Mutaties in FLNB veroorzaken boemerangdysplasie | Journal of Medical Genetics

Boemerangdysplasie (OMIM #112310) is een dodelijke skeletdysplasie die wordt gekenmerkt door een ongeorganiseerde botvervorming van het skelet.1 Kenmerkende radiologische bevindingen zijn onregelmatige ossificatie van de beenderen van de ledematen en de wervels, onderontwikkeling van het acetabulum, en hypoplastische, boemerangvormige femora waaraan de aandoening haar naam ontleent.1 Tot op heden zijn er ten minste acht gevallen beschreven in de literatuur.1-8 Een vergelijkbare dodelijke skeletdysplasie, Piepkorn-dysplasie,9 is voorgesteld om allelisch te zijn aan boemerangdysplasie.2,7 Kraakbeenhistologie toont zowel gedesorganiseerde kraakbeenanlagen van het zich ontwikkelende lange bot als frequente gemultinucleerde chondrocyten in de reservezone van de groeischijf.1 Andere ontwikkelingsafwijkingen buiten het skelet zijn beschreven, waaronder omphalocele en encephalocele.

Gelijkenissen in de radiografische en histologische bevindingen van boemerangdysplasie en atelosteogenese I (AOI; OMIM #108720) en III (AOIII; OMIM #108721) hebben allelisme voor deze aandoeningen gesuggereerd.2,10 Bij alle drie de entiteiten omvatten de radiografische bevindingen een gebrekkige en onregelmatige ossificatie van botten en wervellichamen met distale humerale hypoplasie en gewrichtsdislocaties, naast craniofaciale afwijkingen.11 Bovendien werden zowel bij AOI als bij boemerangdysplasie multinucleaire chondrocyten waargenomen. Boemerang dysplasie onderscheidt zich van AO op basis van een ernstiger defect in mineralisatie, met volledige afwezigheid van ossificatie in sommige ledematen en wervelsegmenten.3 Een overwicht van mannen onder de gerapporteerde gevallen van boemerang dysplasie7 en enkele fenotypische gelijkenissen met het otopalatodigitaal syndroom spectrum aandoeningen veroorzaakt door mutaties in het FLNA-gen12,13 suggereerden een X-gekoppelde etiologie voor sommige auteurs.7

Recentelijk hebben wij de associatie beschreven van mutaties in het gen dat codeert voor het 280 kDa cytoskeletaal eiwit filamine B met verschillende aandoeningen die worden gekenmerkt door skeletafwijkingen en gewrichtsdislocaties.14 Filamine B is een modulair eiwit. Een actine bindend domein bestaande uit twee calponine homologie domeinen (CH1 en CH2) bevindt zich aan de amino terminus, gevolgd door een rod domein bestaande uit 24 structureel homologe herhalingen en eindigend in een carboxyterminaal dimerisatie domein.15 Het actine bindende domein in filamine B is vergelijkbaar met die gevonden in andere cytoskeletale eiwitten, zoals β-spectrine, dystrofine, en α-actinine-4.

Vier verschillende aandoeningen zijn toegeschreven aan mutaties in FLNB: AOI, AOIII, recessief overgeërfd spondylcarpotarsaal syndroom (OMIM #272460), en een dominante vorm van het Larsen syndroom (OMIM #150250). Individuen met AOI, AOIII, en dominant overervend Larsen syndroom bleken heterozygoot te zijn voor missense mutaties in FLNB.14 De meerderheid van de mutaties die leiden tot AOI of AOIII leiden tot substituties gelokaliseerd in het CH2 domein van het actine bindende domein van filamine B. De enige uitzondering is de mutatie 2251G→C, gelokaliseerd in exon 15, waarvan voorspeld wordt dat die leidt tot de substitutie G751R in repeat 6, gevonden bij een individu met AOIII.14 Tijdens het werk dat de groep van aandoeningen als gevolg van mutaties in FLNB identificeerde, werd één individu met boemerangdysplasie beoordeeld op mutaties door directe sequencing, maar er werd geen mutatie geïdentificeerd.14

Gezien het radiografische, fenotypische en histologische bewijs dat suggereert dat boemerangdysplasie gerelateerd is aan aandoeningen veroorzaakt door mutaties in genen die coderen voor filaminen, onderzochten we twee individuen met boemerangdysplasie op mutaties in FLNA en FLNB met behulp van denaturerende hoge prestatie vloeistofchromatografie (DHPLC) analyse als de screeningstechniek.

Individu 1 was het geval dat eerder werd onderzocht door directe sequencing. Deze mannelijke foetus was het eerste kind van niet-consanguine, gezonde ouders. Echoscopie in het tweede trimester toonde hypoplasie van de borstkas en duidelijke verkorting van alle ledematen met onregelmatige ossificatie van meerdere skeletelementen. De foetus werd bij 22 weken zwangerschap ter wereld gebracht. Post-mortem analyse toonde een duidelijke thoracale hypoplasie, korte ledematen, en de karakteristieke gezichtsdysmorfie geassocieerd met boemerang dysplasie. Er was geen encephalocoele of omphalocoele aanwezig. De radiografische bevindingen waren typisch voor boemerang dysplasie (fig 1).

Individu 2 was een foetus van 17 weken zwangerschap, eerder gedetailleerd gerapporteerd door Wessels et al.8 Deze foetus vertoonde ernstige micromelia waarbij twee van de drie lange tubulaire beenderen in alle vier de ledematen ontbraken. Bij radiografisch onderzoek waren de resterende radii boemerangvormig, de tibiae segmentvormig, de wervelkolom slecht verbeend, en de thorax hypoplastisch. Histologisch was de kraakbeenmatrix hypocellulair met multinucleaire reusachtige chondrocyten.

De coderende regio’s en intron-exon splice junctions van zowel FLNA als FLNB werden geamplificeerd van genomisch DNA verkregen uit beide gevallen met behulp van intronic primers die eerder zijn beschreven13,14 (reactievoorwaarden en primer-sequenties zijn beschikbaar op aanvraag). Voor de analyse van FLNA werden de ampliconproducten gevisualiseerd met agarosegelelektroforese en vervolgens gemengd met gelijke hoeveelheden PCR-geamplificeerde producten van een niet-verwante gezonde mannelijke controle vóór heteroduplexvorming. De monsters werden onderworpen aan DHPLC op een WAVE DNA-fragmentanalysesysteem (Transgenomic Inc.) volgens de instructies van de fabrikant. Amplicons die afwijkende spoorvormen vertoonden, werden opnieuw gemampliceerd en met een ABI 3100 sequencer in een cyclus gesequeneerd. Geïdentificeerde mutaties werden bevestigd door restrictie-enzym digestie van geamplificeerd DNA, en de afstamming werd bevestigd zoals opgegeven voor geval 1 door segregatie van zes niet-gekoppelde microsatellietmerkers. Voor geval 2 waren geen ouderlijke monsters beschikbaar. Deze studie werd goedgekeurd door het ethisch comité van Otago.

Bij onderzoek van FLNB (exonen 1-46) werden bij beide personen mutaties gevonden. In geval 1 bleek het individu heterozygoot te zijn voor de mutatie 512T→G, die naar verwachting leidt tot de substitutie L171R. Deze mutatie creëert een plaats voor het restrictie-enzym HpaII, waardoor kon worden aangetoond dat de mutatie de novo in deze familie was ontstaan (fig. 2), hetgeen genetisch bewijs voor pathogeniteit opleverde. Achteraf gezien was deze mutatie wel aanwezig in de oorspronkelijke analyse, maar werd ze over het hoofd gezien. De tweede mutatie, 703T→C, werd gevonden in exon 4 in case 2, en voorspelt de substitutie S235P (fig 2). Ouderlijke monsters waren niet beschikbaar, maar deze mutatie was niet aanwezig in 100 controlechromosomen. Van beide mutaties wordt voorspeld dat ze residuen wijzigen binnen de CH2 regio van het actine bindend domein van filamine B. Deze residuen zijn sterk evolutionair geconserveerd onder vertebraten filaminen (fig 3). De mutaties suggereren dat deze aminozuren een kritische rol spelen in de actine bindende domein functie. Voor de 703T→C mutatie is dezelfde substitutie waargenomen in het analoge residu in ACTN4, een gen dat codeert voor het cytoskeletadapter-eiwit α-actinine-4 (fig 3), bij een patiënt met focale en segmentale glomerulosclerose.16

Ziekte-geassocieerde substituties binnen het actine bindende domein van filamin B leiden tot een diversiteit aan fenotypes. Eerder rapporteerden wij al substituties die leiden tot AOI (n = 3), AOIII (n = 1), en Larsen syndroom (n = 2).14 Al deze fenotypes zijn geassocieerd met defecten in skeletogenese en gewrichtsvorming. De identificatie van mutaties die leiden tot substituties binnen het actine bindende domein van filamine B bij twee patiënten met boemerang dysplasie bevestigt dat deze aandoening allelisch is aan deze aandoeningen, wat eerdere klinische vermoedens van verwantschap weerspiegelt.2,3

Een deel van de mutaties die het otopalatodigitale spectrum van skeletaandoeningen veroorzaken, ligt binnen de analoge CH2 regio in FLNA. Ook deze mutaties leiden tot een breed spectrum van fenotypische ernst.13 Er is geen eenvoudige correlatie tussen de plaats van deze mutaties en de ernst van de resulterende defecten in de skeletale ossificatie. Hoewel het otopalatodigitaal syndroom type 1 zich milder manifesteert dan het otopalatodigitaal syndroom type 2, kunnen deze aandoeningen het gevolg zijn van substituties op residuen in elkaars nabijheid of zelfs op hetzelfde residu.13,17 De waarneming dat mutaties in het actine bindende domein van FLNB ook tot een breed spectrum van ernst kunnen leiden, recapituleert dit patroon. De substitutie die voorspeld wordt door de mutatie gevonden in individu 1, L171R, ligt in de nabijheid van de plaats van een substitutie (A173V), oorzakelijk voor AOI.14 Evenzo ligt de hier gerapporteerde S235P substitutie binnen dezelfde eiwitplooi als E227K, een substitutie geassocieerd met het minder ernstige, niet-dodelijke fenotype, het Larsen syndroom.14 Ondanks meldingen van ziekte-geassocieerde substituties in residuen binnen het CH2 van het actine bindende domein van dystrofine, α-actinine-4,17 filamine A,13 en filamine B,14 is een functionele rol voor deze eiwitvouw nog niet definitief opgehelderd. Aangezien CH2-domeinen op zichzelf geen aangeboren actinebindende eigenschappen bezitten, is gesteld dat de rol van de CH2 in actinebinding in het beste geval een indirecte is.18

Filaminen werken primair om actine in de cel te stabiliseren, hetzij als parallelle bundels of orthogonale gelnetwerken.19,20 Er zijn meerdere bindingspartners geïdentificeerd voor filamine A, waarvan de overgrote meerderheid associeert via filaminerepeat 16-24 (besproken in Stossel et al21). Er is aangetoond dat vijf bindingspartners associëren met filamine B: actine, FBLP-1,22 preseniline (PS1 en PS2),23 en GPIβα.24 Het valt nog te bezien of mutaties binnen de actine bindende domeinen van filaminen A en B hun pathogene effect voornamelijk uitoefenen door actine binding te verstoren of door een functionele afhankelijkheid tussen actine associatie en bindende interacties met andere eiwitten.

Gemultinucleate reuzecellen worden gevonden onder chondrocyten in de groeiplaat van individuen met boemerang dysplasie. Deze verschijnselen zouden het gevolg kunnen zijn van een defecte celsplitsing tijdens de proliferatie van chondrocyten in de epifysaire groeiplaat. Eerder toonden we een wijdverspreide expressie van FLNB aan in de groeiplaat en vooral in de splijtingsgroef van delende chondrocyten.14 Het proces van veranderde celsplitsing leidend tot zowel de defecte skelet patroonvorming als mineralisatie in de boemerang dysplasie/atelosteogenese groep van aandoeningen moet nog worden opgehelderd.

De identificatie van mutaties die boemerang dysplasie veroorzaken in FLNB bevestigt boemerang dysplasie als onderdeel van het chondrodysplasie spectrum met inbegrip van AOI en III, en niet-letale Larsen syndroom. Fenotypische overlap tussen boemerang dysplasie en AO, zoals hier en eerder gerapporteerd, en de colokalisatie van mutaties die ten grondslag liggen aan deze ziekten in exonen die coderen voor het actine bindend domein van FLNB is indicatief voor een klinisch-pathologisch spectrum voor deze aandoeningen. Deze verdere verbreding van het fenotypische spectrum geassocieerd met mutaties in FLNB benadrukt het belang van een functioneel actine cytoskelet voor vele normale morfogenetische processen, waaronder skeletogenese.