mai multe tipuri de semnale. Un model alternativ este că cilia prezintă specificitate de cale (ca și citonemele, discutate mai jos) și, prin urmare, restricționează receptivitatea celulară și/sau segregă spațial răspunsurile de semnalizare. Specificitatea căii de semnalizare ciliară ar putea fi mediată de direcționarea diferențiată a proteinelor de semnalizare către cili și/sau de utilizarea unor subseturi distincte de proteine IFT sau de adaptoare specifice încărcăturii pentru transportul axonemelor (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).

.