ENU

Cilia in Vertebrate Cell-Cell Signaling

Nel 2003, uno schermo di mutagenesi ENU ha inaspettatamente implicato le ciglia primarie e IFT nella segnalazione di Shh: Le mutazioni di IFT nei topi hanno portato a fenotipi del tubo neurale e delle gemme degli arti simili a quelli che risultano dall’interruzione del percorso di Shh (Huangfu et al., 2003). Le ciglia primarie sono non-motili, organelli basati su microtubuli che sporgono dalla maggior parte delle cellule dei vertebrati. Si estendono da corpi basali e consistono di membrane specializzate (strutturalmente segregate dalla membrana plasmatica) intorno a un assonema centrale lungo il quale il macchinario IFT facilita il trasporto retrogrado e anterogrado tra la base e la punta ciliare. L’interruzione della ciliogenesi o dell’IFT provoca un ampio spettro di sindromi ciliopatiche umane. I difetti primari del disordine ciliare includono polidattilia, malformazioni craniofacciali e cerebrali, situs inversus, malattia policistica del rene, obesità, diabete e difetti sottili nel fegato, milza e cuore (Nigg e Raff, 2009; Goetz e Anderson, 2010; Hildebrandt et al, 2011).

La ciliogenesi e lo smontaggio delle ciglia primarie sono strettamente legati al meccanismo del ciclo cellulare: le ciglia primarie sono presenti sulle cellule quiescenti ma il loro smontaggio è necessario per la transizione al ciclo cellulare. La segnalazione Fgf e Wnt sono richieste a monte della ciliogenesi in diversi contesti di vertebrati, tra cui il nodo/vescicola di Kupffer (KV), vescicole ottiche e dotti pronefrici (Basu e Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Bersagli trascrizionali di queste vie di segnalazione che mediano la formazione delle ciglia, patterning, o funzione includono Ift88, Enc1-like, e le TF ciliogenetiche Foxj1 e Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Esperimenti di epistasi studiando KV hanno suggerito che la segnalazione Wnt funzioni a valle di Fgfs nella ciliogenesi (Caron et al., 2012).

Nei vertebrati, la via di Shh utilizza le ciglia come un organello di segnalazione specializzato in cui IFT media i cambiamenti nella localizzazione delle proteine essenziali per l’elaborazione Gli e le conseguenti risposte trascrizionali (Figura 1.1B). Il recettore Hh Patched (Ptc) è alla base del cilium primario in assenza di Hh. In presenza di Hh, Ptc esce dal cilium ed entra Smo, e c’è un aumento della punta localizzata Gli. I complessi Gli-Sufu sono arricchiti nelle punte delle ciglia primarie in un modo Smo-dipendente e devono essere dissociati per l’attivazione della via di Shh (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, il cui ortolano promuove l’elaborazione di Ci/Gli e antagonizza Sufu in Drosophila, subisce il trasporto anterogrado indotto da Hh dalla base del cilium alla punta. PKA, che fosforila Gli come prerequisito per la proteolisi a GliR, si localizza alla base delle ciglia primarie e regola i livelli di Gli localizzati in punta (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studi su Shh e cilia/IFT hanno indicato che alcuni tratti di ciliopatia umana sono probabilmente dovuti a una segnalazione Shh interrotta. Inoltre, i difetti ciliari possono aumentare o sopprimere l’oncogenesi a causa delle mutazioni del percorso di Shh (Han et al., 2009). I mutanti Cilia/IFT spesso assomigliano ai mutanti LOF o GOF Shh a causa dei requisiti specifici del contesto per l’elaborazione mediata dalle ciglia di Gli a GliA o GliR, rispettivamente. I fenotipi caratteristici includono la ventralizzazione del tubo neurale (che utilizza GliR) e la polidattilia (le gemme degli arti utilizzano GliA; discusso in Goetz e Anderson, 2010). Le mutazioni nei geni IFT e delle ciliopatie hanno aiutato a identificare nuovi contesti in cui le ciglia sono richieste per la segnalazione cellulare dello sviluppo. In alcuni casi, questi esperimenti hanno fatto luce sulle eziologie di tratti di ciliopatia umana poco conosciuti. Per esempio, gli studi su Rpgrip11 (un gene della ciliopatia umana) e sui topi mutanti Ttc21b hanno dimostrato l’importanza delle cilia primarie nel mediare i segnali di Shh nel proencefalo ventrale. I mutanti Ttc21b hanno cilia primarie anormali con un trasporto retrogrado parzialmente difettoso ma un trasporto anterogrado funzionale. Questo risulta in un fenotipo GOF come evidenziato dall’accumulo di macchinari di segnalazione Shh nelle punte delle ciglia e dall’espansione dell’espressione/attività di Shh nel telencefalo ventrale e nella zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). I mutanti Rpgrip1l hanno cellule neuroepiteliali del proencefalo che mancano di ciglia primarie e sono carenti nella produzione di Gli elaborati, come previsto per Shh LOF (Besse et al., 2011). Queste mutazioni risultano entrambe nell’espansione del sottopallio a spese del pallio, simile ai mutanti Gli3, perché l’output predominante della segnalazione Shh nel proencefalo ventrale è l’elaborazione di Gli3 nella sua forma repressiva (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Se la proteina Gli3R attiva viene introdotta geneticamente, allora le ciglia sono dispensabili in questo contesto (Besse et al., 2011). Difetti nel patterning del proencefalo ventrale possono essere alla base dei disturbi cognitivi in alcune ciliopatie.

I difetti legati a Shh non rappresentano tutti i fenotipi nelle ciliopatie umane. È diventato evidente che le IFT/cilia sono usate in alcuni contesti per facilitare la segnalazione da altre vie. Durante lo sviluppo della pelle dei mammiferi, le ciglia primarie sono essenziali per la differenziazione terminale delle cellule soprabasali, un processo iniziato dalla segnalazione Notch/Delta (Figura 1F; Blanpain et al., 2006). In ∼60-70% delle cellule soprabasali, Notch è concentrato nelle membrane ciliari primarie, e presenilina, una proteina del complesso γ-secretasi che scinde Notch, è localizzato a corpi basali (Ezratty et al., 2011). L’abbattimento dei geni IFT o l’eliminazione delle ciglia in vivo si traduce in una diminuzione dell’attività del reporter di Notch e in una compromissione della differenziazione cellulare soprabasale. Inoltre, NICD, la forma attiva scissa di Notch, è stata osservata nei nuclei di cellule ciliate ma non unciliate in chimere genetiche (Ezratty et al., 2011).

Le ciglia sono state anche implicate nella segnalazione PDGF. Nei fibroblasti in coltura, PDGFRα è stato osservato nelle membrane delle ciglia primarie, e le proteine di trasduzione del segnale attivate da RTK MEK1/2 e Akt sono localizzate lungo il cilium e alla base ciliare, rispettivamente (Schneider et al., 2005). Studi su fibroblasti wild type e mutanti Ift88 (senza ciglia primarie) hanno indicato che le ciglia primarie delle cellule leader si orientano verso i siti di ferita e sono necessarie per la chemiotassi indotta da PDGF-AA e le risposte di fosfo-Akt in vitro (Schneider et al., 2010). In particolare, i topi mutanti Ift88 mostrano difetti nella riparazione delle ferite (Schneider et al., 2010). La segnalazione di PDGF attraverso PDGFRα è stata anche implicata nello smontaggio delle ciglia e nella transizione di fase G1-S (discussa in Christensen et al., 2012), anche se il significato in vivo di questa osservazione non è ancora noto.

Il ruolo delle ciglia nella segnalazione Wnt canonica è stato controverso (rivisto in Wallingford e Mitchell, 2011). Studi su topi mutanti Ift88 e Ift72 e su zebrafish hanno suggerito che le ciglia non sono essenziali per la segnalazione Wnt durante l’embriogenesi, e gli studi sulla segnalazione Wnt nei topi mutanti Kif3a hanno dato risultati contrastanti (Huang e Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Nei mutanti IFT retrogradi, un gruppo non ha riportato alcun cambiamento nella segnalazione Wnt, mentre un altro gruppo ha dimostrato una diminuzione dell’attività Wnt in contesti che mantengono le ciglia ma un aumento della segnalazione Wnt in contesti che hanno perso le ciglia (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Gli studi sulle proteine ciliari/ciliopatie Inversin, Chibby e Jouberin supportano il ruolo delle cilia nella segnalazione Wnt canonica in specifici contesti di sviluppo. Inversina, che è mutata in pazienti umani con nefronoftisi di tipo II, è espressa nelle monociglia dei vertebrati, interagisce fisicamente con Disheveled (Dsh), e interrompe la segnalazione canonica Wnt a valle di Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Topi mutanti Inversin mostrano fenotipi di patterning renale e capelli che ricordano i fenotipi Wnt/Frz, così come fenotipi di patterning sinistra-destra probabilmente dovuti a difetti nella funzione monocilia nodo (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, una proteina del corpo basale richiesta per la ciliogenesi e l’aggancio del corpo basale, interagisce fisicamente con β-catenina e regola negativamente la segnalazione Wnt canonica negli embrioni di Drosophila, negli epiteli polmonari dei mammiferi e nelle cellule coltivate dei mammiferi (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Infine, la proteina ciliopatica umana Jouberin è richiesta nei topi per la normale segnalazione e proliferazione Wnt alla linea mediana cerebellare. Questo probabilmente contribuisce al difetto di fusione dell’emisfero cerebellare osservato nei pazienti umani con sindrome di Joubert e nei topi carenti di Jouberin (Lancaster et al., 2011a). Nelle cellule ciliate esposte a Wnt, Jouberin è sequestrato con β-catenina a corpi basali in un modo IFT-dipendente. Jouberin facilita la traslocazione nucleare di β-catenina; il suo sequestro nei corpi basali ostacola la traslocazione nucleare di β-catenina e smorza le risposte canoniche di segnalazione Wnt (Lancaster et al., 2011b). Insieme, questi risultati suggeriscono che le ciglia non sono richieste globalmente per la segnalazione Wnt durante l’embriogenesi, ma hanno un impatto sui risultati della segnalazione Wnt in contesti selezionati. Un modello alternativo è che le ciglia mostrano una specificità del percorso (come fanno i citonemi, discussi più avanti) e quindi limitano la reattività cellulare e/o segregano spazialmente le risposte di segnalazione. La pathway-specificity della segnalazione ciliare potrebbe essere mediata da un diverso targeting delle proteine di segnalazione alle cilia, e/o dall’utilizzo di sottoinsiemi distinti di proteine IFT o adattatori specifici per il trasporto dell’assonema (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).