FLNBの変異はブーメラン形成不全を引き起こす｜Journal of Medical Genetics
Boomerang dysplasia (OMIM #112310) は骨格の無秩序な骨化を特徴とする致死の骨格形成不全である1,2,3。 特徴的なX線所見として、四肢骨と椎骨の不規則な骨化、寛骨臼の未発達、低形成のブーメラン型の大腿骨があり、この疾患はこの名前に由来しています1。 軟骨組織学的に、成長中の長骨の軟骨原基の乱れや成長板の予備帯に多核軟骨細胞が多く認められます1。 ブーメラン形成不全と骨端症I（AOI; OMIM #108720）およびIII（AOIII; OMIM #108721）のX線像および組織像の類似性から、これらの疾患の対立遺伝子が示唆されています2,10。 また、AOIとブーメラン形成不全のいずれにおいても、多核軟骨細胞が観察されています。 ブーメラン形成不全は、四肢や椎骨の骨化が完全に欠如しており、より重度の骨化不全であることからAOと区別されます。ブーメラン形成不全の報告例では男性が多く7、FLNA遺伝子の変異により生じる耳小指症候群スペクトラム障害と表現型が似ていることから、一部の著者によりX連鎖性の病因であることが示唆されました12、13。
最近、我々は280 kDaの細胞骨格タンパク質であるフィラミンBをコードする遺伝子の変異と骨格欠損や関節脱臼を特徴とするいくつかの疾患との関連について報告した14。フィラミンBはモジュール型タンパク質である。 カルポニン相同ドメイン（CH1およびCH2）からなるアクチン結合ドメインがアミノ末端にあり、その後、構造的に相同な24の繰り返しからなるロッドドメインが続き、カルボキシ末端の二量化ドメインで終端している15。 フィラミンBのアクチン結合ドメインは、β-spectrin、ジストロフィン、α-actinin-4などの他の細胞骨格タンパク質に見られるドメインと類似している。 AOIやAOIIIにつながる変異の多くは、フィラミンBのアクチン結合ドメインのCH2ドメインに局在する置換である。唯一の例外は、AOIIIの個体で見つかった、エクソン15に位置する変異2251G→Cで、これはリピート6にG751Rをもたらすと予測される14。 FLNBの変異に起因する疾患群を特定した研究の中で、ブーメラン形成不全の1名がダイレクトシークエンスによって変異の有無を評価されたが、変異は確認されなかった14。
ブーメラン形成不全がフィラミンをコードする遺伝子の変異による障害に関連していることを示唆するX線写真、表現型、組織学的証拠を考慮し、我々はスクリーニング技術として変性高速液体クロマトグラフィー（DHPLC）分析を用いてFLNAとFLNBの変異についてブーメラン形成不全の2個体を調査した。 この男性胎児は、血縁関係のない健康な両親の第一子であった。 第2期の超音波検査で胸郭低形成と四肢の著しい短縮が認められ，複数の骨格要素の骨化が不規則であった。 胎児は妊娠22週で娩出された。 死後分析では、顕著な胸郭低形成、短い四肢、ブーメラン形成不全に伴う特徴的な顔面異形が確認された。 脳梗塞や脳出血はなかった。 X線写真所見はブーメラン形成不全に典型的であった（図1）
症例1のX線写真。 頚椎、脊椎、恥骨は骨化不足で、胸部側彎が明らかである。 上腕骨は骨化せず、大腿骨は欠落し、橈骨、尺骨、脛骨は大きく湾曲して短縮しており、重度の小骨症が認められる。 7220>
Individual 2は妊娠17週の胎児で、Wesselsらにより詳しく報告されている8。この胎児は四肢の3つの長管骨のうち2つが欠損しており、重度の小骨症であった。 X線写真では、残りの橈骨はブーメラン状、脛骨はセグメント状、脊椎は骨化不良、胸郭は低形成であった。 組織学的には，軟骨基質は低細胞であり，多核の巨大軟骨細胞が存在していた。
FLNAとFLNBのコーディング領域とイントロン-エクソン接合部は，両症例から得たゲノムDNAから，以前に記載したイントロンプライマーを用いて増幅した13，14（反応条件とプライマー配列はリクエストに応じて提供する）。 FLNAの解析では、増幅産物をアガロースゲル電気泳動で可視化し、ヘテロ二重鎖形成前に無関係の健康な男性コントロールからの等量のPCR増幅産物と混合した。 サンプルは、製造者の指示に従って、WAVE DNAフラグメント分析システム（Transgenomic Inc.）でDHPLCに供した。 異常な痕跡形態を示すアンプリコンを再増幅し、ABI 3100シークエンサーでサイクルシーケンスした。 同定された突然変異は増幅されたDNAの制限酵素消化によって確認され、親は6つの非連結マイクロサテライトマーカーの分離によって症例1について申告されたように確認された。 症例2については、親のサンプルが入手できなかった。 この研究はオタゴ倫理委員会の承認を得ている。
FLNB（エクソン1-46）の検査で両者とも変異が認められた。 症例1では、L171Rという置換をもたらすと予測される変異512T→Gを持つヘテロ接合体であることが示された。 この突然変異は、制限酵素HpaIIのためのサイトを作り、この家族でde novoに生じたことを証明することができ（図2）、病原性の遺伝的証拠となる。 今にして思えば、この変異は最初の解析でも存在していたのだが、見落とされていたのである。 2つ目の変異、703T→Cは、症例2のエクソン4で見つかり、置換S235Pを予測した（fig 2）。 親のサンプルは入手できなかったが、この突然変異は100本の対照染色体には存在しなかった。 両変異ともフィラミンBのアクチン結合ドメインのCH2領域内の残基を変化させると予測される。これらの残基は脊椎動物のフィラミン間で進化的に高度に保存されている(fig 3)。 この変異は、これらのアミノ酸がアクチン結合ドメインの機能において重要な役割を担っていることを示唆している。 703T→C変異については、細胞骨格アダプタータンパク質α-アクチニン-4をコードする遺伝子ACTN4（図3）の類似の残基に同じ置換が、巣状および分節性糸球体硬化症の患者において観察されている16
ブーメラン異形成に関連する変異を示すクロマトグラムと制限酵素消化物。 (A) 症例1、突然変異512T→Gのヘテロ接合性とHpaIIを用いた制限酵素消化を示す。 両親（レーン1、3）の解析とプロバンド（レーン2）の解析が示されている。 (B）ケース2、突然変異703T→Cに対するヘテロ接合性を示し、DrdIによる制限酵素消化を行う。 プロバンド（レーン1）と健常な無関係のコントロール（レーン2）から増幅したDNAの分析。 図3
フィラミンとヒト、マウス、Drosophilia melanogaster、Anopheles gambiae、Dictyostelium discoideum、Caenorhabditis elegansのアクチン結合ドメインを持つタンパク質のClustalWアライメント。 (A) L171残基周辺の配列コンテクスト、(B) S235残基周辺の配列コンテクスト。 Hyp-Fln, hypothetical filamin.
フィラミンBのアクチン結合ドメイン内の疾患関連置換は多様な表現型につながる． これまでに，AOI（n=3），AOIII（n=1），Larsen症候群（n=2）につながる置換を報告している14。これらの表現型はすべて，骨格形成や関節形成の障害に関連するものである。 ブーメラン形成不全の2名の患者において、フィラミンBのアクチン結合ドメインの置換につながる変異が同定されたことにより、この疾患がこれらの疾患と対立関係にあることが確認され、以前から臨床的に疑われていた関連性を反映している2、3
骨格障害のオプタラトジギタルのスペクトルを引き起こす変異の一部はFLNAにおける類似のCH2領域内にある。 これらの変異はまた、幅広い表現型の重症度をもたらす13。これらの変異の位置と、その結果生じる骨化異常の重症度との間には単純な相関関係はない。 FLNBのアクチン結合ドメインの変異もまた、幅広い重症度をもたらすという観察は、このパターンを再現している。 同様に、今回報告されたS235Pの置換は、E227Kと同じタンパク質フォールド内にあり、この置換は、より重症度が低く非致死性の表現型であるLarsen症候群に関連する置換である14。 ジストロフィン、α-アクチニン-4、フィラミンA、13、フィラミンBのアクチン結合ドメインのCH2内の残基の疾患関連置換が報告されているが、このタンパク質フォールドの機能的役割は明確にはなっていない14。 CH2ドメインは単独では生来のアクチン結合特性を持たないため、アクチン結合におけるCH2の役割は、せいぜい間接的なものであると仮定されてきた18
フィラミンは主に細胞内でアクチンを安定化するために作用し、平行バンドルまたは直交ゲルネットワークのいずれかとして働く19、20フィラミンAに対しては複数の結合相手が同定されてきたが、大多数が16-24フィラミンの繰り返しを通して結合している（Stossel et al21で総説あり）。 フィラミンBには、アクチン、FBLP-1、22 プレセニリン（PS1、PS2）、23 GPIβαの5つの結合パートナーが存在することが明らかにされている24。 フィラミンA、Bのアクチン結合ドメインの変異は、主にアクチン結合を阻害することによって、あるいはアクチン結合と他のタンパク質との結合相互作用の間の機能依存によって、その病原性を発揮するのかはまだ分かっていない。 このような現象は、骨端成長板における軟骨細胞の増殖過程における細胞切断の欠陥に起因している可能性がある。 以前、我々はFLNBが成長板で広く発現していること、特に分裂中の軟骨細胞の開裂溝で発現していることを証明した14。
FLNBのブーメラン形成不全を引き起こす変異が同定されたことにより、ブーメラン形成不全がAOIやIII、非致死性ラーセン症候群などの軟骨異形成スペクトラムの一部であることが確認されました。 ブーメラン形成不全とAOの表現型の重複、およびFLNBのアクチン結合ドメインをコードするエクソンにこれらの疾患の基礎となる変異が共局在することは、これらの疾患の臨床病理学的スペクトラムを示すものである。 このように、FLNBの変異によって表現型の幅がさらに広がることは、骨格形成を含む多くの正常な形態形成過程における機能的なアクチン細胞骨格の重要性を浮き彫りにするものである
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