Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe

Experimental design and reproducibility

Aby zbadać wpływ CHX na eksperymenty profilowania rybosomów zastosowaliśmy tę technikę do komórek S. pombe rosnących wykładniczo (bez stresu) i po 1 godzinie głodzenia azotem (stres żywieniowy). Każda hodowla została podzielona na dwie części, a jedna z nich była inkubowana z CHX w stężeniu 100 µg/ml przez 5 minut przed pobraniem (jest to „standardowe” stężenie stosowane w większości opublikowanych eksperymentów). Komórki zostały zebrane przez filtrację i natychmiast zamrożone w ciekłym azocie, aby zapobiec dalszej translokacji. Należy zauważyć, że CHX był obecny w buforach lizujących dla wszystkich próbek. Dlatego wszystkie odniesienia do traktowania CHX poniżej odnoszą się tylko do jego dodania do medium hodowlanego. Wykonaliśmy dwa niezależne powtórzenia biologiczne dla każdego z czterech eksperymentów (plus/minus azot, plus/minus CHX). Dla każdej próbki przygotowaliśmy i wyizolowaliśmy fragmenty chronione przez rybosomy (RPF lub ślady rybosomów), jak opisano w Metodach, i analizowaliśmy je za pomocą sekwencjonowania Illumina o wysokiej przepustowości. Sekwencjonowaliśmy również RNA pozbawione rRNA z każdej z ośmiu próbek (RNA-seq). Aby ocenić odtwarzalność techniki, dla każdego eksperymentu określiliśmy ilościowo liczbę odczytów RPF i RNA-seq, które mapowały do każdej adnotowanej sekwencji kodującej genomu S. pombe. Dane były wysoce powtarzalne, ze średnimi korelacjami pomiędzy niezależnymi replikami biologicznymi wynoszącymi 0,97 (Tabela 1). Poniżej koncentrujemy się na tym, jak CHX wpływa na eksperymenty profilowania rybosomów. Pełniejsza analiza biologii odpowiedzi komórek S. pombe na głód azotowy zostanie opublikowana w innym miejscu.

Aby zbadać wpływ CHX zbadaliśmy cztery aspekty translacji: 1] całkowitą gęstość rybosomalną dla sekwencji kodujących poszczególnych genów, 2] obecność rybosomów na sekwencjach 5′ lidera, 3] uprzedzenia w lokalizacji rybosomów w poprzek sekwencji kodujących i 4] dystrybucję rybosomów wzdłuż poszczególnych kodonów.

Gęstość rybosomów

Obliczyliśmy ilościowo liczbę odczytów RPF na sekwencjach kodujących dla każdego anotowanego genu w komórkach traktowanych CHX lub mock-treated. W warunkach głodzenia azotem korelacja między oboma sposobami leczenia była bardzo wysoka (średnia R = 0,96), ale ~4,5% wszystkich genów wykazywało konsekwentnie wyższą gęstość rybosomalną w obecności CHX (2-krotnie lub więcej w obu replikacjach, Fig. 1a i Supplementary Fig. S1). Podobnych zmian nie zaobserwowano w próbkach mRNA (średnia R = 0,98), co wskazuje, że efekt ten wynikał ze zmian w translacji, a nie w transkryptomie (Fig. 1a, Supplementary Fig. S1).

Wpływ CHX na ogólną gęstość rybosomów na sekwencjach kodujących. (a) Wykresy rozrzutu porównujące poziomy mRNA (góra) i gęstości rybosomów (dół) pomiędzy komórkami nieleczonymi i traktowanymi CHX. Dane są przedstawione dla komórek rosnących w obecności źródła azotu (+N) lub pozbawionych azotu (-N). Geny kodujące białka rybosomalne pokazane są na zielono. Wszystkie dane zostały znormalizowane do RPKMs (Reads Per Kilobase per Million mapped reads). (b) Po lewej: Boxploty porównujące gęstości rybosomalne między komórkami nieleczonymi i traktowanymi CHX dla grup genów o wskazanych średnich długościach sekwencji kodujących. Po prawej: podobne dane dla wskazanych długości 5′ sekwencji wiodących. W czerwonych polach pokazano zachowanie mRNA kodującego białka rybosomalne. (c) Porównanie zmian w poziomach mRNA i gęstości rybosomalnych pomiędzy komórkami głodzonymi azotem (-N) i komórkami niestresowanymi (+N). Dane przedstawione są dla komórek traktowanych CHX (po lewej) i dla komórek nie traktowanych (po lewej). Geny kodujące białka rybosomalne są pokazane na zielono.

Co zaskakujące, grupa ta obejmowała większość genów kodujących białka rybosomalne (RPs, Fig. 1a i Supplementary Fig. S1, zielone kropki). Aby wykluczyć możliwość, że CHX powoduje subtelne zmiany w poziomie mRNA, porównaliśmy zmiany wywołane przez głodówkę azotową w obecności lub bez CHX (Supplementary Fig. S2). Mediana fałdowej zmiany poziomów mRNA dla genów RP wynosiła 0,25 w próbkach traktowanych CHX i 0,24 w komórkach nieleczonych, co potwierdza, że zmiany gęstości rybosomalnej genów RP po głodówce azotowej wynikają ze zmian w translacji.

Geny RP są generalnie dość krótkie, z medianą długości 447 nukleotydów w porównaniu z 1,131 dla wszystkich genów. Dlatego prostym wyjaśnieniem tego wzbogacenia może być to, że CHX zapobiega „ucieczce” rybosomów z krótkich genów podczas zbierania komórek, zwiększając w ten sposób ich pozorną gęstość rybosomów. Jednakże, chociaż istniała niewielka tendencja, aby gęstość rybosomów w krótszych genach była wyższa w obecności CHX, był to niewielki efekt i nie mógł odpowiadać za zachowanie genów białek rybosomalnych (ryc. 1b). MRNA kodowane przez te geny mają również tendencję do krótszych sekwencji 5′ lidera (mediana 68,5 nukleotydów w porównaniu do 173 dla wszystkich genów), ale nie było ogólnej korelacji między długością 5′ lidera a wyższą gęstością rybosomów w CHX (Rys. 1c). Tylko 9 genów kodowanych jądrowo (~ 0,2%) wykazało zmniejszenie gęstości rybosomów w CHX (Fig. 1a i Supplementary Fig. S1), a oni nie mieli żadnych wspólnych cech.

Dla kontrastu, w warunkach niestresowych, lek miał bardzo słaby wpływ na gęstość rybosomalną (średnia R = 0,98), z mniej niż 1% genów wykazujących różnice w gęstości większe niż 2-krotne (23 geny wyższe w CHX i 9 niższe, Fig. 1a i Supplementary Fig. S1). Co ciekawe, niewielka grupa genów, które wykazywały niższe gęstości w komórkach traktowanych CHX, była również wzbogacona w geny białek rybosomalnych (12/23 mRNA).

Wnioskujemy, że mRNA kodujące RP są szczególnie wrażliwe na obecność CHX, a zjawisko to nie może być wyjaśnione wyłącznie przez ich krótkie 5′ lidera i sekwencje kodujące. Ponadto, efekt ten jest silny tylko w warunkach stresu żywieniowego. Jednakże, wyniki te nie ujawniają, która z dwóch próbek (traktowana CHX lub nietraktowana) lepiej odzwierciedla sytuację in vivo. Na przykład, geny RP są bogate w optymalne kodony, co sugeruje, że elongacja translacji zachodzi z dużą prędkością. Ta właściwość, wraz z ich krótką długością, może czynić je bardziej wrażliwymi na spływanie rybosomów podczas pobierania. W tym przypadku CHX ustabilizowałby dystrybucję in vivo. Alternatywnie możliwe jest również, że CHX ma bezpośredni wpływ na translację tych mRNA, prowadząc do niefizjologicznych gęstości rybosomalnych.

Następnie zbadaliśmy, czy zmiany gęstości rybosomów spowodowane przez CHX wpłynęłyby na interpretację translacyjnej / transkrypcyjnej odpowiedzi na głód azotowy. Określiliśmy ilościowo wydajność translacji (TE), normalizując liczbę RPF przez poziomy mRNA i obliczyliśmy logiczną zmianę w TE i poziomach transkryptów między komórkami hodowanymi w pożywce zawierającej azot i komórkami głodzonymi azotem (Figura 1c i Uzupełniające Figura S1B). W obecności CHX, głodzenie azotem prowadziło do wyraźnego obniżenia poziomu mRNA kodującego RP, ale nie wpływało na ich TE. Natomiast w doświadczeniach przeprowadzonych w nieobecności CHX mRNA tych genów ulegało regulacji zarówno na poziomie mRNA, jak i TE. Tak więc preinkubacja z CHX w podłożu może wpływać na TE określonych grup genów. Objętość mRNA kodującego RPs jest bardzo ściśle skoordynowana22,23,24; nasze wyniki pokazują, że te mRNA również wykazują skoordynowane zachowanie na poziomie wydajności translacyjnej. Przyczyna wyjątkowej wrażliwości tych mRNA na CHX pozostaje do wyjaśnienia.

Dla większości genów, chociaż, leczenie CHX nie ma wpływu na gęstość rybosomalną niezależnie od warunków wzrostu. Podobne wyniki zostały zgłoszone dla komórek ssaków hodowanych w kulturze, z CHX nie ma znaczącego wpływu na gęstości rybosomów specyficznych dla genów. Jednakże, zostało to zbadane tylko w komórkach niestresowanych13.

Zmiany w wykorzystaniu otwartych ramek odczytu w górę rzeki

Komórki S. cerevisiae wykazują nagromadzenie śladów rybosomów w 5′ sekwencjach wiodących, które jest zwiększone w warunkach stresu, sugerując wyższe wykorzystanie uORF1, 9, 10. Jednak wnioski te zostały zakwestionowane i przypisane użyciu CHX w hodowli komórkowej8.

Aby odpowiedzieć na to pytanie w S. pombe porównaliśmy akumulację odczytów w sekwencjach 5′ liderowych i kodujących (Fig. 2a) przed i po głodówce azotowej. Wstępnie określiliśmy tę wartość mierząc stosunek między całkowitą liczbą śladów rybosomów w 5′ liderach i w sekwencjach kodujących. Głodówka azotowa w komórkach traktowanych CHX spowodowała średni wzrost 5,5-krotny, podczas gdy komórki nieleczone miały 2,1-krotny średni wzrost (oba wzbogacenia były zgodne w replikacjach biologicznych, Fig. 2b). Ponieważ całkowite proporcje mogą być zdominowane przez zmiany w niewielkiej liczbie genów o wysokiej obfitości, określiliśmy również ilościowo proporcje między śladami w 5′ liderach i sekwencjach kodujących dla wszystkich pojedynczych transkryptów, które przeszły próg ekspresji (patrz Metody dla szczegółów, a Fig. 2c i Uzupełniające Fig. S3 dla wyników). Zgodnie z poprzednim wynikiem, nastąpił wyraźny wzrost śladów rybosomów w sekwencjach 5′ liderów po głodówce azotowej dla większości genów (Fig. 2c i Supplementary Fig. S3; zauważ, że wzrost w drugiej replikacji jest mniejszy, ale nadal znaczący), ze średnimi współczynnikami wzrostu 3,8 i 1,9 dla plus/minus CHX, odpowiednio (Fig. 2d, zauważ podobne zachowanie obu replik). Tak więc, w przeciwieństwie do wyników S. cerevisiae, gęstości rybosomalne 5′ lidera były zwiększone przez stres żywieniowy w każdym eksperymencie, chociaż efekt był znacznie wyższy w komórkach traktowanych CHX. Możliwe zastrzeżenie jest, oczywiście, że badanie S. cerevisiae używany inny rodzaj stresu8. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę, że pewna akumulacja jest obserwowana zarówno z jak i bez leczenia lekami, możemy stwierdzić, że w S. pombe głód azotowy prowadzi do wyższej gęstości rybosomalnej na 5′ sekwencji wiodących. Ten wzrost gęstości może być spowodowany translacją uORFs, chociaż nie możemy wykluczyć, że odzwierciedla on zwiększony szum w zestresowanych próbkach. Suplementarne Rys. S4 przedstawia dwa przykłady uORFs indukowanych w odpowiedzi na głód azotowy. Biologiczne znaczenie i mechanistyczne podstawy tego zjawiska (jak również to, czy jest ono ogólne dla wszystkich warunków stresowych) są nadal nieznane.

Wpływ CHX na gęstość rybosomów na 5′ sekwencjach wiodących. (a) Schemat eksperymentu: RPFs w sekwencjach kodujących (CDS) i 5′ sekwencjach wiodących są kwantyfikowane w różnych warunkach eksperymentalnych. (b) Stosunek całkowitych odczytów mapujących do sekwencji 5′ lidera do całkowitych odczytów mapujących do sekwencji kodujących (CDS) dla komórek niestresowanych (+N) i komórek głodzonych azotem (-N), oraz dla komórek traktowanych lub nietraktowanych CHX (±CHX). Liczby wskazują różnicę fałdową pomiędzy parami próbek -N i +N. Dane są przedstawione dla dwóch powtórzeń biologicznych. (c) Wykres rozrzutu porównujący stosunek odczytów mapujących do 5′ sekwencji wiodących do odczytów mapujących do sekwencji kodujących (CDS) dla poszczególnych genów; każdy wykres porównuje komórki niestresowane (+N) i komórki głodzone azotem (-N). Dane są prezentowane dla komórek traktowanych CHX (po lewej) lub nie traktowanych (po prawej). Czerwone linie odpowiadają stosunkowi 1. (d) Średnie wartości dla stosunków przedstawionych w (c). Liczby wskazują różnicę fałdową pomiędzy parami próbek -N i +N. Dane są wyświetlane dla dwóch replik biologicznych.

Dystrybucja rybosomów wzdłuż sekwencji kodujących

Komórki S. Komórki cerevisiae wykazują asymetryczną dystrybucję rybosomów wzdłuż sekwencji kodujących, z szerokim szczytem wyższej zajętości rybosomów w początkowych ~300-400 nukleotydach sekwencji kodującej1, 9, 14, 20, która jest silnie wzmocniona przez różne stresy1, 8, 12.

Badaliśmy to zjawisko w S. pombe na dwa sposoby: po pierwsze, obliczając stosunek między śladami w nukleotydach od 10 do 400 i od 401 do 800 (Fig. 3a-c, pierwsze 9 nukleotydów nie było brane pod uwagę, aby uniknąć uprzedzeń spowodowanych akumulacją rybosomów w inicjujących AUG); po drugie, badając zachowanie metagenu reprezentującego gęstość rybosomów w całym genomie wzdłuż sekwencji kodujących (Fig. 3d i Supplementary Fig. S5).

Efekty CHX na dystrybucję rybosomów w poprzek sekwencji kodujących. (a) Schemat eksperymentu: RPF na nukleotydach od 10 do 400 i na nukleotydach 401-800 są kwantyfikowane w różnych warunkach eksperymentalnych, a stosunek między obiema liczbami jest obliczany. (b) Średnie proporcje obliczone w sposób opisany w punkcie A dla wszystkich sekwencji kodujących, w obecności i braku źródła azotu (±N) oraz w obecności i braku traktowania CHX (±CHX). Liczby wskazują różnicę fałdową między sparowanymi próbkami -N i +N. Dane są przedstawione dla dwóch powtórzeń biologicznych. (c) Wykres rozrzutu porównujący proporcje uzyskane w sposób określony w punkcie A dla poszczególnych genów; każdy wykres porównuje komórki niestresowane (+N) i komórki głodzone azotem (-N). Dane są przedstawione dla komórek traktowanych CHX (po lewej) lub nie traktowanych (po prawej). Czerwone linie odpowiadają stosunkowi 1. (d) Metageny przedstawiające średnie rozkłady RPF wzdłuż sekwencji kodujących w czterech warunkach eksperymentalnych. Do wygładzenia wykreślonych linii użyto okna bieżącego o długości 60 nukleotydów.

W nieobecności stresu komórki S. pombe wykazywały małe ramiona zarówno w obecności, jak i bez leku, podobne do tych zgłaszanych dla S. cerevisiae bez CHX1, 14, 20 (Fig. 3d i Supplementary Fig. S5). W warunkach stresu żywieniowego S. pombe zachowywał się podobnie jak S. cerevisiae 12. W obecności CHX nastąpiło wyraźne nagromadzenie odczytów w części 5′ sekwencji kodującej w większości genów (Rys. 3c i Supplementary Fig. S5, lewy wykres), co znalazło również odzwierciedlenie w ~2,0-krotnym wzroście średniej gęstości w pierwszych 400 nukleotydach mRNA (Rys. 3b). Dla kontrastu, wzrost ten był nieistotny w nieobecności leku, zarówno gdy badano poszczególne geny (Fig. 3c (prawy wykres) i Supplementary Fig. S5), jak i gdy mierzono średnie proporcje (Fig. 3b, zauważ, że oba repliki zachowywały się konsekwentnie). Co więcej, zależność CHX od akumulacji odczytów po głodówce azotowej została potwierdzona przez dane metagenowe (Fig. 3d i Supplementary Fig. S5). Wreszcie, ustaliliśmy, że efekt ten był specyficzny dla RPF, poprzez wykreślenie metagenu opartego na danych mRNA-seq (Supplementary Fig. S5).

Rozważaliśmy również, czy te obserwacje odnoszą się również do mniejszych genów. W tym celu wygenerowaliśmy metageny dla genów RP oraz dla małych genów (mniej niż 200 kodonów) z wyłączeniem genów RP. W obu przypadkach CHX spowodował wyraźny wzrost po stronie 5′ sekwencji kodujących (szczególnie dla genów RP), który był zależny zarówno od głodzenia azotem, jak i od traktowania CHX (Supplementary Fig. S5).

W dodatku nastąpiła akumulacja rybosomów na kodonach inicjacyjnych (Supplementary Fig. S6). Ta cecha była już obecna w komórkach nieleczonych, chociaż była podwyższona z inkubacją CHX (zarówno w komórkach kontrolnych, jak i w komórkach poddanych głodówce azotowej). Wzbogacenie to było nieco wyższe w komórkach pozbawionych azotu, niezależnie od traktowania CHX (Supplementary Fig. S6).

Więc, istnieje wyraźne nagromadzenie rybosomów w początkowej części sekwencji kodujących, konserwowanych w S. pombe i S. cerevisiae, i które można zaobserwować zarówno z jak i bez traktowania CHX. Natomiast wzmocnienie indukowane stresem nie jest obserwowane konsekwentnie w nieobecności CHX w obu drożdżach, a zatem nie ma wystarczających dowodów, aby wskazać, że występuje ono in vivo. W przyszłości wykorzystanie strategii sieciowania in vivo25 może pomóc w rozróżnieniu tych dwóch interpretacji.

Obłożenie kodonów

Zasadniczo, znormalizowane rybosomalne obłożenie poszczególnych kodonów jest związane z czasem, jaki rybosom spędza przy każdym kodonie, a zatem może być wykorzystane do oszacowania średniej szybkości translacji specyficznej dla kodonu. Jednakże pierwsze eksperymenty mające na celu zbadanie tego zjawiska przyniosły sprzeczne wyniki17,18,19,20. Eleganckie badanie przeprowadzone przez Hussmann i wsp., które obejmowało nowe eksperymenty, metaanalizę licznych eksperymentów profilowania rybosomów z S. cerevisiae i modelowanie matematyczne9, wykazało, że te sprzeczności można wyjaśnić wpływem CHX na określanie specyficznych dla kodonów zajętości rybosomów. Eksperymenty z różnych grup przeprowadzone w obecności CHX miały podobne do siebie zajętości kodonów rybosomów, podobnie jak te przeprowadzone bez leku. Jednak korelacje pomiędzy eksperymentami z CHX i bez CHX były bardzo niskie. Co więcej, eksperymenty z CHX skutkowały specyficznymi dla kodonów wskaźnikami translacji, które wykazywały ujemne korelacje z obfitością poznawczego tRNA, podczas gdy te, które nie obejmowały leczenia CHX, wykazywały oczekiwane korelacje dodatnie9, 20. Hussmann i wsp. zaproponowali, że rybosomy nie zatrzymują translacji natychmiast w obecności CHX w podłożu. Zamiast tego translacja jest kontynuowana dla kilku kodonów z szybkością translacji specyficzną dla kodonu9, powodując artefaktowe zajętości kodonów.

Aby zbadać to zjawisko, przeanalizowaliśmy specyficzne dla kodonu rybosomalne zajętości w miejscach A, jak opisano w Metody. W skrócie, przypisaliśmy każdy odczyt, który mapował do sekwencji kodującej do miejsca A rybosomu (co odpowiada nukleotydowi 16 fragmentu chronionego przez rybosom). Następnie obliczyliśmy znormalizowane obłożenie dla każdego kodonu w całym genomie (dzieląc częstotliwość, z jaką rybosom jest pozycjonowany na każdym kodonie, przez obfitość kodonu w mRNA). Przy braku uprzedzeń, wartość ta powinna odzwierciedlać średni czas, jaki rybosom spędza przy każdym kodonie.

Pierw porównaliśmy wpływ CHX na specyficzne dla kodonu rybosomalne okupacje (Fig. 4, Supplementary Figs S7 i S8). Zaskakująco, korelacja między oboma eksperymentami była bardzo wysoka, ze średnimi wartościami 0,82 dla głodu azotowego (Fig. 4a i Supplementary Fig. S7) i 0,86 dla komórek niestresowanych (Fig. 4b i Supplementary Fig. S7). W podobnych porównaniach w S. cerevisiae, większość korelacji była ujemna9. Na przykład, rzadkie kodony takie jak CCG (prolina) i CGG (arginina) miały jedne z najwyższych zajętości w nieobecności CHX, ale straciły to wzbogacenie w próbkach poddanych działaniu CHX9. Natomiast w zbiorze danych S. pombe zarówno CCG, jak i CGG były wzbogacone niezależnie od obecności CHX (choć mniej silnie w komórkach nietraktowanych CHX, Rys. 4c i Supplementary Fig. S7). Co więcej, stres żywieniowy miał bardzo mały wpływ na specyficzne dla kodonów zajętości rybosomalne zarówno w obecności (Rys. 4c i Supplementary Fig. S7, średnie R = 0,96), jak i w nieobecności CHX (Rys. 4d i Supplementary Fig. S7, średnia R = 0,98).

Wpływ CHX na względną zajętość kodonów. Wykresy rozrzutu przedstawiające względne zajętości kodonów uzyskane zgodnie z opisem w Metodach. Każda kropka odpowiada pojedynczemu kodonowi. Kodony terminacji nie są wyświetlane. Zaznaczone są pozycje rzadkich kodonów CCG i CGG. Linie przerywane odpowiadają 1,5-krotnym różnicom. Korelacje Pearsona pomiędzy zestawami danych są zaznaczone. (a) Porównanie efektów traktowania CHX w komórkach pozbawionych azotu. (b) Jak w (a), dla komórek hodowanych ze źródłem azotu. (c) Porównanie efektów głodzenia azotem w obecności CHX. (d) Jak w (c), w nieobecności CHX.

W końcu oceniliśmy korelację między obfitością tRNA a zajętością specyficzną dla kodonów. W tym celu posłużono się wskaźnikiem adaptacji tRNA (tAI), który jest miarą wykorzystania tRNA dla każdego kodonu, częściowo opartą na liczbie kopii tRNA (wyższe liczby przewidują bardziej wydajną translację)26. Eksperymenty S. cerevisiae przeprowadzone w obecności CHX w hodowli wykazują ujemne korelacje pomiędzy odwrotnością tAI (1/tAI) a zajętością specyficznych kodonów, przewidując, że kodony o niskim tAI (a tym samym niskie obfitości tRNA) będą tłumaczone szybciej. Dla kontrastu, eksperymenty z komórkami nie traktowanymi CHX wykazały oczekiwaną dodatnią korelację między 1/tAI (chociaż rzeczywiste wartości były bardzo zmienne w poszczególnych eksperymentach)9. W S. pombe stwierdziliśmy, że w każdym z ośmiu eksperymentów profilowania rybosomów zajętość specyficznych kodonów wykazywała dodatnią korelację z 1/tAI, ze średnią 0,39 (Tabela 2).

Nasze wyniki pokazują, że w S. pombe CHX ma stosunkowo niewielki wpływ na pozycję rybosomów na specyficznych kodonach. Można to wyjaśnić tym, że komórki S. pombe są szczególnie wrażliwe na CHX, przez co CHX blokowałby ruch rybosomów szybciej i całkowicie niż w S. cerevisiae. Ta właściwość zapobiegałaby przemieszczaniu się rybosomów w zmienionym tempie (postuluje się, że ma to miejsce w S. cerevisiae) i prowadziłaby do sytuacji, w której komórki S. pombe traktowane CHX i nietraktowane CHX miałyby podobne rozmieszczenie rybosomów w stanie ustalonym. Jednakże fakt, że rzadkie kodony są mniej wzbogacone w obecności CHX sugeruje, że CHX powinien być pominięty w eksperymentach mających na celu określenie dystrybucji rybosomów specyficznych dla kodonów.

.