ENU

Cilia in Vertebrate Cell-Cell Signaling

In 2003 bleek uit een ENU-mutagenesescreen onverwacht dat primaire cilia en IFT betrokken zijn bij Shh-signalering: IFT mutaties in muizen resulteerden in neurale buis en ledemaatknop patroon fenotypen vergelijkbaar met die welke het gevolg zijn van Shh pathway verstoring (Huangfu et al., 2003). Primaire cilia zijn niet-motiele, op microtubuli gebaseerde organellen die uit de meeste gewervelde cellen steken. Ze strekken zich uit vanuit basale lichamen, en bestaan uit gespecialiseerde membranen (structureel gescheiden van het plasmamembraan) rond een centraal axonem waarlangs IFT machinerie retrograde en anterograde transport faciliteert tussen de ciliaire basis en tip. Verstoring van ciliogenese of IFT resulteert in een breed spectrum van menselijke ciliopathie syndromen. Tot de primaire ciliaire afwijkingen behoren polydactylie, craniofaciale en hersenafwijkingen, situs inversus, polycysteuze nierziekte, obesitas, diabetes, en subtiele afwijkingen in de lever, milt en hart (Nigg en Raff, 2009; Goetz en Anderson, 2010; Hildebrandt et al,

Ciliogenese en de demontage van primaire cilia zijn nauw gekoppeld aan de celcyclus machinerie: primaire cilia zijn aanwezig op rustende cellen, maar hun demontage is nodig voor overgang naar de celcyclus. Fgf en Wnt signalering zijn stroomopwaarts van ciliogenese nodig in verschillende vertebraten, waaronder de knoop/Kupffers blaasje (KV), otische blaasjes, en pronephric ducts (Basu en Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Transcriptionele doelwitten van deze signaalwegen die de vorming, het patroon of de functie van cilia bemiddelen zijn onder andere Ift88, Enc1-like, en de ciliogene TFs Foxj1 en Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Epistase experimenten die KV bestuderen hebben gesuggereerd dat Wnt signalering stroomafwaarts van Fgfs functioneert in ciliogenese (Caron et al., 2012).

In vertebraten gebruikt de Shh pathway cilia als een gespecialiseerde signalerende organel waarin IFT veranderingen in eiwitlokalisatie medieert die essentieel zijn voor Gli verwerking en resulterende transcriptionele reacties (figuur 1.1B). De Hh-receptor Patched (Ptc) bevindt zich aan de basis van het primaire cilium in afwezigheid van Hh. In aanwezigheid van Hh verlaat Ptc het cilium en komt Smo binnen, en is er een toename van tip-gelokaliseerde Gli. Gli-Sufu complexen zijn verrijkt in de tips van primaire cilia op een Smo-afhankelijke manier en moeten worden gedissocieerd voor activatie van de Shh pathway (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, waarvan het ortholoog Ci/Gli processing bevordert en Sufu antagoniseert in Drosophila, ondergaat Hh-geïnduceerd anterograde transport van de cilium basis naar de tip. PKA, dat Gli fosforyleert als voorwaarde voor proteolyse tot GliR, lokaliseert aan de basis van primaire cilia en reguleert het niveau van tipgelokaliseerde Gli (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studies naar Shh en cilia/IFT hebben aangetoond dat sommige menselijke ciliopathieën waarschijnlijk het gevolg zijn van een verstoorde Shh signalering. Bovendien kunnen ciliaire defecten oncogenese versterken of onderdrukken als gevolg van Shh pathway mutaties (Han et al., 2009). Cilia/IFT mutanten lijken vaak op LOF of GOF Shh mutanten vanwege context-specifieke vereisten voor ciliair-gemedieerde verwerking van Gli tot GliA of GliR, respectievelijk. Kenmerkende fenotypen zijn ventralisatie van de neurale buis (die GliR gebruikt) en polydactylie (ledematen gebruiken GliA; besproken in Goetz en Anderson, 2010). Mutaties in IFT en ciliopathie genen hebben geholpen om nieuwe contexten te identificeren waarin cilia nodig zijn voor de ontwikkeling van celsignalering. In sommige gevallen hebben deze experimenten licht geworpen op de etiologie van slecht begrepen menselijke ciliopathie kenmerken. Studies van Rpgrip11 (een humaan ciliopathiegen) en Ttc21b mutante muizen toonden bijvoorbeeld het belang aan van primaire cilia in het mediëren van Shh signalen in de ventrale voorhersenen. Ttc21b mutanten hebben abnormale primaire cilia met gedeeltelijk defect retrograde transport maar functioneel anterograde transport. Dit resulteert in een GOF fenotype zoals blijkt uit accumulatie van Shh signaal machines in cilia tips en uitbreiding van Shh expressie/activiteit in het ventrale telencephalon en zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Rpgrip1l mutanten hebben voorhersenen neuroepitheliale cellen die primaire cilia missen en die deficiënt zijn in de productie van verwerkte Gli, zoals verwacht voor Shh LOF (Besse et al., 2011). Deze mutaties resulteren beide in uitbreiding van het subpallium ten koste van het pallium, vergelijkbaar met Gli3 mutanten, omdat de overheersende output van Shh signalering in de ventrale voorhersenen de verwerking van Gli3 tot zijn repressor vorm is (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Als actief Gli3R eiwit genetisch wordt ingebracht, dan zijn cilia in deze context overbodig (Besse et al., 2011). Defecten in de ventrale voorhersenen kunnen ten grondslag liggen aan cognitieve stoornissen in sommige ciliopathieën.

Sh-gerelateerde defecten zijn niet verantwoordelijk voor alle fenotypen in menselijke ciliopathieën. Het is duidelijk geworden dat IFT/cilia in sommige contexten worden gebruikt om signalering door andere pathways te vergemakkelijken. Tijdens de ontwikkeling van de zoogdierhuid, primaire cilia zijn essentieel voor terminale differentiatie van suprabasale cellen, een proces geïnitieerd door Notch / Delta signalering (figuur 1F; Blanpain et al., 2006). In ∼60-70% van de suprabasale cellen, is Notch geconcentreerd in primaire ciliaire membranen, en presenilin, een eiwit in het γ-secretase complex dat Notch klieft, is gelokaliseerd in basale lichamen (Ezratty et al., 2011). Het afbreken van IFT genen of het verwijderen van cilia in vivo resulteert in verminderde Notch reporter activiteit en verminderde suprabasale celdifferentiatie. Bovendien werd NICD, de actieve gekloofde vorm van Notch, waargenomen in de kernen van gecilieerde maar niet ongecilieerde cellen in genetische chimaeren (Ezratty et al., 2011).

Cilia zijn ook betrokken bij PDGF signalering. In gekweekte fibroblasten is PDGFRα waargenomen in primaire ciliaire membranen, en de RTK-geactiveerde signaaltransductie-eiwitten MEK1/2 en Akt zijn gelokaliseerd langs het cilium en aan de ciliaire basis, respectievelijk (Schneider et al., 2005). Studies van wild type en Ift88 mutant (geen primaire cilia) fibroblasten toonden aan dat primaire cilia van leidende cellen zich oriënteren naar de plaats van de wond en nodig zijn voor PDGF-AA-geïnduceerde chemotaxis en fosfo-Akt reacties in vitro (Schneider et al., 2010). Met name Ift88 mutante muizen vertonen defecten in wondherstel (Schneider et al., 2010). PDGF signalering via PDGFRα is ook betrokken bij cilia demontage en de G1-S fase overgang (besproken in Christensen et al., 2012), hoewel de in vivo betekenis van deze observatie nog niet bekend is.

De rol van cilia in canonieke Wnt signalering is controversieel geweest (besproken in Wallingford en Mitchell, 2011). Studies van Ift88 en Ift72 gemuteerde muizen en zebravissen suggereerden dat cilia niet essentieel zijn voor Wnt signalering tijdens embryogenese, en studies van Wnt signalering in Kif3a gemuteerde muizen leverden tegenstrijdige resultaten op (Huang en Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). In retrograde IFT mutanten rapporteerde één groep geen verandering in Wnt signalering, terwijl een andere groep een afname in Wnt activiteit liet zien in contexten waarin cilia behouden blijven, maar een toename in Wnt signalering in contexten waarin cilia verloren gaan (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Studies van de ciliary/ciliopathie eiwitten Inversin, Chibby, en Jouberin ondersteunen de rol van cilia in canonieke Wnt signalering in specifieke ontwikkelingscontexten. Inversin, dat gemuteerd is in menselijke patiënten met nefronophthisis type II, komt tot expressie in vertebraten monocilia, interageert fysiek met Disheveled (Dsh), en verstoort canonieke Wnt signalering stroomafwaarts van Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Inversinemutante muizen vertonen nier- en haarpatroonfenotypes die doen denken aan Wnt/Frz fenotypes, alsook links-rechtspatroonfenotypes die waarschijnlijk te wijten zijn aan defecten in de knoopmonocilia functie (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, een basaal lichaam eiwit dat nodig is voor ciliogenese en het vasthechten van het basale lichaam, interageert fysiek met β-catenine en reguleert op negatieve wijze canonieke Wnt signalering in Drosophila embryo’s, zoogdier long epithelia, en gekweekte zoogdiercellen (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Tenslotte is het menselijke ciliopathie eiwit Jouberin in muizen nodig voor normale Wnt signalering en proliferatie op de cerebellaire middellijn. Dit draagt waarschijnlijk bij aan de cerebellaire hemisfeer fusie defect waargenomen in de menselijke Joubert syndroom patiënten en Jouberin deficiënte muizen (Lancaster et al., 2011a). In gecilieerde cellen die blootgesteld worden aan Wnt, wordt Jouberine samen met β-catenine afgezonderd in basale lichaampjes op een IFT-afhankelijke manier. Jouberine faciliteert nucleaire translocatie van β-catenine; zijn sequestratie in de basale lichamen verhindert nucleaire translocatie van β-catenine en dempt canonieke Wnt signaalresponsen (Lancaster et al., 2011b). Samen suggereren deze bevindingen dat cilia niet globaal nodig zijn voor Wnt signalering tijdens embryogenese, maar wel invloed hebben op Wnt signaleringsresultaten in selecte contexten.

De hypothese is dat cilia een gespecialiseerde sensorische structuur vormen waarbinnen meerdere soorten signalen worden gecoördineerd. Een alternatief model is dat cilia pathway-specificiteit vertonen (net als cytonemes, hieronder besproken) en daardoor cellulaire responsiviteit beperken en/of signaalresponsen ruimtelijk segregeren. Pathway-specificiteit van ciliaire signalering kan worden gemedieerd door differentiële targeting van signaleringseiwitten naar cilia, en/of gebruik van verschillende subsets van IFT-eiwitten of lading-specifieke adaptors voor axonem transport (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).