Mutacje w FLNB powodują dysplazję bumerangową | Journal of Medical Genetics

Dysplazja bumerangowa (OMIM #112310) jest śmiertelną dysplazją szkieletową charakteryzującą się nieuporządkowanym kostnieniem szkieletu.1 Charakterystyczne wyniki badań radiologicznych obejmują nieregularne kostnienie kości kończyn i kręgów, niedorozwój panewki i hipoplastyczne, bumerangowate kości udowe, od których zaburzenie to wzięło swoją nazwę.1 W literaturze opisano do tej pory co najmniej osiem przypadków.1-8 Podobna śmiertelna dysplazja szkieletowa, dysplazja Piepkorna,9 została uznana za alleliczną w stosunku do dysplazji bumerangu.2,7 Badanie histologiczne chrząstki wykazuje zarówno zdezorganizowany anagen chrzęstny rozwijającej się kości długiej, jak i częste występowanie wielojądrowych chondrocytów w strefie rezerwowej płytki wzrostowej.1 Opisano również inne nieprawidłowości rozwojowe poza szkieletem, w tym omphalocele i encephalocele.

Podobieństwa w obrazie radiologicznym i histologicznym dysplazji bumerangu i atelosteogenezy I (AOI; OMIM #108720) i III (AOIII; OMIM #108721) sugerują allelizm dla tych zaburzeń.2,10 We wszystkich trzech jednostkach chorobowych, oprócz nieprawidłowości czaszkowo-twarzowych, w obrazie radiologicznym stwierdza się niedobór i nieregularne kostnienie kości i trzonów kręgów z hipoplazją dalszej nasady kości ramiennej i zwichnięciami stawów.11 Ponadto zarówno w AOI, jak i w dysplazji bumerangowej obserwowano wielojądrowe chondrocyty. Dysplazję bumerangu od AO odróżnia bardziej nasilony defekt mineralizacji, z całkowitym brakiem kostnienia w niektórych elementach kończyn i odcinkach kręgów.3 Przewaga mężczyzn wśród opisanych przypadków dysplazji bumerangu7 oraz pewne podobieństwa fenotypowe do zaburzeń ze spektrum zespołu otopalatodigital spowodowanych mutacjami w genie FLNA12,13 sugerowały niektórym autorom etiologię sprzężoną z układem X.7

Ostatnio opisaliśmy związek mutacji w genie kodującym białko cytoszkieletowe filaminę B o masie 280 kDa z kilkoma zaburzeniami charakteryzującymi się wadami układu kostnego i zwichnięciami stawów.14 Filamina B jest białkiem modularnym. Na końcu aminowym znajduje się domena wiążąca aktynę złożona z dwóch domen homologicznych kalponiny (CH1 i CH2), a następnie domena pręcikowa składająca się z 24 strukturalnie homologicznych powtórzeń i zakończona karboksyterminalną domeną dimeryzacyjną.15 Domena wiążąca aktynę w filaminie B jest podobna do domen występujących w innych białkach cytoszkieletowych, takich jak β-spektryna, dystrofina i α-aktynina-4.

Cztery odrębne schorzenia przypisano mutacjom w FLNB: AOI, AOIII, recesywnie dziedziczony zespół spondylocarpotarsal (OMIM #272460) i dominująca postać zespołu Larsena (OMIM #150250). U osób z AOI, AOIII i dominująco dziedziczonym zespołem Larsena stwierdzono heterozygotyczność mutacji typu missense w FLNB.14 Większość mutacji prowadzących do AOI lub AOIII prowadzi do substytucji zlokalizowanych w domenie CH2 domeny wiążącej aktynę filaminy B. Jedynym wyjątkiem jest mutacja 2251G→C, zlokalizowana w eksonie 15, która według przewidywań prowadzi do substytucji G751R w powtórzeniu 6, stwierdzona u osoby z AOIII.14 Podczas prac, w których wyodrębniono grupę zaburzeń wynikających z mutacji w FLNB, u jednego osobnika z dysplazją bumerangową oceniano mutacje metodą bezpośredniego sekwencjonowania, ale nie zidentyfikowano żadnej mutacji.14

Osoba 1 była przypadkiem wcześniej zbadanym przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Ten płód płci męskiej był pierwszym dzieckiem zdrowych rodziców, którzy nie byli spokrewnieni. Badanie ultrasonograficzne w drugim trymestrze ciąży wykazało hipoplazję klatki piersiowej i znaczne skrócenie wszystkich kończyn z nieregularnym kostnieniem wielu elementów kostnych. Płód urodzono w 22 tygodniu ciąży. Analiza pośmiertna wykazała znaczną hipoplazję klatki piersiowej, krótkie kończyny oraz charakterystyczny dysmorfizm twarzy związany z dysplazją bumerangu. Nie stwierdzono encefalocoele ani omphalocoele. Wyniki badań radiograficznych były typowe dla dysplazji bumerangu (ryc. 1).

Pacjent 2 był płodem z 17 tygodnia ciąży, opisanym wcześniej szczegółowo przez Wesselsa i wsp.8 Płód ten wykazywał ciężką mikromelię z brakiem dwóch z trzech długich kości rurowych we wszystkich czterech kończynach. W badaniu radiologicznym pozostałe kości promieniowe miały kształt bumerangu, kości piszczelowe były segmentowe, kręgosłup był słabo skostniały, a klatka piersiowa hipoplastyczna. Histologicznie, macierz chrzęstna była hipokomórkowa z obecnością wielojądrowych olbrzymich chondrocytów.

Regiony kodujące i połączenia splice junctions intron-exon zarówno FLNA, jak i FLNB amplifikowano z genomowego DNA uzyskanego z obu przypadków przy użyciu starterów intronowych opisanych wcześniej13,14 (warunki reakcji i sekwencje starterów są dostępne na życzenie). Do analizy FLNA, produkty amplikonowe były wizualizowane przez elektroforezę na żelu agarozowym, a następnie mieszane z równymi ilościami produktów amplifikowanych PCR od niespokrewnionego zdrowego mężczyzny kontroli przed utworzeniem heterodupleksu. Próbki zostały poddane DHPLC w systemie analizy fragmentów DNA WAVE (Transgenomic Inc.) zgodnie z instrukcjami producenta. Amplikony wykazujące anomalne formy śladowe były ponownie amplifikowane i sekwencjonowane cyklicznie na sekwenatorze ABI 3100. Zidentyfikowane mutacje zostały potwierdzone przez trawienie enzymami restrykcyjnymi amplifikowanego DNA, a rodzicielstwo zostało potwierdzone jako zadeklarowane dla przypadku 1 przez segregację sześciu niepowiązanych markerów mikrosatelitarnych. Próbki rodzicielskie były niedostępne dla przypadku 2. Badanie to zostało zatwierdzone przez komitet etyczny Otago.

Badanie FLNB (eksony 1-46) ujawniło mutacje w obu przedmiotach. W przypadku 1, osobnik był heterozygotyczny dla mutacji 512T→G, która, jak się przewiduje, prowadzi do substytucji L171R. Mutacja ta tworzy miejsce dla enzymu restrykcyjnego HpaII, co umożliwiło wykazanie, że powstała ona de novo w tej rodzinie (ryc. 2), dostarczając genetycznych dowodów patogenności. Patrząc wstecz, mutacja ta była obecna w pierwotnej analizie, ale została przeoczona. Druga mutacja, 703T→C, została znaleziona w eksonie 4 w przypadku 2 i przewiduje substytucję S235P (ryc. 2). Próbki rodzicielskie nie były dostępne, ale ta mutacja nie była obecna w 100 chromosomach kontrolnych. Przewiduje się, że obie mutacje zmieniają reszty w regionie CH2 domeny wiążącej aktynę filaminy B. Te reszty są wysoce ewolucyjnie konserwowane wśród filamin kręgowców (ryc. 3). Mutacje sugerują, że te aminokwasy odgrywają krytyczną rolę w funkcji domeny wiążącej aktynę. W przypadku mutacji 703T→C taką samą substytucję zaobserwowano w analogicznej reszcie w ACTN4, genie kodującym cytoszkieletowe białko adaptorowe α-aktyninę-4 (ryc. 3), u pacjenta z ogniskowym i segmentowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych.16

Związane z chorobami substytucje w obrębie domeny wiążącej aktynę filaminy B prowadzą do różnorodnych fenotypów. Wcześniej opisywaliśmy substytucje prowadzące do AOI (n = 3), AOIII (n = 1) i zespołu Larsena (n = 2).14 Wszystkie te fenotypy związane są z defektami w szkielecie i tworzeniu stawów. Identyfikacja mutacji prowadzących do substytucji w obrębie domeny wiążącej aktynę filaminy B u dwóch pacjentów z dysplazją bumerangu potwierdza, że schorzenie to jest alleliczne z tymi zaburzeniami, odzwierciedlając wcześniejsze kliniczne podejrzenia o pokrewieństwie.2,3

Część mutacji powodujących spektrum otopalatodigitalnych zaburzeń szkieletowych leży w analogicznym regionie CH2 w FLNA. Mutacje te również prowadzą do szerokiego spektrum ciężkości fenotypowej.13 Nie ma prostej korelacji pomiędzy lokalizacją tych mutacji a ciężkością wynikających z nich defektów kostnienia szkieletu. Podczas gdy zespół otopalatodigital typu 1 objawia się łagodniej niż zespół otopalatodigital typu 2, te stany mogą wynikać z substytucji w resztach znajdujących się w bliskiej odległości od siebie lub nawet w tej samej reszcie.13,17 Obserwacja, że mutacje w domenie wiążącej aktynę FLNB mogą również prowadzić do szerokiego spektrum ciężkości, odtwarza ten wzorzec. Substytucja przewidywana przez mutację znalezioną u osobnika 1, L171R, znajduje się w bliskim sąsiedztwie miejsca substytucji (A173V), powodującej AOI.14 Podobnie, substytucja S235P opisana tutaj znajduje się w tym samym fałdzie białka, co E227K, substytucja związana z mniej ciężkim, nieśmiertelnym fenotypem, zespołem Larsena.14 Pomimo doniesień o związanych z chorobą substytucjach w resztach w obrębie CH2 domeny wiążącej aktynę dystrofiny, α-aktyniny-4,17 filaminy A,13 i filaminy B,14 funkcjonalna rola tej fałdy białkowej nie została ostatecznie wyjaśniona. Ponieważ domeny CH2 nie posiadają żadnych wrodzonych właściwości wiązania aktyny w izolacji, postuluje się, że rola CH2 w wiązaniu aktyny jest w najlepszym przypadku pośrednia.18

Filaminy działają przede wszystkim w celu stabilizacji aktyny w komórce, albo w postaci równoległych wiązek, albo ortogonalnych sieci żelowych.19,20 Zidentyfikowano wielu partnerów wiążących dla filaminy A, z których zdecydowana większość wiąże się poprzez powtórzenia filaminowe 16-24 (przegląd w Stossel i wsp.21). Wykazano, że pięciu partnerów wiążących łączy się z filaminą B: aktyna, FBLP-1,22 presenilina (PS1 i PS2),23 i GPIβα.24 Nie wiadomo jeszcze, czy mutacje w obrębie domen wiążących aktynę filamin A i B wywierają swój patogenny wpływ przede wszystkim poprzez zaburzenie wiązania z aktyną, czy też poprzez funkcjonalną zależność pomiędzy wiązaniem z aktyną a interakcjami z innymi białkami.

Wśród chondrocytów w płytce wzrostowej osób z dysplazją bumerang występują wielojądrowe komórki olbrzymie. Pojawienie się tych komórek może być wynikiem wadliwego rozszczepiania komórek podczas proliferacji chondrocytów w obrębie nasadowej płytki wzrostowej. Wcześniej wykazaliśmy powszechną ekspresję FLNB w obrębie płytki wzrostowej, a w szczególności w bruździe rozszczepienia dzielących się chondrocytów.14 Proces zmienionego rozszczepiania komórek prowadzący zarówno do wadliwego modelowania szkieletu, jak i mineralizacji w grupie zaburzeń dysplazji bumerangu/atelosteogenezy pozostaje do wyjaśnienia.

Identyfikacja mutacji powodujących dysplazję bumerangu w FLNB potwierdza dysplazję bumerangu jako część spektrum chondrodysplazji, w tym AOI i III oraz nieletalny zespół Larsena. Fenotypowe nakładanie się dysplazji bumerangowej i AO, jak opisano tutaj i poprzednio, oraz kolokalizacja mutacji leżących u podstaw tych chorób w eksonach kodujących domenę wiążącą aktynę w FLNB wskazuje na kliniczno-patologiczne spektrum tych zaburzeń. To dalsze poszerzenie spektrum fenotypowego związanego z mutacjami w FLNB podkreśla znaczenie funkcjonalnego cytoszkieletu aktynowego dla wielu prawidłowych procesów morfogenetycznych, w tym szkieletu.