ENU

Cilia in Vertebrate Cell-Cell Signaling

Em 2003, uma tela de mutagênese ENU implicou inesperadamente em cílios primários e IFT em sinalização Shh: Mutações de IFT em camundongos resultaram em fenótipos de padrões do tubo neural e de botões de membros semelhantes aos que resultam da ruptura da via Shh (Huangfu et al., 2003). Os cílios primários são organelas não móveis, baseadas em microtubos que se projetam da maioria das células vertebradas. Eles se estendem de corpos basais, e consistem de membranas especializadas (estruturalmente segregadas da membrana plasmática) ao redor de um axoneme central, ao longo do qual o mecanismo IFT facilita o transporte retrógrado e anterógrado entre a base ciliar e a ponta. A ruptura da ciliogênese ou IFT resulta em um amplo espectro de síndromes de ciliopatia humana. Os defeitos primários da doença ciliar incluem polidactilia, malformações craniofaciais e cerebrais, situs inversus, doença renal policística, obesidade, diabetes e defeitos sutis no fígado, baço e coração (Nigg e Raff, 2009; Goetz e Anderson, 2010; Hildebrandt et al, 2011).

Ciliogênese e a desmontagem de cílios primários estão firmemente acoplados à maquinaria do ciclo celular: cílios primários estão presentes em células quiescentes mas a sua desmontagem é necessária para a transição para o ciclo celular. A sinalização de Fgf e Wnt é necessária a montante da ciliogênese em vários contextos de vertebrados, incluindo a vesícula do nó/Kupffer (KV), vesículas óticas e dutos pronefróricos (Basu e Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Os alvos transcripcionais dessas vias de sinalização que medeiam a formação de cílios, padrões ou funções incluem Ift88, Enc1-like, e as TFs ciliogênicas Foxj1 e Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Experiências Epistasis estudando KV sugeriram que a sinalização Wnt funciona a jusante dos Fgfs em ciliogênese (Caron et al., 2012).

Em vertebrados, a via Shh utiliza cílios como uma organela de sinalização especializada na qual o IFT medeia mudanças na localização de proteínas essenciais para o processamento do Gli e conseqüentes respostas transcripcionais (Figura 1.1B). O receptor Hh Patched (Ptc) está na base do cilo primário na ausência do Hh. Na presença de Hh, Ptc sai do cório e Smo entra, e há um aumento no Gli localizado na ponta. Os complexos Gli-Sufu são enriquecidos nas pontas dos cílios primários de forma Smo-dependente e precisam ser dissociados para a ativação do caminho Shh (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, cujo ortolog promove o processamento Ci/Gli e antagoniza o Sufu em Drosophila, sofre transporte anterógrado induzido por Hh- desde a base do cílio até a ponta. O PKA, que fosforila o Gli como pré-requisito para a proteólise ao GliR, localiza-se na base de cílios primários e regula os níveis de Gli localizado na ponta (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Estudos de Shh e cílios/IFT indicaram que alguns traços de ciliopatia humana são provavelmente devido à sinalização de Shh perturbada. Além disso, defeitos ciliares podem aumentar ou suprimir a oncogênese devido a mutações da via Shh (Han et al., 2009). Os mutantes Cilia/IFT assemelham-se frequentemente aos mutantes LOF ou GOF Shh devido aos requisitos específicos do contexto para o processamento mediado por cílios de Gli para GliA ou GliR, respectivamente. Os fenótipos Hallmark incluem ventralização do tubo neural (que utiliza GliR) e polidactilia (os botões dos membros utilizam GliA; discutido em Goetz e Anderson, 2010). Mutações nos genes IFT e ciliopatia têm ajudado a identificar novos contextos nos quais cílios são necessários para a sinalização do desenvolvimento celular. Em alguns casos, esses experimentos têm lançado luz sobre as etiologias de traços de ciliopatia humana mal compreendidos. Por exemplo, estudos de Rpgrip11 (um gene da ciliopatia humana) e ratos mutantes Ttc21b demonstraram a importância da cilia primária na mediação de sinais Shh no cérebro ventral. Os mutantes Ttc21b têm cílios primários anormais com transporte retrógrado parcialmente defeituoso, mas transporte anterógrado funcional. Isto resulta em um fenótipo GOF como evidenciado pelo acúmulo de máquinas de sinalização Shh em pontas de cílios e expansão da expressão/actividade Shh no telencéfalo ventral e zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Os mutantes Rpgrip1l possuem células neuroepiteliais para o cérebro que carecem de cílios primários e são deficientes na produção de Gli processado, como esperado para Shh LOF (Besse et al., 2011). Essas mutações resultam ambas na expansão do subpálio em detrimento do pálio, semelhante aos mutantes de Gli3, pois a saída predominante da sinalização de Shh no forebrain ventral é o processamento de Gli3 à sua forma repressora (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Se a proteína Gli3R ativa é introduzida geneticamente, então cílios são dispensáveis neste contexto (Besse et al., 2011). Defeitos na patterização do forencéfalo ventral podem estar subjacentes a deficiências cognitivas em algumas ciliopatias.

Defeitos relacionados a shh não são responsáveis por todos os fenótipos nas ciliopatias humanas. Tornou-se evidente que o IFT/cilia são utilizados em alguns contextos para facilitar a sinalização por outras vias. Durante o desenvolvimento da pele dos mamíferos, os cílios primários são essenciais para a diferenciação terminal das células suprabasais, processo iniciado pela sinalização Notch/Delta (Figura 1F; Blanpain et al., 2006). Em ∼60-70% das células suprabasais, a Notch está concentrada nas membranas ciliares primárias, e a presenilina, uma proteína do complexo γ-secretase que clareia a Notch, está localizada nos corpos basais (Ezratty et al., 2011). A derrubada de genes IFT ou a eliminação de cílios in vivo resulta em diminuição da atividade do Notch repórter e comprometimento da diferenciação das células suprabasais. Além disso, a DNI, a forma ativa clivada de Notch, foi observada nos núcleos de células ciliadas, mas não unciliais, em quimeras genéticas (Ezratty et al., 2011).

Cilia também foram implicadas na sinalização PDGF. Em fibroblastos cultivados, PDGFRα tem sido observado em membranas ciliares primárias, e as proteínas de transdução de sinal ativadas RTK MEK1/2 e Akt estão localizadas ao longo do cório e na base ciliar, respectivamente (Schneider et al., 2005). Estudos de fibroblastos do tipo selvagem e Ift88 mutantes (sem cílios primários) indicaram que cílios primários de células líderes orientam-se para os locais da ferida e são necessários para quimiotaxia induzida por PDGF-AA e respostas in vitro de fosfo-Akt (Schneider et al., 2010). Notavelmente, os ratos mutantes Ift88 apresentam defeitos na reparação de feridas (Schneider et al., 2010). A sinalização PDGF através de PDGFRα também foi implicada na desmontagem de cílios e na transição de fase G1-S (discutida em Christensen et al., 2012), embora o significado in vivo desta observação ainda não seja conhecido.

O papel dos cílios na sinalização canónica Wnt tem sido controverso (revisto em Wallingford e Mitchell, 2011). Estudos de ratos mutantes Ift88 e Ift72 e zebrafish sugeriram que cílios não são essenciais para a sinalização de Wnt durante a embriogênese, e estudos de sinalização de Wnt em ratos mutantes Kif3a produziram resultados conflitantes (Huang e Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Em mutantes IFT retrógrados, um grupo não relatou nenhuma mudança na sinalização de Wnt, enquanto outro grupo demonstrou uma diminuição na atividade de Wnt em contextos que mantêm cílios, mas um aumento na sinalização de Wnt em contextos que perderam cílios (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Estudos das proteínas ciliar/ciliopatia Inversin, Chibby e Jouberin apoiam os papéis dos cílios na sinalização canônica de Wnt em contextos específicos de desenvolvimento. Inversin, que é mutado em pacientes humanos com nefronophthis tipo II, é expresso em monocilia de vertebrados, interage fisicamente com Disheveled (Dsh), e perturba a sinalização canônica de Wnt a jusante do Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Ratos mutantes invertidos exibem fenótipos de padrões renais e capilares reminiscentes dos fenótipos Wnt/Frz, assim como fenótipos de padrões esquerdos-direitos, provavelmente devido a defeitos na função monocilia do nó (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, uma proteína basal do corpo necessária para ciliogênese e ancoragem do corpo basal, interage fisicamente com β-catenin e regula negativamente a sinalização canônica de Wnt em embriões de Drosophila, epitélio pulmonar de mamíferos e células cultivadas de mamíferos (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Finalmente, a proteína da ciliopatia humana Jouberin é necessária em ratos para sinalização e proliferação normal de Wnt na linha média cerebelar. Isto provavelmente contribui para o defeito de fusão do hemisfério cerebelar observado em pacientes humanos com síndrome de Joubert e ratos com deficiência de Jouberin (Lancaster et al., 2011a). Em células ciliadas expostas a Wnt, Jouberin é sequestrado com β-catenin em corpos basais de forma dependente de IFT. Jouberin facilita a translocação nuclear de β-catenin; seu seqüestro de corpos basais impede a translocação nuclear de β-catenin e amortece as respostas de sinalização canônica de Wnt (Lancaster et al., 2011b). Juntos, esses achados sugerem que cílios não são globalmente necessários para a sinalização de Wnt durante a embriogênese, mas impactam os resultados da sinalização de Wnt em contextos selecionados.

Foi feita a hipótese de que cílios fornecem uma estrutura sensorial especializada dentro da qual múltiplos tipos de sinais são coordenados. Um modelo alternativo é que os cílios exibem especificidade de via (como os citonemas, discutidos abaixo) e assim restringem a resposta celular e/ou respostas de sinalização espacialmente segregadas. A especificidade da sinalização ciliar pode ser mediada pelo direcionamento diferencial de proteínas de sinalização para cílios, e/ou utilização de subconjuntos distintos de proteínas IFT ou adaptadores específicos de carga para transporte de axonemas (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).