Mutações no FLNB causam displasia do boomerang | Journal of Medical Genetics

Displasia do boomerang (OMIM #112310) é uma displasia esquelética letal caracterizada por uma ossificação esquelética desorganizada.1 Os achados radiológicos característicos incluem ossificação irregular dos ossos e vértebras dos membros, subdesenvolvimento do acetábulo, e hipoplásico, fêmur em forma de bumerangue do qual a desordem deriva seu nome.1 Pelo menos oito casos foram descritos na literatura até o momento.1-8 Uma displasia óssea letal semelhante, a displasia do Piepkorn,9 foi proposta para ser alélica à displasia do boomerang.2,7 A histologia da cartilagem demonstra tanto o anlágeno desorganizado da cartilagem do osso longo em desenvolvimento quanto os condrócitos multinucleados frequentes na zona de reserva da placa de crescimento.1 Outras anormalidades de desenvolvimento além do esqueleto têm sido descritas, incluindo a onfalocele e a encefalocele.

Similitudes nos achados radiográficos e histológicos da displasia boomerang e da atelosteogênese I (AOI; OMIM #108720) e III (AOIII; OMIM #108721) têm sugerido alelismo para estas afecções.2,10 Nas três entidades, os achados radiográficos incluem ossificação deficiente e irregular dos ossos e corpos vertebrais com hipoplasia umeral distal e luxações articulares, além de anormalidades craniofaciais.11 Além disso, foram observados condrócitos multinucleados tanto na IOA quanto na displasia do bumerangue. A displasia do bumerangue é diferenciada da AO com base em um defeito mais grave de mineralização, com ausência completa de ossificação em alguns elementos do membro e segmentos vertebrais.3 Uma preponderância de homens entre os casos relatados de displasia do bumerangue7 e algumas semelhanças fenotípicas com os distúrbios do espectro da síndrome otopalatodigital causados por mutações no gene FLNA12,13 sugeriu uma etiologia X ligada a alguns autores.7

Recentemente descrevemos a associação de mutações no gene que codifica a proteína filamin B 280 kDa citoesquelética com vários distúrbios caracterizados por defeitos esqueléticos e luxações articulares.14 A filamin B é uma proteína modular. Um domínio de ligação da actina composto por dois domínios de homologia da calponina (CH1 e CH2) está localizado no amino terminal, seguido por um domínio da haste composto por 24 repetições estruturalmente homólogas e terminando em um domínio de dimerização carboxiterminal.15 O domínio de ligação da actina na filamina B é similar aos encontrados em outras proteínas citoesqueléticas, como β-spectrina, distrofina e α-actinina-4.

Quatro condições distintas foram atribuídas a mutações no FLNB: AOI, AOIII, síndrome espondilarpotarsal hereditária recessiva (OMIM #272460), e uma forma dominante da síndrome de Larsen (OMIM #150250). Indivíduos com AOI, AOIII, e síndrome de Larsen dominantemente herdada foram encontrados como heterozigotos para mutações missense no FLNB.14 A maioria das mutações que levam à AOI ou AOIII levam a substituições localizadas ao domínio CH2 do domínio actin binding da filamina B. A única exceção é a mutação 2251G→C, localizada no exon 15, que é prevista para levar à substituição G751R na repetição 6, encontrada em um indivíduo com AOIII.14 Durante o trabalho que identificou o grupo de distúrbios resultantes de mutações no FLNB, um indivíduo com displasia de bumerangue foi avaliado para mutações por sequenciamento direto, mas nenhuma mutação foi identificada.14

Dadas as evidências radiográficas, fenotípicas e histológicas que sugerem que a displasia do bumerangue está relacionada a distúrbios causados por mutações em genes que codificam filaminas, examinamos dois indivíduos com displasia do bumerangue para mutações no FLNA e FLNB usando a análise por cromatografia líquida de alta performance (DHPLC) como técnica de triagem.

Indivíduo 1 foi o caso previamente examinado por seqüenciamento direto. Este feto masculino foi o primeiro filho de pais saudáveis e não consanguíneos. A ultra-sonografia do segundo trimestre revelou hipoplasia torácica e encurtamento acentuado de todos os membros com ossificação irregular de múltiplos elementos esqueléticos. O feto deu à luz com 22 semanas de gestação. A análise pós-morte demonstrou hipoplasia torácica acentuada, membros curtos e dismorfismo facial característico associado à displasia do bumerangue. Não havia encefalocoele ou omphalocoele presente. Os achados radiográficos foram típicos da displasia de bumerangue (fig. 1).

Indivíduo 2 foi um feto de 17 semanas de gestação, previamente relatado em detalhes por Wessels et al.8 Este feto demonstrou micromelia severa com dois dos três ossos tubulares longos ausentes nos quatro membros. Ao exame radiográfico, os raios restantes tinham a forma de bumerangue, as tíbias eram segmentadas, a coluna vertebral estava mal ossificada e o tórax hipoplásico. Histologicamente, a matriz da cartilagem era hipocelular com condrócitos gigantes multinucleados presentes.

As regiões codificadoras e as junções intron-exon de emendas tanto do FLNA quanto do FLNB foram amplificadas a partir de DNA genômico obtido de ambos os casos usando primers intrônicos descritos anteriormente13,14 (condições de reação e seqüências de primers estão disponíveis mediante solicitação). Para a análise do FLNA, os produtos amplicon foram visualizados por eletroforese em gel de agarose e depois misturados com quantidades iguais de produtos amplificados por PCR a partir de um controle masculino saudável não relacionado antes da formação de heterodifusão. As amostras foram submetidas a DHPLC em um sistema de análise de fragmentos de DNA WAVE (Transgenomic Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. Os amplificadores que demonstravam formas anómalas de traços foram re-amplificados e sequenciados em ciclos num sequenciador ABI 3100. As mutações identificadas foram confirmadas pela digestão enzimática de restrição do DNA amplificado, e a parentesco foi confirmada como declarada para o caso 1 pela segregação de seis micro-marcadores de satélite não ligados. As amostras parentais não estavam disponíveis para o caso 2. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Otago.

Exame do FLNB (exons 1-46) revelou mutações em ambos os sujeitos. No caso 1, o indivíduo demonstrou ser heterozigoto para a mutação 512T→G, o que se prevê que conduza à substituição L171R. Esta mutação cria um site para a enzima de restrição HpaII, permitindo a demonstração de que ela surgiu de novo nesta família (fig. 2), fornecendo evidência genética de patogenicidade. Em retrospectiva, esta mutação estava presente na análise original, mas foi negligenciada. A segunda mutação, 703T→C, foi encontrada no exon 4 no caso 2, e prevê a substituição da S235P (fig. 2). As amostras dos pais não estavam disponíveis, mas esta mutação não estava presente em 100 cromossomos de controle. Ambas as mutações estão previstas para alterar resíduos dentro da região CH2 do domínio de ligação da actina B. Estes resíduos são altamente conservados evolutivamente entre as filaminas vertebradas (fig. 3). As mutações sugerem que estes aminoácidos desempenham um papel crítico na função de ligação do domínio da actina. Para a mutação 703T→C, a mesma substituição foi observada no resíduo análogo no ACTN4, um gene que codifica a proteína adaptadora citoesquelética α-actinina-4 (fig. 3), em um paciente com glomerulosclerose focal e segmentar.16

Substituições associadas à doença dentro do domínio actin binding da filamina B levam a uma diversidade de fenótipos. Anteriormente relatamos substituições que levam à AOI (n = 3), AOIII (n = 1) e síndrome de Larsen (n = 2).14 Todos esses fenótipos estão associados a defeitos na esqueletogênese e formação articular. A identificação de mutações que levam a substituições dentro do domínio actina-ligante da filamina B em dois pacientes com displasia de bumerangue confirma que essa condição é alélica a esses distúrbios, refletindo suspeitas clínicas prévias de relação.2,3

Uma proporção das mutações que causam o espectro otopalatodigital dos distúrbios esqueléticos está dentro da região análoga do CH2 no FLNA. Essas mutações também levam a um amplo espectro de gravidade fenotípica.13 Não há correlação simples entre a localização dessas mutações e a gravidade dos defeitos resultantes na ossificação esquelética. Enquanto a síndrome otopalatodigital tipo 1 se manifesta de forma mais leve que a síndrome otopalatodigital tipo 2, essas condições podem resultar de substituições em resíduos próximos uns dos outros ou mesmo no mesmo resíduo.13,17 A observação de que mutações no domínio de ligação actina do FLNB também pode levar a um amplo espectro de gravidade recapitula esse padrão. A substituição prevista pela mutação encontrada no indivíduo 1, L171R, está próxima do local de uma substituição (A173V), causadora da IOA.14 Da mesma forma, a substituição S235P aqui relatada está dentro da mesma dobra protéica do E227K, uma substituição associada ao fenótipo menos severo e não letal, a síndrome de Larsen.14 Apesar dos relatos de substituições associadas à doença em resíduos dentro do CH2 do domínio de ligação da actina à distrofina, α-actinina-4,17 filamina A,13 e filamina B,14 um papel funcional para esta dobra protéica não foi definitivamente elucidado. Como os domínios CH2 não possuem propriedades inatas de ligação da actina isoladamente, foi postulado que o papel do CH2 na ligação da actina é, na melhor das hipóteses, indirecto.18

Filaminas actuam principalmente para estabilizar a actina dentro da célula, seja como feixes paralelos ou redes ortogonais em gel.19,20 Foram identificados múltiplos parceiros de ligação para a filamina A, a grande maioria associando-se através da filamina repete 16-24 (revisto em Stossel et al21). Cinco parceiros de ligação foram identificados para associar à filamina B: actin, FBLP-1,22 presenilina (PS1 e PS2),23 e GPIβα.24 Resta saber se mutações dentro dos domínios de ligação da actina das filaminas A e B exercem seu efeito patogênico principalmente por perturbar a ligação da actina ou através de uma dependência funcional entre a associação da actina e interações de ligação com outras proteínas.

Células gigantes multinucleadas são encontradas entre condrócitos na placa de crescimento de indivíduos com displasia de bumerangue. Estas aparências podem resultar de clivagem celular defeituosa durante a proliferação dos condrócitos dentro da placa de crescimento epifisária. Anteriormente temos demonstrado expressão generalizada de FLNB dentro da placa de crescimento e mais notadamente no sulco de clivagem dos condrócitos separadores.14 O processo de clivagem celular alterada levando à deformação do esqueleto defeituoso e mineralização no grupo de displasia do boomerang/atelosteogênese permanece por esclarecer.

A identificação de mutações causadoras de displasia do boomerang no FLNB confirma a displasia do boomerang como parte do espectro da condrodisplasia, incluindo AOI e III, e a síndrome de Larsen não letal. A sobreposição fenotípica entre a displasia do bumerangue e a AO, como relatada aqui e anteriormente, e a colocação de mutações subjacentes a estas doenças em exons que codificam o domínio de ligação de actina do FLNB é indicativo de um espectro clinicopatológico para estas doenças. Esta ampliação do espectro fenotípico associado às mutações no FLNB destaca a importância de um citoesqueleto de actina funcional para muitos processos morfogenéticos normais, incluindo a esqueletogênese.