Il cosa, il perché e il come della coltura di espianti

Che cos’è la coltura di espianti e perché dovrei usarla?

La coltura di espianti è la coltura di piccoli pezzi di tessuto rimossi chirurgicamente da tessuti o organi animali. È un metodo utile per diverse ragioni.

1. Il mantenimento dell’architettura istotipica e delle proprietà biochimiche delle cellule significa che assomiglia più da vicino al tessuto in vivo rispetto alle linee cellulari stabilite.
2. I tessuti espiantati mantengono le proprie citochine e fattori di crescita, il che significa che la proliferazione è meno stressante e più biologicamente rilevante.
3. Le cellule che migrano dall’espianto sono in comunicazione molecolare con le cellule compagne dell’espianto, questo fornisce segnali biochimici e biomeccanici cruciali che sono essenziali per la morfogenesi dei tessuti, la differenziazione e l’omeostasi.

Quando posso usare questo metodo?

La coltura dell’impianto è usata per stabilire una varietà di linee cellulari da diverse fonti tra cui mammiferi, roditori e uccelli. Poiché le colture assomigliano più da vicino alla situazione in vivo delle cellule, questa tecnica è utile in un’ampia varietà di applicazioni, tra cui l’ottenimento di cellule staminali, la ricerca sul cancro, l’ingegneria genetica, la produzione di vaccini, lo screening dei farmaci e i test tossicologici.

Come si esegue una coltura di espianto?

Raccogliere l’espianto

Un espianto può essere ottenuto chirurgicamente utilizzando attrezzature sterili da mammiferi, roditori o organi o tessuti aviari. Per esempio, un pezzo di tessuto gengivale dopo l’estrazione di un dente può essere rimosso come espianto per stabilire i fibroblasti gengivali umani o un pezzo di tessuto adiposo può essere usato per stabilire le cellule staminali mesenchimali.

Tagliare e pulire l’espianto

Una volta ottenuto il tessuto è il momento di tagliarlo e pulirlo. Si vuole prima metterlo in una capsula di Petri contenente circa 1-2 mL di mezzo incompleto (mezzo senza siero). Poi, utilizzando una lama chirurgica affilata, si può tagliare (di solito circa 1 × 1 mm pezzi). Raccogliere i pezzi di espianto usando una pinza sterile e lavare delicatamente. Il lavaggio può essere fatto trasferendo i pezzi in una provetta da centrifuga contenente circa 0,5 mL di mezzo incompleto. Mescolare delicatamente pipettando il mezzo 4 o 5 volte, e permettere ai pezzi di stabilirsi e rimuovere il mezzo superiore. Questo può essere ripetuto 2 o 3 volte.

Coltivazione degli espianti

Questi espianti ottenuti sono posti asetticamente su una superficie rivestita e lasciati attaccare alla superficie in presenza di un terreno di coltura ricco. Questo è di solito un mezzo minimo basale, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) o Minimum Essential Medium Eagle (MEM) integrato con il 10-15% di siero. Gli espianti sono poi coltivati in condizioni standard di coltura di tessuti (pH 7.2-7.4, temperatura 37°C, 5% CO2 e umidità) per permettere la migrazione e la proliferazione delle cellule.

È necessario cambiare il terreno ogni 3 giorni senza disturbare gli espianti. A seconda della salute e dell’età del tessuto, le cellule emergono dall’espianto entro 15-30 giorni. Una volta che la crescita delle cellule inizia dall’espianto, aggiungi 5 mL di terreno alla beuta nei giorni successivi.

Subcultura e creazione di una linea cellulare

Dopo che gli espianti sono completamente circondati dalle cellule, puoi tripsinizzare le cellule e subcoltivarle. E’ meglio usare una concentrazione più bassa di tripsina (per esempio <0,25% di tripsina per 5 min). Scegliere una dimensione appropriata del pallone per la semina, a seconda del numero totale di cellule ottenute.

Sfide nella cultura dell’espianto

Mentre gli espianti sono ottimi da usare ci sono alcuni ostacoli che è necessario superare prima di lavorare con loro. Le sfide principali sono:

• le cellule richiedono tempo per emergere dall’espianto, quindi la creazione di una linea cellulare potrebbe richiedere circa un mese
• la possibilità di contaminazione da espianto
• la generazione di cellule eterogenee o una popolazione mista di cellule.

Ma non preoccupatevi, ecco alcuni semplici consigli per superare questi problemi.

Le cellule più giovani crescono più velocemente

Se volete ottenere le vostre cellule più velocemente (entro 15 giorni), assicuratevi di raccogliere l’espianto da un donatore sano e giovane. Poiché le cellule più giovani si dividono e crescono più velocemente, mantengono la loro caratteristica crescita anche in vitro, quindi le possibilità di ottenere rapidamente le cellule dall’espianto sono molto alte.

Evitare la contaminazione

La contaminazione dovuta all’espianto può essere evitata immergendo il pezzo di tessuto in una soluzione di povidone-iodio per 2 o 3 minuti. Rimuovere il residuo di povidone-iodio sciacquando l’espianto in una soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7.4). Si può poi mettere l’espianto in un mezzo minimo incompleto e separare i tessuti duri o morti se ce ne sono.

Ottenere una popolazione di cellule omogenee da una eterogenea

Di solito, nella coltura di espianti si osservano cellule eterogenee nei primi passaggi. Per superare questo problema, applicate la vostra conoscenza della morfologia e del modello di crescita delle cellule che vi interessano. Nel caso della coltura di espianto di tessuto gengivale, le cellule di fibroblasti gengivali a forma di fuso emergono per prime dall’espianto, prima della comparsa delle cellule di cheratinociti gengivali.

I cheratinociti gengivali hanno una morfologia che va dall’ovale al ciottolato, iniziano ad apparire una settimana dopo che le cellule fibroblaste sono emerse dall’espianto e crescono sopra il monostrato di cellule fibroblaste (Figura 1).

Figura 1. Propagazione di cellule di fibroblasti gengivali umani con cheratinociti appena emergenti dal tessuto espiantato gengivale

Se l’obiettivo è quello di stabilire una linea cellulare di fibroblasti gengivali dal tessuto gengivale, lasciare che la beuta diventi confluente con cellule di fibroblasti e poi immediatamente subculturarla. Poiché le cellule cheratinocitarie sono meno numerose, scompaiono nei successivi 3 o 4 passaggi (Figura 2).

Figura 2. Un monostrato di cellule di fibroblasti gengivali umani

Se l’obiettivo è quello di stabilire cellule di cheratinociti dall’espianto gengivale, raschiare le cellule di fibroblasti e aggiungere un mezzo specifico per cheratinociti alla beuta in modo da sostenere solo la crescita dei cheratinociti.

Il metodo dell’impianto è una tecnica semplice e conveniente usata per stabilire linee cellulari che hanno proprietà istoliche, biochimiche e biomeccaniche simili a quelle in vivo. Pertanto, questo metodo è accettato e ampiamente utilizzato in biologia cellulare e molecolare. Utilizzi la coltura di espianti nel tuo laboratorio? Lo prenderesti in considerazione? Lascia un commento qui sotto.