Effetti della cicloeximide sull’interpretazione degli esperimenti di profilo ribosomico in Schizosaccharomyces pombe

Disegno sperimentale e riproducibilità

Per esaminare gli effetti del CHX sugli esperimenti di profilo ribosomico abbiamo applicato questa tecnica a S. pombe in crescita esponenziale (senza stress) e dopo 1 ora di inedia di azoto (stress nutrizionale). Ogni cultura è stata divisa in due, e una di esse è stata incubata con CHX a una concentrazione di 100 µg/ml per 5 minuti prima della raccolta (questa è la concentrazione “standard” utilizzata nella maggior parte degli esperimenti pubblicati). Le cellule sono state raccolte per filtrazione e immediatamente congelate in azoto liquido per evitare ulteriori traduzioni. Si noti che CHX era presente nei buffer di lisi per tutti i campioni. Pertanto, tutti i riferimenti al trattamento CHX sotto si applicano solo alla sua aggiunta al mezzo di coltura. Abbiamo eseguito due repliche biologiche indipendenti per ciascuno dei quattro esperimenti (più / meno azoto, più / meno CHX). Per ogni campione, abbiamo preparato e isolato frammenti protetti dal ribosoma (RPFs o impronte di ribosomi) come descritto nei metodi, e li abbiamo analizzati utilizzando il sequenziamento Illumina ad alta velocità. Abbiamo anche sequenziato l’RNA impoverito di rRNA da ciascuno degli otto campioni (RNA-seq). Per valutare la riproducibilità della tecnica abbiamo quantificato per ogni esperimento il numero di letture RPF e RNA-seq che mappavano ogni sequenza codificante annotata del genoma di S. pombe. I dati sono stati altamente riproducibili, con correlazioni medie tra replicati biologici indipendenti di 0,97 (Tabella 1). Ci concentriamo di seguito su come CHX colpisce esperimenti di profilazione del ribosoma. Un’analisi più completa della biologia della risposta delle cellule di S. pombe alla fame di azoto sarà pubblicata altrove.

Per studiare gli effetti del CHX abbiamo esaminato quattro aspetti della traduzione: 1] densità ribosomiale totale per le sequenze codificanti dei singoli geni, 2] presenza di ribosomi sulle sequenze leader 5′, 3] distorsioni nella posizione dei ribosomi nelle sequenze codificanti e 4] distribuzione dei ribosomi lungo i singoli codoni.

Densità dei ribosomi

Abbiamo quantificato il numero di letture RPF sulle sequenze codificanti per ogni gene annotato in cellule trattate con CHX o trattate con mock. In condizioni di fame di azoto la correlazione tra i due trattamenti era molto alta (media R = 0,96), ma ~ 4,5% di tutti i geni ha mostrato una densità ribosomiale costantemente superiore in presenza di CHX (2 volte o superiore in entrambi i replicati, Fig. 1a e Fig. S1 supplementare). Cambiamenti simili non sono stati osservati nei campioni di mRNA (media R = 0,98), indicando che questo effetto era dovuto ad alterazioni nella traduzione e non nel trascrittoma (Fig. 1a, Supplementary Fig. S1).

Effetti di CHX su densità ribosomiale complessiva su sequenze codificanti. (a) Grafici di dispersione che confrontano i livelli di mRNA (in alto) e le densità dei ribosomi (in basso) tra le cellule non trattate e quelle trattate con CHX. I dati sono presentati per le cellule che crescono in presenza di una fonte di azoto (+N) o affamati di azoto (-N). I geni che codificano le proteine ribosomiali sono mostrati in verde. Tutti i dati sono stati normalizzati a RPKMs (Reads Per Kilobase per milioni di letture mappate). (b) A sinistra: Boxplot che confronta le densità ribosomiali tra le cellule non trattate e trattate con CHX per gruppi di geni delle lunghezze medie indicate delle sequenze codificanti. Destra: dati simili per le lunghezze indicate di 5′ sequenze leader. Le caselle rosse mostrano il comportamento degli mRNA che codificano le proteine ribosomiali. (C) Confronto dei cambiamenti nei livelli di mRNA e densità ribosomiali tra le cellule affamati di azoto (-N) e cellule non stressati (+N). I dati sono presentati per le cellule trattate con CHX (a sinistra) e per le cellule non trattate (a sinistra). I geni che codificano le proteine ribosomiali sono mostrati in verde.

Sorprendentemente, questo gruppo includeva la maggior parte dei geni che codificano le proteine ribosomiali (RPs, Fig. 1a e Fig. S1 supplementare, punti verdi). Per escludere la possibilità che CHX provoca sottili alterazioni nei livelli di mRNA, abbiamo confrontato i cambiamenti indotti dalla fame di azoto in presenza o in assenza di CHX (Fig. supplementare S2). Il fold-change mediano nei livelli di mRNA per i geni RP era 0,25 nei campioni trattati con CHX e 0,24 nelle cellule non trattate, confermando che le alterazioni nella densità ribosomiale dei geni RP sulla fame di azoto sono dovute a cambiamenti nella traduzione.

I geni RP sono generalmente piuttosto brevi, con una lunghezza mediana di 447 nucleotidi rispetto a 1.131 per tutti i geni. Pertanto, una semplice spiegazione per questo arricchimento potrebbe essere che CHX impedisce il “run-off” dei ribosomi dai geni brevi durante la raccolta delle cellule, aumentando così la loro densità apparente di ribosomi. Tuttavia, anche se c’era una piccola tendenza verso la densità ribosomiale nei geni più brevi per essere più alto in presenza di CHX, questo era un effetto minore e non poteva spiegare il comportamento dei geni proteina ribosomiale (Fig. 1b). Gli mRNA codificati da questi geni tendono anche ad avere sequenze leader 5′ più brevi (una mediana di 68.5 nucleotidi contro 173 per tutti i geni), ma non c’era alcuna correlazione generale tra le lunghezze leader 5′ e densità ribosomica superiore in CHX (Fig. 1c). Solo 9 geni codificati nucleare (~ 0,2%) ha mostrato una riduzione della densità ribosomiale in CHX (Fig. 1a e Supplementary Fig. S1), e mancava qualsiasi caratteristica comune.

Al contrario, in condizioni di non stress, il farmaco ha avuto un effetto molto debole sulla densità ribosomiale (media R = 0,98), con meno di 1% dei geni che mostrano differenze di densità superiore a 2 volte (23 geni più alti in CHX e 9 inferiori, Fig. 1a e Supplementary Fig. S1). È interessante notare che il piccolo gruppo di geni che hanno mostrato densità inferiori nelle cellule trattate con CHX era anche arricchito in geni della proteina ribosomiale (12/23 mRNA).

Concludiamo che gli mRNA che codificano RPs sono particolarmente sensibili alla presenza di CHX, e che questo fenomeno non può essere spiegato solo dal loro leader 5′ breve e sequenze codificanti. Inoltre, l’effetto è forte solo sotto stress nutrizionale. Tuttavia, questi risultati non rivelano quale dei due campioni (trattato con CHX o non trattato) riflette meglio la situazione in vivo. Per esempio, i geni RP sono ricchi di codoni ottimali, il che implica che l’allungamento della traduzione avviene ad alta velocità. Questa proprietà, insieme alla loro breve lunghezza, potrebbe renderli più sensibili al deflusso dei ribosomi durante la raccolta. In questo caso, il CHX stabilizzerebbe la distribuzione in vivo. In alternativa, è anche possibile che il CHX abbia un effetto diretto sulla traduzione di questi mRNA, portando a densità ribosomiali non fisiologiche.

Abbiamo quindi esaminato se i cambiamenti nella densità ribosomiale causati dal CHX avrebbero influenzato l’interpretazione della risposta traslazionale/trascrizionale alla fame di azoto. Abbiamo quantificato le efficienze traslazionali (TE) normalizzando i conteggi RPF per i livelli di mRNA, e abbiamo calcolato il cambiamento log in TE e i livelli di trascrizione tra le cellule cresciute in mezzo contenente azoto e le cellule private dell’azoto (Fig. 1c e Fig. S1B supplementare). In presenza di CHX, la fame di azoto ha portato ad una chiara down-regolazione dei livelli di mRNA che codificano RPs, ma non ha influenzato il loro TE. Al contrario, negli esperimenti eseguiti in assenza di CHX questi mRNA sembravano essere down-regolati sia a livello di mRNA che di TE. Così, la pre-incubazione con CHX nel mezzo può influenzare la TE di gruppi specifici di geni. L’abbondanza degli mRNA che codificano gli RP è strettamente co-regolata22,23,24; i nostri risultati dimostrano che questi mRNA mostrano anche un comportamento coordinato a livello di efficienza traslazionale. La ragione dell’estrema sensibilità di questi mRNA al CHX rimane da chiarire.

Per la maggior parte dei geni, però, il trattamento con CHX non ha alcun effetto sulla densità ribosomiale indipendentemente dalle condizioni di crescita. Risultati simili sono stati riportati per le cellule di mammifero coltivate in coltura, con CHX che non ha alcun effetto significativo sulla densità dei ribosomi specifici del gene. Tuttavia, questo è stato esaminato solo in cellule non stressate13.

Cambiamenti nell’uso di upstream Open Reading Frames

cellule S. cerevisiae visualizzare un accumulo di impronte di ribosoma in 5′ sequenze leader che è aumentato in condizioni di stress, suggerendo un maggiore utilizzo di uORFs1, 9, 10. Tuttavia, queste conclusioni sono state contestate e attribuite all’uso di CHX in coltura cellulare 8.

Per affrontare questa domanda in S. pombe abbiamo confrontato l’accumulo di legge in 5′ leader e sequenze codificanti (Fig. 2a) prima e dopo la fame di azoto. Abbiamo inizialmente quantificato questo valore misurando il rapporto tra il numero totale di impronte di ribosomi in 5′ leader e in sequenze codificanti. L’inedia di azoto nelle cellule trattate con CHX ha causato un aumento medio di 5,5 volte, mentre le cellule non trattate avevano un incremento medio di 2,1 volte (entrambi gli arricchimenti erano coerenti tra i replicati biologici, Fig. 2b). Come rapporti totali potrebbe essere dominato da cambiamenti in un piccolo numero di geni altamente abbondanti, abbiamo anche quantificato i rapporti tra le impronte in 5′ leader e sequenze codificanti per tutti i trascritti individuali che hanno superato la soglia di espressione (vedi metodi per i dettagli, e Fig. 2c e Supplementary Fig. S3 per i risultati). Coerentemente con il risultato precedente, c’è stato un chiaro aumento delle impronte ribosomiche in sequenze leader 5′ su inedia di azoto per la maggior parte dei geni (Fig. 2c e Supplementary Fig. S3; nota l’aumento nella seconda replica è più piccolo, ma ancora significativo), con rapporti di aumento medio di 3.8 e 1.9 per più / meno CHX, rispettivamente (Fig. 2d, nota il comportamento simile di entrambi i replicati). Così, in contrasto con i risultati S. cerevisiae, 5′ leader densità ribosomiali sono stati aumentati da stress nutrizionale in ogni esperimento, anche se l’effetto è stato sostanzialmente più alto in CHX-trattati cellule. Un possibile avvertimento è, naturalmente, che lo studio S. cerevisiae utilizzato un diverso tipo di stress8. Tuttavia, dato che qualche accumulo è osservato sia con e senza trattamento di droga, possiamo concludere che in S. pombe azoto fame porta a maggiori densità ribosomale su 5′ sequenze leader. Questo aumento di densità può essere dovuto alla traduzione di uORFs, anche se non possiamo escludere che riflette un aumento del rumore nei campioni stressati. Supplementare Fig. S4 presenta due esempi di uORFs indotte in risposta alla fame di azoto. L’importanza biologica e la base meccanicistica di questo fenomeno (così come se è generale a tutte le condizioni di stress) è ancora sconosciuta.

Effetti di CHX sulla densità dei ribosomi sulle sequenze leader 5′. (a) Disegno sperimentale: RPFs in sequenze codificanti (CDS) e 5′ sequenze leader sono quantificati in diverse condizioni sperimentali. (B) Rapporto di totale legge mappatura delle sequenze leader 5′ al totale legge mappatura delle sequenze codificanti (CDS) per le cellule non stressate (+N) e cellule affamate di azoto (-N), e per le cellule trattate o non trattate con CHX (±CHX). I numeri indicano la differenza di fold tra coppie di campioni -N e +N. I dati sono presentati per due replicati biologici. (C) Scatter plot confrontando il rapporto di legge mappatura a 5′ sequenze leader a legge mappatura di sequenze codificanti (CDS) per i singoli geni, ogni trama confronta le cellule non stressate (+N) e cellule affamati di azoto (-N). I dati sono presentati per le cellule trattate con CHX (sinistra) o non trattate (destra). Le linee rosse corrispondono a un rapporto di 1. (d) Valori medi per i rapporti presentati in (c). I numeri indicano il fold-differenza tra coppie di campioni -N e +N. I dati sono visualizzati per due replicati biologici.

Distribuzione dei ribosomi lungo le sequenze codificanti

Le cellule di S. Le cellule di S. cerevisiae mostrano una distribuzione asimmetrica dei ribosomi lungo le sequenze codificanti, con un ampio picco di maggiore occupazione dei ribosomi nei ~300-400 nucleotidi iniziali della sequenza codificante1, 9, 14, 20 che è fortemente potenziata da diversi stress1, 8, 12.

Abbiamo studiato questo fenomeno in S. pombe in due modi: in primo luogo, calcolando il rapporto tra le impronte nei nucleotidi da 10 a 400 e da 401 a 800 (Fig. 3a-c, i primi 9 nucleotidi non sono stati considerati per evitare distorsioni create dall’accumulo di ribosomi all’AUG iniziale); in secondo luogo, esaminando il comportamento di un metagene che rappresenta la densità dei ribosomi a livello di genoma lungo le sequenze codificanti (Fig. 3d e Fig. supplementare S5).

Effetti del CHX sulla distribuzione dei ribosomi lungo le sequenze codificanti. (a) Disegno sperimentale: Gli RPF sui nucleotidi da 10 a 400 e sui nucleotidi 401-800 sono quantificati in diverse condizioni sperimentali e viene calcolato il rapporto tra i due numeri. (b) Rapporti medi calcolati come descritto in A per tutte le sequenze codificanti, in presenza e assenza di una fonte di azoto (±N) e in presenza e assenza di trattamento con CHX (±CHX). I numeri indicano la fold-differenza tra i campioni appaiati -N e +N. I dati sono presentati per due repliche biologiche. (c) Scatter plot confrontando i rapporti ottenuti come definito in A per i singoli geni; ogni trama confronta le cellule non stressate (+N) e cellule affamate di azoto (-N). I dati sono presentati per le cellule trattate con CHX (sinistra) o non trattate (destra). Le linee rosse corrispondono a un rapporto di 1. (d) Metagene visualizzazione distribuzioni medie di RPFs lungo sequenze codificanti in quattro condizioni sperimentali. Una finestra in esecuzione di 60 nucleotidi è stato utilizzato per smussare le linee tracciate.

In assenza di stress, cellule S. pombe mostrato piccole spalle sia in presenza che in assenza del farmaco, simili a quelli riportati per S. cerevisiae senza CHX1, 14, 20 (Fig. 3d e Fig. supplementare S5). Su stress nutrizionale, S. pombe comportato in modo simile a S. cerevisiae 12. In presenza di CHX, c’era un chiaro accumulo di letture nella parte 5′ della sequenza codificante nella maggior parte dei geni (Fig. 3c e Supplementary Fig. S5, trama a sinistra), che si rifletteva anche in un ~ 2.0 volte aumento della densità media nei primi 400 nucleotidi del mRNA (Fig. 3b). Al contrario, questo aumento era trascurabile in assenza del farmaco, sia quando i singoli geni sono stati esaminati (Fig. 3c (trama destra) e Supplementary Fig. S5) e quando i rapporti medi sono stati misurati (Fig. 3b, nota entrambi i replicati comportato in modo coerente). Inoltre, la CHX-dipendenza dell’accumulo di letture su fame di azoto è stata confermata dai dati metagene (Fig. 3d e Fig. supplementare S5). Infine, abbiamo stabilito che questo effetto era specifico per RPFs, tracciando un metagene basato su dati mRNA-seq (Fig. supplementare S5).

Abbiamo anche considerato se queste osservazioni si applicassero anche ai geni più piccoli. Con questo scopo, abbiamo generato metagenes per i geni RP e per i geni piccoli (meno di 200 codoni) escludendo i geni RP. In entrambi i casi, il CHX ha causato un chiaro aumento sul lato 5′ delle sequenze codificanti (specialmente per i geni RP), che era dipendente sia dalla fame di azoto che dal trattamento con CHX (Fig. S5 supplementare).

Inoltre, c’era un accumulo di ribosomi sui codoni di iniziazione (Fig. S6 supplementare). Questa caratteristica era già presente nelle cellule non trattate, anche se è stata elevata con l’incubazione di CHX (sia nel controllo che nelle cellule affamate di azoto). Questo arricchimento era leggermente maggiore nelle cellule affette da azoto, indipendentemente dal trattamento con CHX (Fig. S6 supplementare).

Quindi, c’è un chiaro accumulo di ribosomi nella parte iniziale delle sequenze codificanti, conservato in S. pombe e S. cerevisiae, e che può essere osservato sia con che senza pretrattamento con CHX. Al contrario, il potenziamento indotto dallo stress non è osservato in modo coerente in assenza di CHX in entrambi i lieviti, e quindi non ci sono prove sufficienti per indicare che si verifica in vivo. In futuro, l’uso di strategie di cross-linking in vivo25 potrebbe aiutare a distinguere tra queste due interpretazioni.

Occupazione dei codoni

In linea di principio, l’occupazione ribosomiale normalizzata dei singoli codoni è legata al tempo che il ribosoma trascorre ad ogni codone, e quindi può essere usata per stimare i tassi di traduzione medi codone-specifici. Tuttavia, gli esperimenti iniziali per indagare questo fenomeno hanno prodotto risultati contrastanti17,18,19,20. Un elegante studio di Hussmann et al., che ha coinvolto nuovi esperimenti, metanalisi di numerosi esperimenti di profilazione del ribosoma da S. cerevisiae e modellazione matematica9, ha trovato che queste contraddizioni potrebbero essere spiegate dall’effetto di CHX sulla determinazione delle occupazioni del ribosoma codone-specifiche. Esperimenti di gruppi diversi eseguiti in presenza di CHX avevano occupazioni di codoni ribosomi simili tra loro, come quelli eseguiti senza il farmaco. Tuttavia, le correlazioni tra i saggi con CHX e quelli senza CHX erano molto basse. Inoltre, gli esperimenti con CHX hanno portato a tassi di traduzione specifici del codone che hanno mostrato correlazioni negative con l’abbondanza di tRNA cognato, mentre quelli che non hanno incluso il trattamento CHX ha mostrato le correlazioni positive previste9, 20. Hussmann et al. hanno proposto che i ribosomi non fermano la traduzione immediatamente in presenza di CHX nel mezzo. Invece, la traduzione continua per alcuni codoni con tassi di traduzione codone-specifici9, causando occupazioni codone artefatti.

Per indagare questo fenomeno abbiamo analizzato le occupazioni ribosomali codone-specifiche ai siti A come descritto nei metodi. In breve, abbiamo assegnato ogni lettura che ha mappato una sequenza codificante al sito A di un ribosoma (che corrisponde al nucleotide 16 di un frammento protetto dal ribosoma). Abbiamo poi calcolato l’occupazione normalizzata per ogni codone in tutto il genoma (dividendo la frequenza con cui il ribosoma è posizionato su ogni codone per l’abbondanza del codone sull’mRNA). In assenza di distorsioni, questo valore dovrebbe riflettere il tempo medio che il ribosoma trascorre su ogni codone.

Prima abbiamo confrontato l’effetto della CHX sulle occupazioni ribosomiali specifiche del codone (Fig. 4, Figure supplementari S7 e S8). Sorprendentemente, la correlazione tra i due esperimenti era molto alta, con valori medi di 0,82 per la fame di azoto (Fig. 4a e Fig. supplementare S7) e 0,86 per le cellule non stressate (Fig. 4b e Fig. supplementare S7). In confronti simili in S. cerevisiae, la maggior parte delle correlazioni erano negative9. Ad esempio, codoni rari come CCG (prolina) e CGG (arginina) aveva tra le più alte occupazioni in assenza di CHX, ma perso questo arricchimento in CHX-trattato campioni9. Al contrario, nel set di dati S. pombe sia CCG e CGG sono stati arricchiti indipendentemente dalla presenza di CHX (anche se meno fortemente in cellule non trattate, Fig. 4c e Supplementary Fig. S7). Inoltre, lo stress nutrizionale aveva pochissimo effetto sul codone-specifiche occupazioni ribosomiali sia in presenza (Fig. 4c e Supplementary Fig. S7, media R = 0.96) e in assenza di CHX (Fig. 4d e Fig. supplementare S7, media R = 0,98).

Effetti di CHX sulle occupazioni relative di codoni. Grafici di dispersione che visualizzano le occupazioni relative dei codoni ottenuti come descritto nei metodi. Ogni punto corrisponde a un singolo codone. I codoni di terminazione non sono visualizzati. Le posizioni dei codoni rari CCG e CGG sono indicate. Le linee tratteggiate corrispondono a differenze di 1,5 volte. Le correlazioni di Pearson tra le serie di dati sono indicate. (a) Confronto degli effetti del trattamento con CHX in cellule affamate di azoto. (b) Come in (a), per le cellule cresciute con una fonte di azoto. (c) Confronto degli effetti della fame di azoto in presenza di CHX. (d) Come in (c), in assenza di CHX.

Infine, abbiamo valutato la correlazione tra l’abbondanza di tRNA e le occupazioni codone-specifiche. Questo è stato fatto usando il tRNA Adaptation Index (tAI), che è una misura dell’uso del tRNA per ogni codone in parte basata sul numero di copie di tRNA (numeri più alti predicono una traduzione più efficiente)26. S. cerevisiae esperimenti eseguiti in presenza di CHX nella cultura mostrano correlazioni negative tra l’inverso del tAI (1/tAI) e codone specifiche occupazioni, prevedendo che i codoni con basso tAI (e quindi basse abbondanze tRNA) sarebbe tradotto più veloce. Al contrario, gli esperimenti con le cellule non pretrattate con CHX hanno mostrato la prevista correlazione positiva tra 1/tAI (anche se i valori effettivi erano molto variabili tra gli esperimenti) 9. In S. pombe, abbiamo trovato che in ciascuno degli otto esperimenti di profilo ribosomico occupazioni codone-specifiche visualizzato una correlazione positiva con 1/tAI, con una media di 0,39 (Tabella 2).

I nostri risultati mostrano che in S. pombe CHX ha un effetto relativamente minore sulla posizione dei ribosomi su codoni specifici. Questo potrebbe essere spiegato dal fatto che le cellule di S. pombe sono particolarmente sensibili al CHX, così che il CHX bloccherebbe i movimenti dei ribosomi più rapidamente e completamente che in S. cerevisiae. Questa proprietà impedirebbe il movimento dei ribosomi a tassi alterati (postulato che ha luogo in S. cerevisiae), e porterebbe a una situazione in cui le cellule di S. pombe trattate con CHX e quelle non trattate avrebbero distribuzioni di ribosomi simili allo stato stazionario. Tuttavia, il fatto che i codoni rari siano meno arricchiti in presenza di CHX suggerisce che il CHX dovrebbe essere omesso negli esperimenti volti a determinare le distribuzioni di ribosomi codone-specifiche.