Articles / august 31, 2021

Efectele cicloheximidei asupra interpretării experimentelor de profilare a ribozomilor la Schizosaccharomyces pombe

Proiectare experimentală și reproductibilitate

Pentru a examina efectele CHX asupra experimentelor de profilare a ribozomilor, am aplicat această tehnică la S. pombe care cresc exponențial (nesolicitate) și după 1 oră de inaniție de azot (stres nutrițional). Fiecare cultură a fost împărțită în două, iar una dintre ele a fost incubată cu CHX la o concentrație de 100 µg/ml timp de 5 minute înainte de colectare (aceasta este concentrația „standard′ utilizată în majoritatea experimentelor publicate). Celulele au fost colectate prin filtrare și au fost imediat congelate rapid în azot lichid pentru a preveni o translație ulterioară. Rețineți că CHX a fost prezent în tampoanele de liză pentru toate probele. Astfel, toate trimiterile la tratamentul cu CHX de mai jos se aplică numai la adăugarea acestuia în mediul de cultură. Am efectuat două replici biologice independente pentru fiecare dintre cele patru experimente (plus/minus azot, plus/minus CHX). Pentru fiecare probă, am pregătit și izolat fragmente protejate de ribozomi (RPF sau urme de ribozomi), așa cum este descris în secțiunea Metode, și le-am analizat cu ajutorul secvențierii Illumina de mare capacitate. De asemenea, am secvențiat ARN-ul sărăcit de rRNA din fiecare dintre cele opt probe (RNA-seq). Pentru a evalua reproductibilitatea tehnicii, am cuantificat, pentru fiecare experiment, numărul de citiri RPF și RNA-seq care au corespondat cu fiecare secvență codificatoare adnotată din genomul S. pombe. Datele au fost foarte reproductibile, cu corelații medii între replicile biologice independente de 0,97 (tabelul 1). Ne concentrăm mai jos asupra modului în care CHX afectează experimentele de profilare a ribozomilor. O analiză mai completă a biologiei răspunsului celulelor S. pombe la înfometarea cu azot va fi publicată în altă parte.

Tabel 1 Corelația dintre replicile independente.

Pentru a investiga efectele CHX am examinat patru aspecte ale traducerii: 1] Densitatea totală a ribozomilor pentru secvențele codificatoare ale genelor individuale, 2] prezența ribozomilor pe secvențele lider 5′, 3] distorsiuni în localizarea ribozomilor pe secvențele codificatoare și 4] distribuția ribozomilor de-a lungul codonilor individuali.

Densitatea ribozomilor

Am cuantificat numărul de citiri RPF pe secvențele codificatoare pentru fiecare genă adnotată în celulele tratate cu CHX sau tratate cu mock. În condiții de invazie de azot, corelația dintre cele două tratamente a fost foarte mare (R mediu = 0,96), dar ~4,5% din toate genele au prezentat o densitate ribozomală constant mai mare în prezența CHX (de 2 ori sau mai mare în ambele replici, Fig. 1a și Fig. Suplimentară S1). Modificări similare nu au fost observate în probele de ARNm (R mediu = 0,98), ceea ce indică faptul că acest efect s-a datorat unor modificări ale traducerii și nu ale transcriptomului (Fig. 1a, Fig. Suplimentară S1).

În mod surprinzător, acest grup a inclus majoritatea genelor care codifică proteinele ribozomale (RPs, Fig. 1a și Fig. Suplimentară S1, puncte verzi). Pentru a exclude posibilitatea ca CHX să provoace modificări subtile ale nivelurilor ARNm, am comparat modificările induse de înfometarea cu azot în prezența sau în absența CHX (Fig. Suplimentară S2). Schimbarea mediană fold-change a nivelurilor de ARNm pentru genele RP a fost de 0,25 în probele tratate cu CHX și de 0,24 în celulele netratate, ceea ce confirmă faptul că modificările densității ribozomiale a genelor RP la înfometarea cu azot se datorează modificărilor în traducere.

Genele RP sunt, în general, destul de scurte, cu o lungime mediană de 447 de nucleotide, comparativ cu 1.131 pentru toate genele. Prin urmare, o explicație simplă pentru această îmbogățire ar putea fi faptul că CHX împiedică „scurgerea” ribozomilor de la genele scurte în timpul colectării celulelor, crescând astfel densitatea aparentă a ribozomilor acestora. Cu toate acestea, deși a existat o mică tendință ca densitatea ribozomială în genele scurte să fie mai mare în prezența CHX, acesta a fost un efect minor și nu ar putea explica comportamentul genelor proteinelor ribozomiale (Fig. 1b). ARNm codificate de aceste gene au, de asemenea, tendința de a avea secvențe conducătoare 5′ mai scurte (o mediană de 68,5 nucleotide față de 173 pentru toate genele), dar nu a existat nicio corelație generală între lungimile conducătoare 5′ și densitățile ribozomiale mai mari în CHX (Fig. 1c). Doar 9 gene cu codificare nucleară (~0,2%) au prezentat o reducere a densității ribozomilor în CHX (Fig. 1a și Fig. Suplimentară S1), iar acestea nu au avut caracteristici comune.

În schimb, în condiții de non-stres, medicamentul a avut un efect foarte slab asupra densității ribozomale (R mediu = 0,98), mai puțin de 1% din gene prezentând diferențe de densitate mai mari de 2 ori (23 de gene mai mari în CHX și 9 mai mici, Fig. 1a și Fig. Suplimentară S1). În mod interesant, grupul mic de gene care au prezentat densități mai mici în celulele tratate cu CHX a fost, de asemenea, îmbogățit în genele proteinelor ribozomale (12/23 ARNm).

Concluzionăm că ARNm care codifică RPs sunt deosebit de sensibile la prezența CHX și că acest fenomen nu poate fi explicat doar prin secvențele lor scurte de lider 5′ și de codificare. În plus, efectul este puternic doar în condiții de stres nutrițional. Cu toate acestea, aceste rezultate nu dezvăluie care dintre cele două probe (tratate cu CHX sau netratate) reflectă mai bine situația in vivo. De exemplu, genele RP sunt bogate în codoni optimi, ceea ce implică faptul că alungirea traducerii are loc cu viteză mare. Această proprietate, împreună cu lungimea lor scurtă, ar putea să le facă mai sensibile la scurgerea ribozomilor în timpul colectării. În acest caz, CHX ar stabiliza distribuția in vivo. Alternativ, este, de asemenea, posibil ca CHX să aibă un efect direct asupra traducerii acestor ARNm, conducând la densități ribozomiale nefiziologice.

Apoi am examinat dacă modificările în densitatea ribozomilor cauzate de CHX ar afecta interpretarea răspunsului translațional/transcripțional la înfometarea cu azot. Am cuantificat eficiența translațională (TE) prin normalizarea numărului de RPF în funcție de nivelurile de ARNm și am calculat variația logaritmică a TE și a nivelurilor de transcripție între celulele cultivate în mediu care conține azot și celulele înfometate cu azot (Fig. 1c și Fig. Suplimentară S1B). În prezența CHX, înfometarea cu azot a dus la o scădere clară a nivelurilor ARNm care codifică RP, dar nu a afectat TE al acestora. În schimb, în experimentele efectuate în absența CHX, aceste ARNm au părut a fi reglate în jos atât la nivelul ARNm, cât și la nivelul TE. Astfel, pre-incubarea cu CHX în mediu poate afecta TE a unor grupuri specifice de gene. Abundența ARNm care codifică RP-uri este foarte strâns coreglementată22,23,24; rezultatele noastre demonstrează că aceste ARNm prezintă, de asemenea, un comportament coordonat la nivelul eficienței traducerii. Motivul sensibilității extreme a acestor ARNm la CHX rămâne să fie clarificat.

Pentru majoritatea genelor, totuși, tratamentul cu CHX nu are niciun efect asupra densității ribozomale, indiferent de condițiile de creștere. Rezultate similare au fost raportate pentru celulele de mamifere crescute în cultură, CHX neavând niciun efect semnificativ asupra densității ribozomiale specifice genelor. Cu toate acestea, acest lucru a fost analizat numai în celule nesolicitate13.

Schimbări în utilizarea cadrelor de citire deschise în amonte

Celulele S. cerevisiae prezintă o acumulare de urme de ribozomi în secvențele de lider 5′ care este crescută în condiții de stres, sugerând o utilizare mai mare a uORF-urilor1, 9, 10. Cu toate acestea, aceste concluzii au fost contestate și atribuite utilizării CHX în cultura celulară8.

Pentru a răspunde la această întrebare în S. pombe, am comparat acumularea de citiri în secvențele 5′ de lider și de codificare (Fig. 2a) înainte și după înfometarea cu azot. Am cuantificat inițial această valoare prin măsurarea raportului dintre numărul total de urme de ribozomi în liderii 5′ și în secvențele codificatoare. Lipsa de azot în celulele tratate cu CHX a provocat o creștere medie de 5,5 ori, în timp ce celulele netratate au avut o creștere medie de 2,1 ori (ambele îmbogățiri au fost consecvente între replicile biologice, Fig. 2b). Deoarece ratele totale ar putea fi dominate de modificări într-un număr mic de gene foarte abundente, am cuantificat, de asemenea, ratele dintre amprentele în liderii 5′ și secvențele codificatoare pentru toate transcriptele individuale care au trecut pragul de expresie (a se vedea Metode pentru detalii și Fig. 2c și Fig. Suplimentară S3 pentru rezultate). În concordanță cu rezultatul anterior, a existat o creștere clară a amprentelor ribozomilor în secvențele de lider 5′ la înfometarea cu azot pentru majoritatea genelor (Fig. 2c și Fig. Suplimentară S3; rețineți că creșterea în cea de-a doua replică este mai mică, dar totuși semnificativă), cu rapoarte medii de creștere de 3,8 și, respectiv, 1,9 pentru plus/minus CHX (Fig. 2d, rețineți comportamentul similar al ambelor replici). Astfel, spre deosebire de rezultatele obținute pentru S. cerevisiae, densitățile ribozomale 5′ lider au fost crescute de stresul nutrițional în fiecare experiment, deși efectul a fost substanțial mai mare în cazul celulelor tratate cu CHX. O posibilă rezervă este, desigur, faptul că studiul S. cerevisiae a utilizat un tip diferit de stres8. Cu toate acestea, având în vedere că o anumită acumulare este observată atât cu cât și fără tratament medicamentos, putem concluziona că, în S. pombe, înfometarea cu azot duce la densități ribozomiale mai mari pe secvențele lider 5′. Această creștere a densității se poate datora traducerii uORF-urilor, deși nu putem exclude faptul că reflectă un zgomot crescut în probele stresate. Fig. suplimentară S4 prezintă două exemple de uORF-uri induse ca răspuns la înfometarea cu azot. Importanța biologică și baza mecanică a acestui fenomen (precum și dacă este general la toate condițiile de stres) este încă necunoscută.

Distribuția ribozomilor de-a lungul secvențelor codificatoare

S. Celulele cerevisiae prezintă o distribuție asimetrică a ribozomilor de-a lungul secvențelor codificatoare, cu un vârf larg de ocupare mai mare a ribozomilor în primele ~300-400 nucleotide ale secvenței codificatoare1, 9, 14, 20, care este puternic potențat de diferite stresuri1, 8, 12.

Am investigat acest fenomen în S. pombe în două moduri: în primul rând, prin calcularea raportului dintre urmele din nucleotidele 10-400 și 401-800 (Fig. 3a-c, primele 9 nucleotide nu au fost luate în considerare pentru a evita prejudecățile create de acumularea de ribozomi la AUG de inițiere); în al doilea rând, prin examinarea comportamentului unei metagene care reprezintă densitatea ribozomilor la nivelul întregului genom de-a lungul secvențelor codificatoare (Fig. 3d și Fig. suplimentară S5).

În absența stresului, celulele S. pombe au prezentat umeri mici atât în prezența cât și în absența medicamentului, similare celor raportate pentru S. cerevisiae fără CHX1, 14, 20 (Fig. 3d și Fig. suplimentară S5). La stresul nutrițional, S. pombe s-a comportat în mod similar cu S. cerevisiae 12. În prezența CHX, a existat o acumulare clară de citiri în partea 5′ a secvenței de codificare în majoritatea genelor (Fig. 3c și Fig. Suplimentară S5, diagrama din stânga), care s-a reflectat, de asemenea, într-o creștere de ~2,0 ori a densității medii în primele 400 de nucleotide ale ARNm (Fig. 3b). În schimb, această creștere a fost neglijabilă în absența medicamentului, atât atunci când au fost examinate genele individuale (Fig. 3c (graficul din dreapta) și Fig. suplimentară S5), cât și atunci când au fost măsurate ratele medii (Fig. 3b, a se observa că ambele replici s-au comportat în mod consecvent). Mai mult, dependența de CHX a acumulării de citiri la înfometarea cu azot a fost confirmată de datele metagenei (Fig. 3d și Fig. Suplimentară S5). În cele din urmă, am stabilit că acest efect a fost specific pentru RPF-uri, prin trasarea unei metagene bazate pe datele mRNA-seq (Fig. suplimentară S5).

Ne-am gândit, de asemenea, dacă aceste observații s-ar aplica și la gene mai mici. În acest scop, am generat metagene pentru genele RP și pentru genele mici (mai puțin de 200 de codoni), cu excepția genelor RP. În ambele cazuri, CHX a provocat o creștere clară pe partea 5′ a secvențelor codificatoare (în special pentru genele RP), care a depins atât de înfometarea cu azot, cât și de tratamentul cu CHX (Fig. suplimentară S5).

În plus, a existat o acumulare de ribozomi pe codonii de inițiere (Fig. suplimentară S6). Această caracteristică era deja prezentă în celulele netratate, deși a fost crescută la incubarea cu CHX (atât în celulele de control, cât și în cele lipsite de azot). Această îmbogățire a fost ușor mai mare în celulele cu lipsă de azot, independent de tratamentul cu CHX (Fig. Suplimentară S6).

Astfel, există o acumulare clară de ribozomi în partea inițială a secvențelor codificatoare, conservată în S. pombe și S. cerevisiae, și care poate fi observată atât cu cât și fără pretratarea cu CHX. În schimb, intensificarea indusă de stres nu este observată în mod constant în absența CHX la ambele drojdii și, prin urmare, nu există suficiente dovezi pentru a indica faptul că aceasta are loc in vivo. În viitor, utilizarea strategiilor de încrucișare in vivo25 poate ajuta la distingerea între aceste două interpretări.

Ocuparea codonilor

În principiu, ocuparea ribozomală normalizată a codonilor individuali este legată de timpul pe care ribozomul îl petrece la fiecare codon și, astfel, poate fi utilizată pentru a estima ratele medii de traducere specifice codonului. Cu toate acestea, experimentele inițiale de investigare a acestui fenomen au produs rezultate contradictorii17,18,19,20. Un studiu elegant realizat de Hussmann et al. care a implicat experimente noi, o metaanaliză a numeroase experimente de profilare a ribozomilor din S. cerevisiae și o modelare matematică9 , a constatat că aceste contradicții ar putea fi explicate prin efectul CHX asupra determinării ocupării ribozomilor specifice codonului. Experimentele din diferite grupuri efectuate în prezența CHX au avut ocupări de codoni ribozomiale similare între ele, la fel ca și cele efectuate fără medicament. Cu toate acestea, corelațiile dintre testele cu CHX și cele fără CHX au fost foarte scăzute. Mai mult, experimentele cu CHX au dus la rate de traducere specifice codonului care au prezentat corelații negative cu abundența ARNt cognat, în timp ce cele care nu au inclus tratamentul cu CHX au prezentat corelațiile pozitive așteptate9, 20. Hussmann et al. au propus că ribozomii nu opresc imediat traducerea în prezența CHX în mediu. În schimb, traducerea continuă pentru câțiva codoni cu rate de traducere specifice codonului9, ceea ce cauzează ocupări artefactuale ale codonilor.

Pentru a investiga acest fenomen, am analizat ocupările ribozomiale specifice codonului la situsurile A, așa cum este descris în secțiunea Metode. Pe scurt, am atribuit fiecare citire care a fost cartografiată la o secvență codificatoare la situsul A al unui ribozom (care corespunde nucleotidului 16 al unui fragment protejat de ribozom). Am calculat apoi gradul de ocupare normalizat pentru fiecare codon în întregul genom (prin împărțirea frecvenței cu care ribozomul este poziționat pe fiecare codon la abundența codonului în ARNm). În absența prejudecăților, se așteaptă ca această valoare să reflecte timpul mediu pe care ribozomul îl petrece la fiecare codon.

Am comparat mai întâi efectul CHX asupra ocupării ribozomale specifice codonului (Fig. 4, figurile suplimentare S7 și S8). În mod surprinzător, corelația dintre cele două experimente a fost foarte mare, cu valori medii de 0,82 pentru invazia de azot (Fig. 4a și Fig. Suplimentară S7) și 0,86 pentru celulele nesolicitate (Fig. 4b și Fig. Suplimentară S7). În comparații similare la S. cerevisiae, majoritatea corelațiilor au fost negative9. De exemplu, codonii rari, cum ar fi CCG (prolină) și CGG (arginină), au avut printre cele mai mari ocupări în absența CHX, dar și-au pierdut această îmbogățire în probele tratate cu CHX9. În schimb, în setul de date din S. pombe, atât CCG, cât și CGG au fost îmbogățiți indiferent de prezența CHX (deși mai puțin puternic în celulele netratate, Fig. 4c și Fig. suplimentară S7). Mai mult, stresul nutrițional a avut un efect foarte mic asupra ocupării ribozomale specifice codonului, atât în prezența (Fig. 4c și Fig. Suplimentară S7, R mediu = 0,96), cât și în absența CHX (Fig. 4d și Fig. Suplimentară S7, media R = 0,98).

În cele din urmă, am evaluat corelația dintre abundența ARNt și ocupările specifice codonului. Acest lucru a fost realizat prin utilizarea indicelui de adaptare a ARNt (tAI), care este o măsură a utilizării ARNt pentru fiecare codon, bazată parțial pe numărul de copii de ARNt (numerele mai mari prezic o traducere mai eficientă)26. Experimentele cu S. cerevisiae efectuate în prezența CHX în cultură arată corelații negative între inversul tAI (1/tAI) și ocupările specifice codonului, prezicând că codonii cu tAI scăzut (și, prin urmare, cu abundențe scăzute de ARNt) ar fi traduși mai rapid. În schimb, experimentele cu celule netratate cu CHX au arătat corelația pozitivă așteptată între 1/tAI (deși valorile reale au fost foarte variabile între experimente)9. La S. pombe, am constatat că, în fiecare dintre cele opt experimente de profilare a ribozomilor, ocupările specifice codonilor au prezentat o corelație pozitivă cu 1/tAI, cu o medie de 0,39 (tabelul 2).

Tabelul 2 Corelații între ocupările relative ale codonilor și 1/tAI.

Rezultatele noastre arată că, la S. pombe, CHX are un efect relativ minor asupra poziției ribozomilor pe codoni specifici. Acest lucru ar putea fi explicat prin faptul că celulele S. pombe sunt deosebit de sensibile la CHX, astfel încât CHX ar bloca mișcările ribozomilor mai rapid și mai complet decât în S. cerevisiae. Această proprietate ar împiedica mișcarea ribozomilor la viteze modificate (care se presupune că are loc în S. cerevisiae) și ar conduce la o situație în care celulele S. pombe tratate cu CHX și cele netratate ar avea distribuții similare ale ribozomilor în stare stabilă. Cu toate acestea, faptul că codonii rari sunt mai puțin îmbogățiți în prezența CHX sugerează că CHX ar trebui omis în experimentele care au ca scop determinarea distribuțiilor de ribozomi specifice codonilor.

Universe