Effecten van cycloheximide op de interpretatie van ribosoom profileringsexperimenten in Schizosaccharomyces pombe

Experimenteel design en reproduceerbaarheid

Om de effecten van CHX op ribosoom profileringsexperimenten te onderzoeken, pasten we deze techniek toe op S. pombe cellen die exponentieel groeien (niet gestresst) en na 1 uur van stikstofsterfte (voedingsstress). Elke cultuur werd in tweeën gesplitst, en één ervan werd geïncubeerd met CHX in een concentratie van 100 µg/ml gedurende 5 minuten voor het verzamelen (dit is de ‘standaard’-concentratie gebruikt in de meeste gepubliceerde experimenten). De cellen werden verzameld door filtratie en onmiddellijk flash-drozen in vloeibare stikstof om verdere vertaling te voorkomen. Merk op dat CHX aanwezig was in de lysisbuffers voor alle monsters. Dus, alle verwijzingen naar CHX behandeling hieronder alleen van toepassing op de toevoeging aan het kweekmedium. We voerden twee onafhankelijke biologische repliceert voor elk van de vier experimenten (plus / min stikstof, plus / min CHX). Voor elk monster hebben we bereid en geïsoleerd ribosoom beschermde fragmenten (RPF’s of ribosoom voetafdrukken) zoals beschreven in Methodes, en analyseerde ze met behulp van high throughput Illumina sequencing. We hebben ook gesequeneerd rRNA-verwijderd RNA van elk van de acht monsters (RNA-seq). Om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren hebben we gekwantificeerd voor elk experiment het aantal RPF en RNA-seq leest dat gemapt aan elke geannoteerde coderende sequentie van het S. pombe genoom. De gegevens waren zeer reproduceerbaar, met gemiddelde correlaties tussen onafhankelijke biologische replicaten van 0,97 (tabel 1). We richten ons hieronder op hoe CHX ribosoom profilering experimenten beïnvloedt. Een meer volledige analyse van de biologie van de reactie van S. pombe cellen op stikstofsterfte zal elders worden gepubliceerd.

Om de effecten van CHX te onderzoeken onderzochten we vier aspecten van translatie: 1] totale ribosomale dichtheid voor coderende sequenties van individuele genen, 2] aanwezigheid van ribosomen op 5′ leader sequenties, 3] biases in ribosoom locatie over coderende sequenties en 4] distributie van ribosomen langs individuele codons.

Ribosoom dichtheid

We gekwantificeerd het aantal RPF leest op coderende sequenties voor elke geannoteerde gen in cellen behandeld met CHX of mock-behandeld. Onder stikstof-stervatie omstandigheden de correlatie tussen beide behandelingen was zeer hoog (gemiddelde R = 0,96), maar ~ 4,5% van alle genen vertoonden consistent hogere ribosomale dichtheid in de aanwezigheid van CHX (2-voudig of hoger in beide replicaten, Fig. 1a en Supplementary Fig. S1). Vergelijkbare veranderingen werden niet waargenomen in mRNA-monsters (gemiddelde R = 0,98), wat aangeeft dat dit effect het gevolg was van veranderingen in translatie en niet in het transcriptoom (Fig. 1a, Supplementary Fig. S1).

Effecten van CHX op de totale ribosoomdichtheid op coderende sequenties. (a) Spreidingsdiagrammen met vergelijking van mRNA-niveaus (boven) en ribosoomdichtheden (onder) tussen onbehandelde en met CHX behandelde cellen. Gegevens worden gepresenteerd voor cellen die groeien in de aanwezigheid van een stikstofbron (+N) of verhongerd voor stikstof (-N). Genen die coderen voor ribosomale eiwitten worden in groen weergegeven. Alle gegevens zijn genormaliseerd naar RPKMs (Reads Per Kilobase per Million mapped reads). (b) Links: Boxplots vergelijken ribosomale dichtheden tussen onbehandelde en CHX-behandelde cellen voor groepen van genen met de aangegeven gemiddelde lengte van de coderende sequenties. Rechts: soortgelijke gegevens voor aangegeven lengtes van 5′ leader sequenties. De rode vakken tonen het gedrag van mRNA’s die coderen voor ribosomale eiwitten. (c) Vergelijking van de veranderingen in mRNA-niveaus en ribosomale dichtheden tussen cellen met een stikstofgebrek (-N) en ongestresste cellen (+N). De gegevens worden gepresenteerd voor met CHX behandelde cellen (links) en voor onbehandelde cellen (links). Genen die coderen voor ribosomale eiwitten worden in groen weergegeven.

Verrassend genoeg omvatte deze groep de meeste genen die coderen voor ribosomale eiwitten (RP’s, Fig. 1a en supplementaire Fig. S1, groene stippen). Om de mogelijkheid uit te sluiten dat CHX subtiele veranderingen in mRNA-niveaus veroorzaakt, vergeleken we de veranderingen geïnduceerd door stikstofverhongering in de aanwezigheid of afwezigheid van CHX (supplementaire Fig. S2). De mediane vouwverandering in mRNA-niveaus voor RP-genen was 0,25 in met CHX behandelde monsters en 0,24 in onbehandelde cellen, wat bevestigt dat veranderingen in ribosomale dichtheid van RP-genen bij stikstofstervatie te wijten zijn aan veranderingen in translatie.

RP-genen zijn over het algemeen vrij kort, met een mediane lengte van 447 nucleotiden in vergelijking met 1.131 voor alle genen. Daarom zou een eenvoudige verklaring voor deze verrijking kunnen zijn dat CHX ribosoom ‘run-off’ van korte genen voorkomt tijdens celverzameling, waardoor hun schijnbare ribosoomdichtheid toeneemt. Hoewel er een kleine tendens was dat de ribosoomdichtheid in kortere genen hoger was in aanwezigheid van CHX, was dit een gering effect en kon dit het gedrag van ribosomale eiwitgenen niet verklaren (Fig. 1b). De mRNA’s die door deze genen worden gecodeerd hebben ook de neiging kortere 5′ leader sequenties te hebben (een mediaan van 68.5 nucleotiden versus 173 voor alle genen), maar er was geen algemene correlatie tussen 5′ leader lengtes en hogere ribosoom dichtheden in CHX (Fig. 1c). Slechts 9 nucleair-gecodeerde genen (~ 0,2%) vertoonden een vermindering in ribosoomdichtheid in CHX (Fig. 1a en Supplementary Fig. S1), en ze hadden geen gemeenschappelijke kenmerken.

Onder niet-stress condities had het geneesmiddel daarentegen een zeer zwak effect op ribosomale dichtheid (gemiddelde R = 0,98), met minder dan 1% van de genen die verschillen in dichtheid vertoonden die groter waren dan 2-voudig (23 genen hoger in CHX en 9 lager, Fig. 1a en Supplementary Fig. S1). Interessant is dat de kleine groep genen die lagere dichtheden vertoonden in cellen behandeld met CHX ook verrijkt was in ribosomale eiwitgenen (12/23 mRNA’s).

We concluderen dat mRNA’s die RP’s coderen bijzonder gevoelig zijn voor de aanwezigheid van CHX, en dat dit fenomeen niet alleen kan worden verklaard door hun korte 5′ leader en coderende sequenties. Bovendien is het effect alleen sterk onder voedingsstress. Deze resultaten tonen echter niet aan welke van de twee monsters (met CHX behandeld of onbehandeld) de in vivo situatie beter weerspiegelt. RP-genen zijn bijvoorbeeld rijk aan optimale codons, wat impliceert dat translatie-verlenging met hoge snelheid plaatsvindt. Deze eigenschap, samen met hun korte lengte, zou ze gevoeliger kunnen maken voor het wegvloeien van ribosomen tijdens de verzameling. In dit geval zou CHX de in vivo distributie stabiliseren. Als alternatief is het ook mogelijk dat CHX een direct effect heeft op de translatie van deze mRNA’s, wat leidt tot niet-fysiologische ribosoomdichtheden.

We hebben vervolgens onderzocht of de veranderingen in ribosoomdichtheid veroorzaakt door CHX van invloed zouden zijn op de interpretatie van de translationele/transcriptionele respons op stikstofverhongering. We gekwantificeerd translationele efficiëntie (TE’s) door normaliseren RPF tellingen door mRNA niveaus, en berekende de log verandering in TE en transcript niveaus tussen cellen gekweekt in stikstof-bevattend medium en stikstof-sterveerde cellen (Fig. 1c en Supplementary Fig. S1B). In aanwezigheid van CHX leidde stikstofverhongering tot een duidelijke down-regulatie van de mRNA’s die coderen voor RP’s, maar niet van hun TE. In experimenten uitgevoerd in afwezigheid van CHX bleken deze mRNA’s daarentegen zowel op mRNA- als op TE-niveau te worden gedereguleerd. Voorafgaande incubatie met CHX in het medium kan dus de TE van specifieke groepen genen beïnvloeden. De abundantie van mRNA’s die coderen voor RP’s is zeer sterk gecoreguleerd22,23,24; onze resultaten tonen aan dat deze mRNA’s ook gecoördineerd gedrag vertonen op het niveau van de translatie-efficiëntie. De reden voor de extreme gevoeligheid van deze mRNA’s voor CHX moet nog worden opgehelderd.

Voor de meerderheid van de genen heeft behandeling met CHX echter geen effect op de ribosomale dichtheid, ongeacht de groeiconditie. Vergelijkbare resultaten zijn gerapporteerd voor zoogdiercellen die in cultuur zijn gekweekt, waarbij CHX geen significant effect heeft op gen-specifieke ribosoom dichtheden. Dit is echter alleen onderzocht in ongestresste cellen13.

Verschuivingen in het gebruik van upstream Open Reading Frames

S. cerevisiae cellen vertonen een accumulatie van ribosoom voetafdrukken in 5′ leader sequenties die toeneemt onder stress condities, wat een hoger gebruik van uORFs suggereert1, 9, 10. Echter, deze conclusies zijn betwist en toegeschreven aan het gebruik van CHX in celkweek8.

Om deze vraag te beantwoorden in S. pombe vergeleken we de accumulatie van leest in 5′ leader en coderende sequenties (Fig. 2a) voor en na stikstofstervatie. We hebben aanvankelijk gekwantificeerd deze waarde door het meten van de verhouding tussen het totale aantal ribosoom voetafdrukken in 5′ leiders en in coderende sequenties. Stikstofsterving in CHX-behandelde cellen veroorzaakte een gemiddelde toename van 5,5-voudige, terwijl onbehandelde cellen hadden een 2,1-voudige gemiddelde toename (beide verrijkingen waren consistent over biologische replicaten, Fig. 2b). Omdat de totale verhoudingen kunnen worden gedomineerd door veranderingen in een klein aantal zeer overvloedige genen, hebben we ook gekwantificeerd de verhoudingen tussen voetafdrukken in 5′ leiders en coderende sequenties voor alle individuele transcripten die de expressiedrempel overschreden (zie Methoden voor details, en Fig. 2c en Supplementary Fig. S3 voor de resultaten). In overeenstemming met het vorige resultaat was er een duidelijke toename van ribosoom voetafdrukken in 5′ leader sequenties bij stikstofsterfte voor de meerderheid van de genen (Fig. 2c en supplementaire Fig. S3; merk op dat de toename in het tweede replicaat kleiner is, maar nog steeds significant), met gemiddelde toename ratio’s van 3,8 en 1,9 voor plus/min CHX, respectievelijk (Fig. 2d, let op het vergelijkbare gedrag van beide replicaten). Dus, in tegenstelling tot de S. cerevisiae resultaten, werden 5′ leader ribosomale dichtheden verhoogd door voedingsstress in elk experiment, hoewel het effect aanzienlijk hoger was in CHX-behandelde cellen. Een mogelijk voorbehoud is natuurlijk dat in de S. cerevisiae-studie een ander soort stress werd gebruikt8. Niettemin, gezien het feit dat enige accumulatie is waargenomen zowel met als zonder behandeling met geneesmiddelen, kunnen we concluderen dat in S. pombe stikstofverhongering leidt tot hogere ribosomale dichtheden op 5′ leader sequenties. Deze toename in dichtheid kan te wijten zijn aan translatie van uORFs, hoewel we niet kunnen uitsluiten dat het verhoogde ruis in gestresste monsters weerspiegelt. Supplementaire Fig. S4 presenteert twee voorbeelden van uORFs geïnduceerd in reactie op stikstofsterfte. Het biologische belang en de mechanistische basis van dit fenomeen (en of het algemeen is voor alle stresscondities) is nog onbekend.

Effecten van CHX op ribosoomdichtheden op 5′ leader sequenties. (a) Experimentele opzet: RPFs in coderende sequenties (CDS) en 5′ leader sequenties worden gekwantificeerd in verschillende experimentele omstandigheden. (b) Verhouding van de totale gelezen in kaart brengen van 5′ leader sequenties tot de totale gelezen in kaart brengen van coderende sequenties (CDS) voor ongestresste cellen (+N) en stikstof uitgehongerde cellen (-N), en voor cellen behandeld of onbehandeld met CHX (±CHX). De getallen geven het vouw-verschil aan tussen paren van -N en +N monsters. De gegevens worden weergegeven voor twee biologische replicaten. (c) Scatter plot vergelijken van de verhouding van leest in kaart brengen van 5′ leader sequenties te lezen in kaart brengen van coderende sequenties (CDS) voor individuele genen; elke plot vergelijkt niet gestresste cellen (+N) en stikstof uitgehongerde cellen (-N). Gegevens worden gepresenteerd voor cellen behandeld met CHX (links) of onbehandeld (rechts). De rode lijnen corresponderen met een verhouding van 1. (d) Gemiddelde waarden voor de verhoudingen gepresenteerd in (c). De getallen geven het vouwverschil aan tussen paren van -N en +N monsters. De gegevens worden weergegeven voor twee biologische replicaten.

Distributie van ribosomen langs coderende sequenties

S. cerevisiae-cellen vertonen een asymmetrische ribosoomverdeling over de coderende sequenties, met een brede piek van hogere ribosoombezetting in de eerste ~300-400 nucleotiden van de coderende sequentie1, 9, 14, 20 die sterk wordt versterkt door verschillende spanningen1, 8, 12.

Wij onderzochten dit fenomeen in S. pombe op twee manieren: ten eerste, door de verhouding te berekenen tussen voetafdrukken in nucleotiden 10 tot 400 en 401 tot 800 (Fig. 3a-c, de eerste 9 nucleotiden werden buiten beschouwing gelaten om vertekeningen te vermijden die ontstaan door de accumulatie van ribosomen bij initiërende AUG); ten tweede, door het gedrag te onderzoeken van een metageen dat genoombrede ribosoomdichtheid langs coderende sequenties vertegenwoordigt (Fig. 3d en aanvullende fig. S5).

Effecten van CHX op de ribosoomverdeling over coderende sequenties. (a) Experimentele opzet: RPF’s op nucleotiden 10 tot 400 en op nucleotiden 401-800 worden gekwantificeerd in verschillende experimentele omstandigheden, en de verhouding tussen beide getallen wordt berekend. (b) Gemiddelde verhoudingen berekend zoals beschreven in A voor alle coderende sequenties, in aanwezigheid en afwezigheid van een stikstofbron (±N) en in aanwezigheid en afwezigheid van CHX-behandeling (±CHX). De getallen geven het vouw-verschil aan tussen gepaarde -N en +N monsters. De gegevens worden weergegeven voor twee biologische replicaten. (c) Scatter plot vergelijken van de ratio’s verkregen als gedefinieerd in A voor individuele genen; elke plot vergelijkt niet gestresste cellen (+N) en stikstof uitgehongerde cellen (-N). Gegevens worden gepresenteerd voor cellen behandeld met CHX (links) of onbehandeld (rechts). De rode lijnen corresponderen met een verhouding van 1. (d) Metagene weergave van de gemiddelde verdeling van RPFs langs coderende sequenties in vier experimentele condities. Een lopend venster van 60 nucleotiden werd gebruikt om de uitgezette lijnen af te vlakken.

In afwezigheid van stress, S. pombe cellen vertoonden kleine schouders zowel in de aanwezigheid en afwezigheid van het geneesmiddel, vergelijkbaar met die gerapporteerd voor S. cerevisiae zonder CHX1, 14, 20 (Fig. 3d en Supplementary Fig. S5). Bij voedingsstress gedroeg S. pombe zich op vergelijkbare wijze als S. cerevisiae 12. In aanwezigheid van CHX, was er een duidelijke accumulatie van gelezen in de 5′ deel van de coderende sequentie in de meerderheid van de genen (Fig. 3c en Supplementary Fig. S5, linker plot), die ook werd weerspiegeld in een ~ 2-voudige toename van de gemiddelde dichtheid in de eerste 400 nucleotiden van het mRNA (Fig. 3b). Daarentegen was deze toename verwaarloosbaar in de afwezigheid van het geneesmiddel, zowel wanneer individuele genen werden onderzocht (Fig. 3c (rechter plot) en Supplementary Fig. S5) en wanneer de gemiddelde verhoudingen werden gemeten (Fig. 3b, merk op dat beide replicaten zich consistent gedroegen). Bovendien werd de CHX-afhankelijkheid van de accumulatie van gegevens bij stikstofgebrek bevestigd door de metagene gegevens (Fig. 3d en Supplementary Fig. S5). Ten slotte hebben we vastgesteld dat dit effect specifiek was voor RPFs, door het plotten van een metageen op basis van mRNA-seq gegevens (Supplementary Fig. S5).

Wij hebben ook overwogen of deze waarnemingen ook zouden gelden voor kleinere genen. Met dit doel genereerden we metagenen voor RP genen en voor kleine genen (minder dan 200 codons) exclusief RP genen. In beide gevallen veroorzaakte CHX een duidelijke toename aan de 5′-zijde van de coderende sequenties (vooral voor RP-genen), die zowel afhankelijk was van stikstofstervatie als van CHX-behandeling (Supplementary Fig. S5).

Daarnaast was er een accumulatie van ribosomen op initiatiecodons (Supplementary Fig. S6). Dit kenmerk was al aanwezig in onbehandelde cellen, hoewel het werd verhoogd met CHX incubatie (zowel in controle en stikstof-arme cellen). Deze verrijking was iets hoger in stikstof-gesterfde cellen, onafhankelijk van CHX-behandeling (Supplementary Fig. S6).

Tus is er een duidelijke accumulatie van ribosomen in het initiële deel van coderende sequenties, geconserveerd in S. pombe en S. cerevisiae, en die kan worden waargenomen zowel met als zonder CHX voorbehandeling. Daarentegen wordt de stress-geïnduceerde verhoging niet consistent waargenomen in de afwezigheid van CHX in beide gisten, en dus is er niet voldoende bewijs om aan te geven dat het in vivo optreedt. In de toekomst kan het gebruik van in vivo cross-linking strategieën25 helpen onderscheid te maken tussen deze twee interpretaties.

Codon bezetting

In principe is de genormaliseerde ribosomale bezetting van individuele codons gerelateerd aan de tijd die het ribosoom aan elk codon besteedt, en kan dus worden gebruikt om gemiddelde codon-specifieke vertaalsnelheden te schatten. De eerste experimenten om dit fenomeen te onderzoeken leverden echter tegenstrijdige resultaten op17,18,19,20. Een elegante studie van Hussmann et al., die nieuwe experimenten, een meta-analyse van talrijke ribosoom profileringsexperimenten van S. cerevisiae en wiskundige modellering omvatte9, vond dat deze tegenstrijdigheden konden worden verklaard door het effect van CHX op de bepaling van codonspecifieke ribosoombezettingen. Experimenten van verschillende groepen uitgevoerd in aanwezigheid van CHX hadden vergelijkbare ribosoom codonbezettingen als die uitgevoerd zonder het medicijn. De correlaties tussen CHX- en niet-CHX-assays waren echter zeer laag. Bovendien resulteerden experimenten met CHX in codon-specifieke translatiesnelheden die negatieve correlaties vertoonden met cognaat tRNA abundantie, terwijl die zonder CHX behandeling de verwachte positieve correlaties vertoonden9, 20. Hussmann et al. stelden voor dat ribosomen niet onmiddellijk stoppen met translatie in de aanwezigheid van CHX in het medium. In plaats daarvan, vertaling blijft voor een paar codons met codon-specifieke vertaling tarieven9, waardoor artefactual codon bezettingen.

Om dit fenomeen te onderzoeken analyseerden we codon-specifieke ribosomale bezettingen op A-sites zoals beschreven in Methods. In het kort, we toegewezen elke gelezen die gemapt aan een coderende sequentie aan de A-site van een ribosoom (dat overeenkomt met nucleotide 16 van een ribosoom-beschermd fragment). Vervolgens berekenden we de genormaliseerde bezetting voor elk codon over het genoom (door de frequentie waarmee het ribosoom op elk codon staat te delen door de abundantie van het codon op het mRNA). Bij afwezigheid van vertekeningen zou deze waarde naar verwachting de gemiddelde tijd weerspiegelen die het ribosoom op elk codon doorbrengt.

We vergeleken eerst het effect van CHX op codon-specifieke ribosomale bezettingen (Fig. 4, supplementaire Figs S7 en S8). Verrassend genoeg was de correlatie tussen beide experimenten zeer hoog, met gemiddelde waarden van 0,82 voor stikstof-stervatie (Fig. 4a en Supplementary Fig. S7) en 0,86 voor ongestresste cellen (Fig. 4b en Supplementary Fig. S7). Bij soortgelijke vergelijkingen in S. cerevisiae was de meerderheid van de correlaties negatief9. Bijvoorbeeld, zeldzame codons zoals CCG (proline) en CGG (arginine) hadden bij de hoogste bezettingsgraden in afwezigheid van CHX, maar verloren deze verrijking in met CHX behandelde monsters9. Daarentegen waren in de S. pombe dataset zowel CCG als CGG verrijkt, ongeacht de aanwezigheid van CHX (hoewel minder sterk in onbehandelde cellen, Fig. 4c en aanvullende Fig. S7). Bovendien had voedingsstress zeer weinig effect op codon-specifieke ribosomale bezettingen, zowel in aanwezigheid (Fig. 4c en aanvullende Fig. S7, gemiddelde R = 0,96) als in afwezigheid van CHX (Fig. 4d en aanvullende fig. S7, gemiddelde R = 0,98).

Effecten van CHX op relatieve codonbezettingen. Spreidingsdiagrammen met de relatieve codonbezettingen, verkregen zoals beschreven in de Methoden. Elk punt komt overeen met een enkel codon. Afsluitende codons worden niet weergegeven. De posities van de zeldzame codons CCG en CGG zijn aangegeven. De stippellijnen corresponderen met 1.5-voudige verschillen. De Pearson correlaties tussen de datasets zijn aangegeven. (a) Vergelijking van de effecten van CHX-behandeling in stikstofarme cellen. (b) Zoals in (a), voor cellen gekweekt met een stikstofbron. (c) Vergelijking van de effecten van stikstofgebrek in de aanwezigheid van CHX. (d) Als in (c), in afwezigheid van CHX.

Ten slotte hebben we de correlatie tussen de tRNA-rijkdom en de codonspecifieke bezetting beoordeeld. Dit werd gedaan met behulp van de tRNA-aanpassingsindex (tAI), die een maat is voor het tRNA-gebruik voor elk codon, deels gebaseerd op het aantal tRNA-kopieën (hogere aantallen voorspellen een efficiëntere vertaling)26. S. cerevisiae experimenten uitgevoerd in de aanwezigheid van CHX in de cultuur tonen negatieve correlaties tussen het omgekeerde van de tAI (1 / tAI) en codon-specifieke bezettingen, voorspellen dat codons met een lage tAI (en dus lage tRNA overvloed) zou sneller worden vertaald. Daarentegen lieten experimenten met cellen die niet met CHX waren voorbehandeld de verwachte positieve correlatie tussen 1/tAI zien (hoewel de werkelijke waarden zeer variabel waren tussen de experimenten)9. In S. pombe vonden we dat in elk van de acht ribosoom profileringsexperimenten codonspecifieke bezettingen een positieve correlatie vertoonden met 1/tAI, met een gemiddelde van 0,39 (tabel 2).

Onze resultaten tonen aan dat in S. pombe CHX een relatief gering effect heeft op de positie van ribosomen op specifieke codons. Dit zou verklaard kunnen worden doordat S. pombe-cellen bijzonder gevoelig zijn voor CHX, zodat CHX de bewegingen van ribosomen sneller en vollediger zou blokkeren dan in S. cerevisiae. Deze eigenschap zou de beweging van ribosomen met veranderde snelheid (waarvan wordt verondersteld dat die plaatsvindt in S. cerevisiae) voorkomen, en leiden tot een situatie waarin S. pombe met CHX behandelde en onbehandelde cellen vergelijkbare ribosoom-distributies in steady state zouden hebben. Het feit dat zeldzame codons minder verrijkt zijn in de aanwezigheid van CHX suggereert echter dat CHX zou moeten worden weggelaten in experimenten gericht op het bepalen van codon-specifieke ribosoom distributies.