Mutationen in FLNB verursachen Boomerang-Dysplasie | Journal of Medical Genetics

Boomerang-Dysplasie (OMIM #112310) ist eine tödliche Skelettdysplasie, die durch eine desorganisierte Verknöcherung des Skeletts gekennzeichnet ist.1 Zu den charakteristischen radiologischen Befunden gehören eine unregelmäßige Verknöcherung der Gliedmaßen und Wirbel, eine Unterentwicklung der Hüftpfanne und hypoplastische, bumerangförmige Oberschenkelknochen, von denen die Erkrankung ihren Namen ableitet.1 In der Literatur wurden bisher mindestens acht Fälle beschrieben.1-8 Eine ähnliche tödliche Skelettdysplasie, die Piepkorn-Dysplasie,9 wurde als Allel zur Bumerang-Dysplasie vorgeschlagen.2,7 Die Knorpelhistologie zeigt sowohl desorganisierte Knorpelanlagen des sich entwickelnden Röhrenknochens als auch häufige vielkernige Chondrozyten in der Reservezone der Wachstumsplatte.1 Es wurden weitere Entwicklungsanomalien außerhalb des Skeletts beschrieben, darunter Omphalozele und Enzephalozele.

Ähnlichkeiten in den radiologischen und histologischen Befunden der Bumerangdysplasie und der Atelosteogenese I (AOI; OMIM #108720) und III (AOIII; OMIM #108721) lassen auf Allelismus für diese Störungen schließen.2,10 Bei allen drei Entitäten umfassen die radiologischen Befunde eine mangelhafte und unregelmäßige Verknöcherung von Knochen und Wirbelkörpern mit einer distalen Humerushypoplasie und Gelenkverrenkungen zusätzlich zu kraniofazialen Anomalien.11 Darüber hinaus wurden sowohl bei der AOI als auch bei der Boomerang-Dysplasie mehrkernige Chondrozyten beobachtet. Die Bumerang-Dysplasie unterscheidet sich von der AO durch einen schwerwiegenderen Mineralisierungsdefekt, bei dem die Verknöcherung einiger Gliedmaßen und Wirbelsäulenabschnitte vollständig fehlt.3 Die Tatsache, dass unter den gemeldeten Fällen von Bumerang-Dysplasie7 überwiegend Männer zu finden sind, und einige phänotypische Ähnlichkeiten mit den Störungen des otopalatodigitalen Syndroms, die durch Mutationen im FLNA-Gen12,13 verursacht werden, legen für einige Autoren eine X-gebundene Ätiologie nahe.7

Kürzlich haben wir die Assoziation von Mutationen in dem Gen, das für das 280 kDa Zytoskelettprotein Filamin B kodiert, mit mehreren Erkrankungen beschrieben, die durch Skelettdefekte und Gelenkverrenkungen gekennzeichnet sind.14 Filamin B ist ein modulares Protein. Am Aminoterminus befindet sich eine Aktinbindungsdomäne, die aus zwei Calponin-Homologiedomänen (CH1 und CH2) besteht, gefolgt von einer Stäbchendomäne, die aus 24 strukturell homologen Wiederholungen besteht und in einer carboxyterminalen Dimerisierungsdomäne endet.15 Die Aktinbindungsdomäne in Filamin B ähnelt denen in anderen Zytoskelettproteinen wie β-Spectrin, Dystrophin und α-Actinin-4.

Vier verschiedene Erkrankungen wurden auf Mutationen in FLNB zurückgeführt: AOI, AOIII, rezessiv vererbtes Spondylcarpotarsal-Syndrom (OMIM #272460) und eine dominante Form des Larsen-Syndroms (OMIM #150250). Bei Personen mit AOI, AOIII und dem dominant vererbten Larsen-Syndrom wurde festgestellt, dass sie heterozygot für Missense-Mutationen in FLNB sind.14 Die meisten Mutationen, die zu AOI oder AOIII führen, führen zu Substitutionen, die in der CH2-Domäne der Aktinbindungsdomäne von Filamin B lokalisiert sind. Die einzige Ausnahme ist die Mutation 2251G→C, die sich in Exon 15 befindet und die voraussichtlich zu der Substitution G751R in Repeat 6 führt, die bei einer Person mit AOIII gefunden wurde.14 Während der Arbeiten zur Identifizierung der Gruppe von Erkrankungen, die auf Mutationen in FLNB zurückzuführen sind, wurde ein Individuum mit Bumerang-Dysplasie durch direkte Sequenzierung auf Mutationen untersucht, aber es wurde keine Mutation identifiziert.14

Angesichts der röntgenologischen, phänotypischen und histologischen Hinweise, die darauf hindeuten, dass die Bumerang-Dysplasie mit Störungen verwandt ist, die durch Mutationen in Genen verursacht werden, die für Filamine kodieren, untersuchten wir zwei Individuen mit Bumerang-Dysplasie auf Mutationen in FLNA und FLNB unter Verwendung der denaturierenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC) als Screening-Technik.

Individuum 1 war der Fall, der zuvor durch direkte Sequenzierung untersucht wurde. Dieser männliche Fötus war das erste Kind von nicht blutsverwandten, gesunden Eltern. Die Ultraschalluntersuchung im zweiten Trimester ergab eine Thoraxhypoplasie und eine deutliche Verkürzung aller Gliedmaßen mit unregelmäßiger Verknöcherung mehrerer Skelettelemente. Der Fötus wurde in der 22. Schwangerschaftswoche entbunden. Die Post-mortem-Analyse ergab eine ausgeprägte Thoraxhypoplasie, kurze Gliedmaßen und den charakteristischen Gesichtsdysmorphismus, der mit der Bumerang-Dysplasie einhergeht. Eine Enzephalozele oder Omphalozele war nicht vorhanden. Die Röntgenbefunde waren typisch für die Bumerang-Dysplasie (Abb. 1).

Bei Individuum 2 handelte es sich um einen Fötus in der 17. Schwangerschaftswoche, über den Wessels et al. bereits ausführlich berichtet hatten.8 Dieser Fötus wies eine schwere Mikromelie auf, wobei zwei der drei langen Röhrenknochen an allen vier Gliedmaßen fehlten. Bei der Röntgenuntersuchung waren die verbleibenden Radien bumerangförmig, die Tibiae waren segmental, die Wirbelsäule war schlecht verknöchert und der Thorax war hypoplastisch. Histologisch war die Knorpelmatrix hypozellulär mit vielkernigen Riesenchondrozyten.

Die kodierenden Regionen und Intron-Exon-Spleißverbindungen von FLNA und FLNB wurden aus genomischer DNA beider Fälle mit intronischen Primern amplifiziert, die zuvor beschrieben wurden13,14 (Reaktionsbedingungen und Primersequenzen sind auf Anfrage erhältlich). Für die Analyse der FLNA wurden die Amplikonprodukte durch Agarosegel-Elektrophorese sichtbar gemacht und dann vor der Heteroduplexbildung mit gleichen Mengen PCR-amplifizierter Produkte einer nicht verwandten gesunden männlichen Kontrolle gemischt. Die Proben wurden einer DHPLC auf einem WAVE-DNA-Fragmentanalysesystem (Transgenomic Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen. Amplikons, die anomale Spurenformen aufwiesen, wurden erneut amplifiziert und auf einem ABI 3100 Sequenziergerät sequenziert. Die identifizierten Mutationen wurden durch Restriktionsenzymverdau der amplifizierten DNA bestätigt, und die Abstammung wurde für Fall 1 durch die Segregation von sechs unverknüpften Mikrosatellitenmarkern bestätigt. Für Fall 2 standen keine elterlichen Proben zur Verfügung. Diese Studie wurde von der Ethikkommission von Otago genehmigt.

Bei der Untersuchung von FLNB (Exons 1-46) wurden bei beiden Personen Mutationen festgestellt. Im Fall 1 wurde gezeigt, dass die Person heterozygot für die Mutation 512T→G ist, die zu der Substitution L171R führen soll. Diese Mutation schafft eine Stelle für das Restriktionsenzym HpaII, so dass nachgewiesen werden konnte, dass sie in dieser Familie de novo aufgetreten war (Abb. 2), was den genetischen Nachweis der Pathogenität erbrachte. Im Nachhinein betrachtet, war diese Mutation bereits in der ursprünglichen Analyse vorhanden, wurde aber übersehen. Die zweite Mutation, 703T→C, wurde im Exon 4 in Fall 2 gefunden und sagt die Substitution S235P voraus (Abb. 2). Elterliche Proben waren nicht verfügbar, aber diese Mutation war in 100 Kontrollchromosomen nicht vorhanden. Beide Mutationen verändern laut Vorhersage Reste in der CH2-Region der Aktinbindungsdomäne von Filamin B. Diese Reste sind unter den Filaminen der Wirbeltiere evolutionär hoch konserviert (Abb. 3). Die Mutationen lassen vermuten, dass diese Aminosäuren eine entscheidende Rolle bei der Funktion der Aktinbindungsdomäne spielen. Für die 703T→C-Mutation wurde die gleiche Substitution am analogen Rest in ACTN4, einem Gen, das für das Zytoskelett-Adapterprotein α-Actinin-4 kodiert (Abb. 3), bei einem Patienten mit fokaler und segmentaler Glomerulosklerose beobachtet.16

Krankheitsbedingte Substitutionen innerhalb der Aktinbindungsdomäne von Filamin B führen zu einer Vielzahl von Phänotypen. Wir haben bereits über Substitutionen berichtet, die zu AOI (n = 3), AOIII (n = 1) und Larsen-Syndrom (n = 2) führen.14 Alle diese Phänotypen sind mit Defekten in der Skelett- und Gelenkbildung verbunden. Die Identifizierung von Mutationen, die zu Substitutionen innerhalb der Aktinbindungsdomäne von Filamin B führen, bei zwei Patienten mit Bumerangdysplasie bestätigt, dass diese Erkrankung allelisch zu diesen Störungen ist, was frühere klinische Verdachtsmomente auf Verwandtschaft widerspiegelt.2,3

Ein Teil der Mutationen, die das otopalatodigitale Spektrum von Skelettstörungen verursachen, liegt in der analogen CH2-Region in FLNA. Diese Mutationen führen ebenfalls zu einem breiten Spektrum an phänotypischen Schweregraden.13 Es gibt keine einfache Korrelation zwischen dem Ort dieser Mutationen und der Schwere der daraus resultierenden Defekte in der Skelettverknöcherung. Während sich das otopalatodigitale Syndrom Typ 1 milder manifestiert als das otopalatodigitale Syndrom Typ 2, können diese Erkrankungen durch Substitutionen an nahe beieinander liegenden Resten oder sogar am selben Rest entstehen.13,17 Die Beobachtung, dass Mutationen in der Aktinbindungsdomäne von FLNB ebenfalls zu einem breiten Spektrum an Schweregraden führen können, rekapituliert dieses Muster. Die Substitution, die durch die in Individuum 1 gefundene Mutation vorhergesagt wird, L171R, befindet sich in unmittelbarer Nähe der Stelle einer Substitution (A173V), die für AOI ursächlich ist.14 In ähnlicher Weise befindet sich die hier berichtete S235P-Substitution innerhalb derselben Proteinfalte wie E227K, eine Substitution, die mit dem weniger schweren, nicht tödlichen Phänotyp, dem Larsen-Syndrom, in Verbindung gebracht wird.14 Trotz der Berichte über krankheitsassoziierte Substitutionen in Resten innerhalb der CH2-Domäne der Aktinbindungsdomäne von Dystrophin, α-Actinin-4,17 Filamin A,13 und Filamin B,14 ist eine funktionelle Rolle für diese Proteinfaltung noch nicht endgültig geklärt worden. Da die CH2-Domänen isoliert keine angeborenen Aktinbindungseigenschaften besitzen, wurde postuliert, dass die Rolle der CH2-Domäne bei der Aktinbindung bestenfalls indirekt ist.18

Filamine stabilisieren in erster Linie Aktin innerhalb der Zelle, entweder als parallele Bündel oder orthogonale Gel-Netzwerke.19,20 Für Filamin A wurden mehrere Bindungspartner identifiziert, wobei die überwiegende Mehrheit über die Filamin-Wiederholungen 16-24 assoziiert (Übersicht in Stossel et al21). Es wurde gezeigt, dass fünf Bindungspartner mit Filamin B assoziieren: Aktin, FBLP-1,22 Presenilin (PS1 und PS2),23 und GPIβα.24 Es bleibt abzuwarten, ob Mutationen innerhalb der Aktinbindungsdomänen der Filamine A und B ihre pathogene Wirkung in erster Linie durch eine Störung der Aktinbindung oder durch eine funktionelle Abhängigkeit zwischen Aktinassoziation und Bindungsinteraktionen mit anderen Proteinen ausüben.

Mehrkernige Riesenzellen werden unter den Chondrozyten in der Wachstumsplatte von Personen mit Bumerangdysplasie gefunden. Diese Erscheinungen könnten auf eine fehlerhafte Zellspaltung während der Proliferation von Chondrozyten in der epiphysären Wachstumsplatte zurückzuführen sein. Zuvor haben wir eine weit verbreitete Expression von FLNB in der Wachstumsplatte und insbesondere in der Spaltfurche der sich teilenden Chondrozyten nachgewiesen.14 Der Prozess der veränderten Zellspaltung, der zu einer fehlerhaften Skelettstrukturierung und Mineralisierung bei der Gruppe der Boomerang-Dysplasie/Atelosteogenese führt, muss noch aufgeklärt werden.

Die Identifizierung von Mutationen, die eine Boomerang-Dysplasie in FLNB verursachen, bestätigt die Boomerang-Dysplasie als Teil des Chondrodysplasie-Spektrums, einschließlich AOI und III sowie des nicht-tödlichen Larsen-Syndroms. Die phänotypischen Überschneidungen zwischen Bumerang-Dysplasie und AO, über die hier und in früheren Berichten berichtet wurde, sowie die Kolokalisierung der diesen Krankheiten zugrunde liegenden Mutationen in Exons, die für die Aktinbindungsdomäne von FLNB kodieren, weisen auf ein klinisch-pathologisches Spektrum für diese Erkrankungen hin. Diese weitere Erweiterung des phänotypischen Spektrums, das mit Mutationen in FLNB assoziiert ist, unterstreicht die Bedeutung eines funktionierenden Aktin-Zytoskeletts für viele normale morphogenetische Prozesse, einschließlich der Skelettbildung.