The What, Why and How of Explant Culture

What Is Explant Culture and Why Should I Use It?

Explant culture is the culture of small pieces of tissue surgically removed from animal tissue or organ. Jest to metoda przydatna z kilku powodów.

1. Utrzymanie architektury histotypowej i właściwości biochemicznych komórek oznacza, że bardziej przypomina tkankę in vivo niż ustalone linie komórkowe.
2. Hodowle eksplantatów zachowują własne cytokiny i czynniki wzrostu, co oznacza, że proliferacja jest mniej stresująca i bardziej istotna biologicznie.
3. Komórki migrujące z eksplantatu są w molekularnej komunikacji z komórkami towarzyszącymi eksplantatu, co zapewnia kluczowe biochemiczne i biomechaniczne sygnały, które są istotne dla morfogenezy tkanek, różnicowania i homeostazy.

Kiedy mogę użyć tej metody?

Hodowla eksplantatów jest używana do tworzenia różnych linii komórkowych z różnych źródeł, w tym ssaków, gryzoni i ptaków. Ponieważ hodowle bardziej przypominają sytuację komórek in vivo, technika ta jest przydatna w wielu zastosowaniach, w tym w uzyskiwaniu komórek macierzystych, badaniach nad rakiem, inżynierii genetycznej, produkcji szczepionek, badaniach przesiewowych leków i badaniach toksykologicznych.

Jak przeprowadzić hodowlę eksplantatów?

Uzyskanie eksplantatu

Eksplantat można uzyskać chirurgicznie przy użyciu sterylnego sprzętu z narządów lub tkanek ssaków, gryzoni lub ptaków. Na przykład, kawałek tkanki dziąsłowej po usunięciu zęba może być usunięty jako eksplantat do ustanowienia ludzkich fibroblastów dziąsłowych lub kawałek tkanki tłuszczowej może być użyty do ustanowienia mezenchymalnych komórek macierzystych.

Cięcie i czyszczenie eksplantatu

Gdy już masz swoją tkankę, nadszedł czas na jej cięcie i czyszczenie. Najpierw należy umieścić ją w szalce Petriego zawierającej około 1-2 mL niekompletnej pożywki (pożywka bez surowicy). Następnie, używając ostrego noża chirurgicznego, można ją pociąć (zwykle na kawałki o wymiarach 1×1 mm). Zbierz kawałki eksplantatu za pomocą sterylnych kleszczyków i delikatnie umyj. Płukanie może być wykonane poprzez przeniesienie kawałków do probówki wirówkowej zawierającej około 0,5 mL niekompletnego podłoża. Delikatnie wymieszać przez pipetowanie pożywki 4 do 5 razy, pozwolić, aby kawałki osiadły i usunąć górną pożywkę. Czynność tę można powtórzyć 2 lub 3 razy.

Kulturowanie eksplantatów

Te uzyskane eksplantaty umieszcza się aseptycznie na pokrytej powierzchni i pozwala się im przyłączyć do powierzchni w obecności bogatego podłoża hodowlanego. Jest to zazwyczaj podstawowe podłoże minimalne, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) lub Minimum Essential Medium Eagle (MEM) uzupełnione 10-15% surowicy. Eksplantaty są następnie hodowane w standardowych warunkach hodowli tkankowej (pH 7,2-7,4, temperatura 37°C, 5% CO2 i wilgotność), aby umożliwić migrację i proliferację komórek.

Podłoże należy zmieniać co 3 dni, nie naruszając przy tym eksplantatów. W zależności od stanu zdrowia i wieku tkanki, komórki wyłaniają się z eksplantatu w ciągu 15-30 dni. Po rozpoczęciu wyrastania komórek z eksplantatu, należy dodawać 5 mL pożywki do kolby w kolejnych dniach.

Podkultura i zakładanie linii komórkowej

Po całkowitym otoczeniu eksplantatów komórkami, można trypsynizować komórki i podkulturować. Lepiej jest użyć niższego stężenia trypsyny (np. <0,25% trypsyny przez 5 min). Wybierz odpowiedni rozmiar kolby do posiewu, w zależności od całkowitej liczby uzyskanych komórek.

Wyzwania w hodowli eksplantatów

Choć eksplantaty są świetne w użyciu, istnieje kilka przeszkód, które należy pokonać przed rozpoczęciem pracy z nimi. Główne wyzwania to:

• komórki potrzebują czasu, aby wyłonić się z eksplantatu, stąd ustanowienie linii komórkowej może zająć około miesiąca
• możliwość zanieczyszczenia eksplantatu
• generowanie heterogenicznych komórek lub mieszanej populacji komórek.

Ale nie martw się, oto kilka prostych wskazówek, jak pokonać te problemy.

Młodsze komórki rosną szybciej

Jeśli chcesz otrzymać komórki szybciej (w ciągu 15 dni), upewnij się, że pobierasz eksplantat od zdrowego i młodego dawcy. Ponieważ młodsze komórki dzielą się i rosną szybciej, zachowują swój charakterystyczny wzrost również w warunkach in vitro, więc szanse na szybkie uzyskanie komórek z eksplantatu są bardzo wysokie.

Unikanie zanieczyszczeń

Zanieczyszczeń przenoszonych przez eksplantat można uniknąć zanurzając fragment tkanki w roztworze powidonu z jodem na 2 do 3 minut. Usunąć resztki powidonu-jodyny, płucząc eksplantat w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4). Następnie można umieścić eksplantat w minimalnej niekompletnej pożywce i oddzielić twarde lub martwe tkanki, jeśli takie występują.

Uzyskanie jednorodnej populacji komórek z niejednorodnej

Zwykle w hodowli eksplantatów obserwuje się niejednorodne komórki we wczesnych pasażach. Aby przezwyciężyć ten problem, wykorzystaj swoją wiedzę na temat morfologii i wzoru wzrostu interesujących cię komórek. W przypadku hodowli eksplantatów tkanki dziąsłowej, komórki fibroblastów dziąsłowych o wrzecionowatym kształcie wyłaniają się z eksplantatu jako pierwsze, przed pojawieniem się komórek keratynocytów dziąsłowych.

Keratynocyty dziąsłowe mają morfologię od owalnej do brukowanej, zaczynają pojawiać się tydzień po wyłonieniu się komórek fibroblastów z eksplantatu i rosną ponad monowarstwą komórek fibroblastów (Rycina 1).

Figura 1. Rozmnażanie ludzkich komórek fibroblastów dziąsłowych z keratynocytami dopiero co wyłonionymi z tkanki eksplantatu dziąsłowego

Jeśli celem jest ustanowienie linii komórkowej fibroblastów dziąsłowych z tkanki dziąsłowej, należy pozwolić, aby kolba stała się konfluentna z komórkami fibroblastów, a następnie natychmiast ją podkulturować. Ponieważ komórki keratynocytów są mniej liczne, zanikają w kolejnych 3 do 4 pasażach (Rycina 2).

Figura 2. A Monolayer of Human Gingival Fibroblast cells

Jeśli celem jest ustanowienie komórek keratynocytów z eksplantatu dziąsłowego, należy zeskrobać komórki fibroblastów i dodać do kolby pożywkę specyficzną dla keratynocytów, tak aby tylko wzrost keratynocytów był wspomagany.

Metoda eksplantacyjna jest prostą i opłacalną techniką stosowaną do ustanowienia linii komórkowych, które mają. właściwości histolityczne, biochemiczne i biomechaniczne podobne do in vivo. Dlatego też metoda ta jest akceptowana i szeroko stosowana w biologii komórkowej i molekularnej. Czy używasz hodowli eksplantatów w swoim laboratorium? Czy rozważyłbyś to? Zostaw komentarz poniżej.

.