Vad, varför och hur man odlar explantatkultur

Vad är explantatkultur och varför ska jag använda den?

Explantatkultur är odling av små vävnadsbitar som avlägsnats kirurgiskt från en djurvävnad eller ett organ. Det är en användbar metod av flera anledningar.

1. Underhållet av cellernas histotypiska arkitektur och biokemiska egenskaper innebär att den mer liknar vävnaden in vivo än etablerade cellinjer.
2. Explantatvävnader behåller sina egna cytokiner och tillväxtfaktorer, vilket innebär att proliferation är mindre stressande och mer biologiskt relevant.
3. Celler som migrerar från en explosiv vävnad står i molekylär kommunikation med explosivvävnadens kompanjonceller, vilket ger viktiga biokemiska och biomekaniska signaler som är väsentliga för vävnadsmorfogenes, differentiering och homeostas.

När kan jag använda den här metoden?

Explantatodling används för att etablera en mängd olika cellinjer från olika källor, inklusive däggdjur, gnagare och fåglar. Eftersom kulturerna mer liknar cellernas situation in vivo är denna teknik användbar i en mängd olika tillämpningar, bland annat för att få fram stamceller, cancerforskning, genteknik, vaccinproduktion, läkemedelsscreening och toxikologiska tester.

Hur utför jag en explantatkultur?

Hämtning av explantat

En explant kan tas fram kirurgiskt med hjälp av steril utrustning från organ eller vävnader från däggdjur, gnagare eller fåglar. Till exempel kan en bit gingivavävnad efter tandutdragning avlägsnas som en explant för att etablera mänskliga gingivafibroblaster eller en bit fettvävnad kan användas för att etablera mesenkymala stamceller.

Skära och rengöra explantatet

När du har fått din vävnad är det dags att skära och rengöra den. Du vill först placera den i en petriskål som innehåller cirka 1-2 ml ofullständigt medium (medium utan serum). Därefter kan du med hjälp av en vass kirurgisk kniv skära upp den (vanligtvis cirka 1×1 mm stora bitar). Samla ihop bitarna av explanten med hjälp av en steril pincett och tvätta försiktigt. Tvättning kan göras genom att överföra bitarna till ett centrifugeringsrör som innehåller cirka 0,5 ml ofullständigt medium. Blanda försiktigt genom att pipettera mediet 4-5 gånger, låt bitarna sätta sig och ta bort det övre mediet. Detta kan upprepas 2 eller 3 gånger.

Kulturering av explants

Dessa erhållna explants placeras aseptiskt på en belagd yta och tillåts fästa på ytan i närvaro av ett rikt odlingsmedium. Detta är vanligtvis basalt minimalt medium, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) eller Minimum Essential Medium Eagle (MEM) kompletterat med 10-15 % serum. Explantationsplantorna odlas sedan i vanliga vävnadskulturförhållanden (pH 7,2-7,4, temperatur 37 °C, 5 % CO2 och luftfuktighet) för att möjliggöra cellmigration och proliferation.

Du måste byta media var tredje dag utan att störa explantationsplantorna. Beroende på vävnadens hälsa och ålder kommer cellerna ut ur explantatet inom 15-30 dagar. När utväxten av celler börjar från explanten, tillsätt 5 ml medium till kolven de följande dagarna.

Subkultivering och etablering av cellinje

När explanterna är helt omgivna av cellerna kan du trypsinera cellerna och subkultivera dem. Det är bättre att använda en lägre koncentration av trypsin (t.ex. <0,25 % trypsin i 5 minuter). Välj en lämplig storlek på kolven för utplantering, beroende på det totala antalet erhållna celler.

Utmaningar vid explantatodling

Men även om explanter är utmärkta att använda finns det några hinder som du måste övervinna innan du arbetar med dem. De viktigaste utmaningarna är:

• Cellerna tar tid på sig att växa fram ur explanten, därför kan upprättandet av en cellinje ta ungefär en månad
• Möjligheten till kontaminering från explanten
• Generering av heterogena celler eller en blandad population av celler.

Men oroa dig inte, här är några enkla tips för att övervinna dessa problem.

Ungare celler växer snabbare

Om du vill få dina celler snabbare (inom 15 dagar), se till att du samlar in explanten från en frisk och yngre donator. Eftersom yngre celler delar sig och växer snabbare behåller de sin karakteristiska tillväxt in vitro också, så chansen att få cellerna snabbt från explanten är mycket stor.

Undervik kontaminering

Den explantburna kontamineringen kan undvikas genom att vävnadsstycket doppas i en povidon-jodlösning i 2 till 3 minuter. Avlägsna resterande povidon-jodrester genom att skölja explanten i fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4). Du kan sedan placera explanten i minimalt ofullständigt medium och separera hårda eller döda vävnader om det finns några.

För att få fram en homogen cellpopulation från en heterogen

I vanliga fall observeras heterogena celler i explantodling vid tidiga passager. För att övervinna detta problem tillämpar du din kunskap om morfologin och tillväxtmönstret hos de celler du är intresserad av. När det gäller explantodling av gingival vävnad kommer spindelformade gingivala fibroblastceller först fram ur explanten, innan gingivala keratinocytceller dyker upp.

Gingivala keratinocyter har en oval till kullerstensliknande morfologi och börjar dyka upp en vecka efter det att fibroblastcellerna kommit ut ur explantatet och växer ovanför fibroblastcellmonolagret (figur 1).

Figur 1. Förökning av mänskliga gingivala fibroblastceller med keratinocyter som just kommit fram från gingival explantvävnad

Om målet är att etablera en gingival fibroblastcellinje från gingivalvävnad, låt kolven bli konfluent med fibroblastceller och subkultivera den sedan omedelbart. Eftersom keratinocytcellerna är färre i antal försvinner de under de efterföljande 3 till 4 passagerna (figur 2).

Figur 2. Ett monolager av mänskliga gingivala fibroblastceller

Om målet är att etablera keratinocytceller från gingival explant, skrapa bort fibroblastcellerna och tillsätt keratinocytspecifikt medium till kolven så att endast keratinocyttillväxt stöds.

Explantatmetoden är en enkel och kostnadseffektiv teknik som används för att etablera cellinjer som har. histolytiska, biokemiska och biomekaniska egenskaper som liknar dem in vivo. Därför är denna metod accepterad och används i stor utsträckning inom cellulär och molekylärbiologi. Använder du explantkultur i ditt labb? Skulle du överväga att använda den? Lämna en kommentar nedan.