Le mutazioni in FLNB causano la displasia boomerang | Journal of Medical Genetics

La displasia Boomerang (OMIM #112310) è una displasia scheletrica letale caratterizzata da ossificazione scheletrica disorganizzata.1 I risultati radiologici caratteristici includono l’ossificazione irregolare delle ossa degli arti e delle vertebre, il sottosviluppo dell’acetabolo e i femori ipoplasici a forma di boomerang, da cui deriva il nome della malattia.1 Almeno otto casi sono stati descritti in letteratura fino ad oggi.1-8 Una simile displasia scheletrica letale, la displasia di Piepkorn,9 è stata proposta come allelica alla displasia a boomerang.2,7 L’istologia cartilaginea dimostra sia anlagen cartilaginee disorganizzate dell’osso lungo in via di sviluppo sia frequenti condrociti multinucleati nella zona di riserva della piastra di crescita.1 Sono state descritte altre anomalie di sviluppo oltre lo scheletro, tra cui l’onfalocele e l’encefalocele.

Le somiglianze nei reperti radiografici e istologici della displasia boomerang e dell’atelosteogenesi I (AOI; OMIM #108720) e III (AOIII; OMIM #108721) hanno suggerito un allelismo per questi disturbi.2,10 In tutte e tre le entità, i risultati radiografici includono ossificazione carente e irregolare delle ossa e dei corpi vertebrali con ipoplasia omerale distale e lussazioni articolari oltre ad anomalie cranio-facciali.11 Inoltre, condrociti multinucleati sono stati osservati sia in AOI che nella displasia boomerang. La displasia boomerang si distingue dall’AO sulla base di un difetto più grave nella mineralizzazione, con assenza completa di ossificazione in alcuni elementi degli arti e segmenti vertebrali.3 Una preponderanza di maschi tra i casi riportati di displasia boomerang7 e alcune somiglianze fenotipiche con i disturbi dello spettro della sindrome otopalatodigitale causati da mutazioni nel gene FLNA12,13 hanno suggerito ad alcuni autori un’eziologia legata al X.7

Di recente abbiamo descritto l’associazione di mutazioni nel gene che codifica la proteina citoscheletrica 280 kDa filamina B con diversi disturbi caratterizzati da difetti scheletrici e lussazioni articolari.14 La filamina B è una proteina modulare. Un dominio legante l’actina composto da due domini omologici della calponina (CH1 e CH2) si trova al termine amminico, seguito da un dominio a bastoncello composto da 24 ripetizioni strutturalmente omologhe e terminante in un dominio di dimerizzazione carbossi-terminale.15 Il dominio di legame all’actina nella filamina B è simile a quelli che si trovano in altre proteine citoscheletriche, come la β-spectrina, la distrofina e l’α-actinina-4.

Quattro condizioni distinte sono state attribuite a mutazioni in FLNB: AOI, AOIII, sindrome spondilcarpotarsale ereditata recessivamente (OMIM #272460), e una forma dominante di sindrome di Larsen (OMIM #150250). Gli individui con AOI, AOIII, e la sindrome di Larsen ereditata in modo dominante sono risultati eterozigoti per mutazioni missenso in FLNB.14 La maggior parte delle mutazioni che portano a AOI o AOIII portano a sostituzioni localizzate al dominio CH2 del dominio di legame all’actina della filamina B. L’unica eccezione è la mutazione 2251G→C, localizzata nell’esone 15, che si prevede porti alla sostituzione G751R nella ripetizione 6, trovata in un individuo con AOIII.14 Durante il lavoro che ha identificato il gruppo di disturbi risultanti da mutazioni in FLNB, un individuo con displasia boomerang è stato valutato per le mutazioni tramite sequenziamento diretto, ma non è stata identificata alcuna mutazione.14

Data l’evidenza radiografica, fenotipica e istologica che suggerisce che la displasia boomerang è legata a disturbi causati da mutazioni nei geni che codificano le filamine, abbiamo esaminato due individui con displasia boomerang per le mutazioni in FLNA e FLNB utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni denaturante (DHPLC) come tecnica di screening.

L’individuo 1 era il caso precedentemente esaminato tramite sequenziamento diretto. Questo feto maschio era il primo figlio di genitori non consanguinei e sani. L’ecografia del secondo trimestre ha rivelato ipoplasia toracica e marcato accorciamento di tutti gli arti con ossificazione irregolare di più elementi scheletrici. Il feto è stato consegnato a 22 settimane di gestazione. L’analisi post-mortem ha dimostrato una marcata ipoplasia toracica, arti corti e il caratteristico dismorfismo facciale associato alla displasia boomerang. Non c’era nessun encefalocoele o omphalocoele presente. I risultati radiografici erano tipici della displasia boomerang (fig. 1).

L’individuo 2 era un feto di 17 settimane di gestazione, precedentemente riportato in dettaglio da Wessels et al.8 Questo feto ha dimostrato una grave micromelia con due delle tre ossa tubolari lunghe mancanti in tutti e quattro gli arti. All’esame radiografico, i raggi rimanenti erano a forma di boomerang, le tibie erano segmentate, la spina dorsale era scarsamente ossificata e il torace era ipoplasico. Istologicamente, la matrice cartilaginea era ipocellulare con condrociti giganti multinucleati presenti.

Le regioni codificanti e le giunzioni di giunzione introne-esone di entrambi FLNA e FLNB sono state amplificate dal DNA genomico ottenuto da entrambi i casi utilizzando primer intronici descritti precedentemente13,14 (le condizioni di reazione e le sequenze dei primer sono disponibili su richiesta). Per l’analisi di FLNA, i prodotti dell’amplicone sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio e quindi mescolati con quantità uguali di prodotti amplificati con PCR da un controllo maschio sano non correlato prima della formazione dell’eteroduplex. I campioni sono stati sottoposti a DHPLC su un sistema di analisi dei frammenti di DNA WAVE (Transgenomic Inc.) secondo le istruzioni del produttore. Gli ampliconi che dimostravano forme di tracce anomale sono stati ri-amplificati e sequenziati in ciclo su un sequenziatore ABI 3100. Le mutazioni identificate sono state confermate dalla digestione dell’enzima di restrizione del DNA amplificato e la parentela è stata confermata come dichiarato per il caso 1 dalla segregazione di sei marcatori microsatelliti non collegati. I campioni parentali non erano disponibili per il caso 2. Questo studio è stato approvato dal comitato etico di Otago.

L’esame di FLNB (esoni 1-46) ha rivelato mutazioni in entrambi i soggetti. Nel caso 1, l’individuo ha dimostrato di essere eterozigote per la mutazione 512T→G, che si prevede porti alla sostituzione L171R. Questa mutazione crea un sito per l’enzima di restrizione HpaII, consentendo la dimostrazione che era sorto de novo in questa famiglia (fig 2), fornendo prove genetiche di patogenicità. A posteriori, questa mutazione era presente nell’analisi originale, ma è stata trascurata. La seconda mutazione, 703T→C, è stata trovata nell’esone 4 nel caso 2, e prevede la sostituzione S235P (fig 2). I campioni parentali non erano disponibili, ma questa mutazione non era presente in 100 cromosomi di controllo. Entrambe le mutazioni sono previste per alterare i residui all’interno della regione CH2 del dominio di legame all’actina della filamina B. Questi residui sono altamente conservati evolutivamente tra le filamine dei vertebrati (fig 3). Le mutazioni suggeriscono che questi amminoacidi svolgono un ruolo critico nella funzione del dominio di legame all’actina. Per la mutazione 703T→C, la stessa sostituzione è stata osservata al residuo analogo in ACTN4, un gene che codifica la proteina adattatore citoscheletrica α-actinina-4 (fig 3), in un paziente con glomerulosclerosi focale e segmentale.16

Sostituzioni associate alla malattia all’interno del dominio di legame all’actina della filamina B portano a una diversità di fenotipi. In precedenza abbiamo segnalato sostituzioni che portano a AOI (n = 3), AOIII (n = 1), e la sindrome di Larsen (n = 2).14 Tutti questi fenotipi sono associati a difetti nella scheletogenesi e formazione delle articolazioni. L’identificazione di mutazioni che portano a sostituzioni all’interno del dominio di legame dell’actina della filamina B in due pazienti con displasia boomerang conferma che questa condizione è allelica a questi disturbi che riflettono i precedenti sospetti clinici di parentela.2,3

Una parte delle mutazioni che causano lo spettro otopalatodigitale dei disturbi scheletrici si trova all’interno della regione analoga CH2 in FLNA. Queste mutazioni portano anche ad un ampio spettro di gravità fenotipica.13 Non c’è una semplice correlazione tra la posizione di queste mutazioni e la gravità dei difetti risultanti in ossificazione scheletrica. Mentre la sindrome otopalatodigitale di tipo 1 si manifesta in modo più lieve rispetto alla sindrome otopalatodigitale di tipo 2, queste condizioni possono derivare da sostituzioni in residui vicini l’uno all’altro o anche allo stesso residuo.13,17 L’osservazione che le mutazioni nel dominio di legame dell’actina di FLNB possono anche portare ad un ampio spettro di gravità ricapitola questo modello. La sostituzione prevista dalla mutazione trovata nell’individuo 1, L171R, è in prossimità del sito di una sostituzione (A173V), causativa dell’AOI.14 Allo stesso modo, la sostituzione S235P qui riportata è all’interno dello stesso fold proteico di E227K, una sostituzione associata al fenotipo meno grave e non letale, la sindrome di Larsen.14 Nonostante i rapporti di sostituzioni associate alla malattia nei residui all’interno del CH2 del dominio di legame all’actina della distrofina, dell’α-actinina-4,17 della filamina A,13 e della filamina B,14 un ruolo funzionale per questa piega proteica non è stato definitivamente chiarito. Poiché i domini CH2 non possiedono alcuna proprietà innata di legame all’actina, è stato postulato che il ruolo del CH2 nel legame all’actina sia, nella migliore delle ipotesi, indiretto.18

Le filamine agiscono principalmente per stabilizzare l’actina all’interno della cellula, sia come fasci paralleli che come reti ortogonali in gel.19,20 Sono stati identificati molteplici partner di legame per la filamina A, la maggior parte dei quali si associa attraverso le ripetizioni 16-24 della filamina (riviste in Stossel et al21). È stato dimostrato che cinque partner di legame si associano alla filamina B: actina, FBLP-1,22 presenilina (PS1 e PS2),23 e GPIβα.24 Resta da vedere se le mutazioni all’interno dei domini di legame all’actina delle filamine A e B esercitano il loro effetto patogeno principalmente disturbando il legame all’actina o attraverso una dipendenza funzionale tra l’associazione all’actina e le interazioni di legame con altre proteine.

Cellule giganti multinucleate si trovano tra i condrociti nella piastra di crescita di individui con displasia boomerang. Queste apparenze potrebbero derivare da una scissione cellulare difettosa durante la proliferazione dei condrociti nella placca di crescita epifisaria. In precedenza abbiamo dimostrato l’espressione diffusa di FLNB all’interno della placca di crescita e in particolare nel solco di clivaggio dei condrociti in divisione.14 Il processo di scissione cellulare alterato che porta sia al modello scheletrico difettoso che alla mineralizzazione nel gruppo di disturbi della displasia a boomerang/atelosteogenesi rimane da chiarire.

L’identificazione delle mutazioni che causano la displasia a boomerang in FLNB conferma la displasia a boomerang come parte dello spettro della condrodisplasia che include AOI e III, e la sindrome di Larsen non letale. La sovrapposizione fenotipica tra la displasia a boomerang e AO, come riportato qui e in precedenza, e la colocalizzazione delle mutazioni alla base di queste malattie negli esoni che codificano il dominio di legame dell’actina di FLNB è indicativa di uno spettro clinicopatologico per questi disturbi. Questo ulteriore ampliamento dello spettro fenotipico associato a mutazioni in FLNB evidenzia l’importanza di un citoscheletro di actina funzionale per molti processi morfogenetici normali, compresa la scheletrizzazione.