Effets du cycloheximide sur l’interprétation des expériences de profilage des ribosomes chez Schizosaccharomyces pombe

Plan d’expérience et reproductibilité

Pour examiner les effets du CHX sur les expériences de profilage des ribosomes, nous avons appliqué cette technique à des S. pombe en croissance exponentielle (non stressées) et après une heure de privation d’azote (stress nutritionnel). Chaque culture a été divisée en deux, et l’une d’entre elles a été incubée avec du CHX à une concentration de 100 µg/ml pendant 5 minutes avant d’être collectée (il s’agit de la concentration  » standard′ utilisée dans la majorité des expériences publiées). Les cellules ont été collectées par filtration et immédiatement congelées au flash dans l’azote liquide pour éviter toute traduction ultérieure. Notez que la CHX était présente dans les tampons de lyse pour tous les échantillons. Ainsi, toutes les références au traitement à la CHX ci-dessous s’appliquent uniquement à son ajout au milieu de culture. Nous avons effectué deux répétitions biologiques indépendantes pour chacune des quatre expériences (plus/moins d’azote, plus/moins de CHX). Pour chaque échantillon, nous avons préparé et isolé des fragments protégés des ribosomes (FPR ou empreintes de ribosomes) comme décrit dans la section Méthodes, et nous les avons analysés en utilisant le séquençage Illumina à haut débit. Nous avons également séquencé l’ARN appauvri en ARNr de chacun des huit échantillons (RNA-seq). Pour évaluer la reproductibilité de la technique, nous avons quantifié pour chaque expérience le nombre de lectures RPF et RNA-seq qui correspondaient à chaque séquence codante annotée du génome de S. pombe. Les données étaient hautement reproductibles, avec des corrélations moyennes entre les réplicats biologiques indépendants de 0,97 (tableau 1). Nous nous concentrons ci-dessous sur la façon dont la CHX affecte les expériences de profilage des ribosomes. Une analyse plus complète de la biologie de la réponse des cellules de S. pombe à la privation d’azote sera publiée ailleurs.

Pour étudier les effets de la CHX, nous avons examiné quatre aspects de la traduction : 1] la densité ribosomale totale pour les séquences codantes de gènes individuels, 2] la présence de ribosomes sur les séquences de tête 5′, 3] les biais dans la localisation des ribosomes à travers les séquences codantes et 4] la distribution des ribosomes le long des codons individuels.

Densité ribosomale

Nous avons quantifié le nombre de lectures RPF sur les séquences codantes pour chaque gène annoté dans les cellules traitées avec CHX ou traitées par un simulateur. Dans des conditions de privation d’azote, la corrélation entre les deux traitements était très élevée (R moyen = 0,96), mais ~4,5% de tous les gènes ont montré une densité ribosomale constamment plus élevée en présence de CHX (2 fois ou plus dans les deux répétitions, Fig. 1a et Fig. S1 supplémentaire). Des changements similaires n’ont pas été observés dans les échantillons d’ARNm (R moyen = 0,98), indiquant que cet effet était dû à des altérations de la traduction et non du transcriptome (Fig. 1a, Fig. supplémentaire S1).

Effets du CHX sur les densités ribosomiques globales sur les séquences codantes. (a) Diagrammes de dispersion comparant les niveaux d’ARNm (en haut) et les densités de ribosomes (en bas) entre les cellules non traitées et traitées par la CHX. Les données sont présentées pour des cellules se développant en présence d’une source d’azote (+N) ou privées d’azote (-N). Les gènes codant pour les protéines ribosomiques sont représentés en vert. Toutes les données ont été normalisées en RPKMs (Reads Per Kilobase per Million mapped reads). (b) Gauche : Boxplots comparant les densités ribosomales entre les cellules non traitées et traitées au CHX pour les groupes de gènes des longueurs moyennes indiquées des séquences codantes. À droite : données similaires pour les longueurs indiquées des séquences de tête 5′. Les cases rouges affichent le comportement des ARNm codant pour les protéines ribosomiques. (c) Comparaison des changements des niveaux d’ARNm et des densités ribosomales entre les cellules privées d’azote (-N) et les cellules non stressées (+N). Les données sont présentées pour les cellules traitées au CHX (à gauche) et pour les cellules non traitées (à gauche). Les gènes codant pour les protéines ribosomiques sont indiqués en vert.

Surprenant, ce groupe comprenait la plupart des gènes codant pour les protéines ribosomiques (RP, Fig. 1a et Fig. S1 supplémentaire, points verts). Pour exclure la possibilité que la CHX provoque des altérations subtiles des niveaux d’ARNm, nous avons comparé les changements induits par la privation d’azote en présence ou en l’absence de CHX (figure supplémentaire S2). La variation médiane des niveaux d’ARNm pour les gènes RP était de 0,25 dans les échantillons traités par CHX et de 0,24 dans les cellules non traitées, ce qui confirme que les modifications de la densité ribosomique des gènes RP lors de la privation d’azote sont dues à des changements dans la traduction.

Les gènes RP sont généralement assez courts, avec une longueur médiane de 447 nucléotides contre 1 131 pour tous les gènes. Par conséquent, une explication simple de cet enrichissement pourrait être que le CHX empêche le « ruissellement » des ribosomes des gènes courts pendant la collecte des cellules, augmentant ainsi leur densité apparente de ribosomes. Cependant, bien qu’il y ait une petite tendance à ce que la densité ribosomique dans les gènes courts soit plus élevée en présence de CHX, il s’agissait d’un effet mineur qui ne pouvait pas expliquer le comportement des gènes de protéines ribosomiques (Fig. 1b). Les ARNm codés par ces gènes ont également tendance à avoir des séquences de tête 5′ plus courtes (une médiane de 68,5 nucléotides contre 173 pour tous les gènes), mais il n’y avait pas de corrélation globale entre les longueurs de tête 5′ et les densités de ribosomes plus élevées en présence de CHX (Fig. 1c). Seuls 9 gènes codés par le noyau (~0,2 %) ont montré une réduction de la densité des ribosomes dans le CHX (figure 1a et figure supplémentaire S1), et ils n’avaient aucune caractéristique commune.

En revanche, dans des conditions de non-stress, le médicament a eu un effet très faible sur la densité des ribosomes (R moyen = 0,98), avec moins de 1 % des gènes présentant des différences de densité supérieures à 2 fois (23 gènes plus élevés dans le CHX et 9 plus bas, figure 1a et figure supplémentaire S1). De manière intéressante, le petit groupe de gènes qui a affiché des densités plus faibles dans les cellules traitées au CHX était également enrichi en gènes de protéines ribosomiques (12/23 ARNm).

Nous concluons que les ARNm codant pour les RP sont particulièrement sensibles à la présence de CHX, et que ce phénomène ne peut pas être expliqué uniquement par leurs séquences 5′ de tête et codantes courtes. De plus, l’effet n’est fort que sous stress nutritionnel. Cependant, ces résultats ne révèlent pas lequel des deux échantillons (traité ou non traité à la CHX) reflète le mieux la situation in vivo. Par exemple, les gènes RP sont riches en codons optimaux, ce qui implique que l’élongation de la traduction se produit à grande vitesse. Cette propriété, associée à leur courte longueur, pourrait les rendre plus sensibles à l’écoulement des ribosomes pendant la collecte. Dans ce cas, la CHX stabiliserait la distribution in vivo. Alternativement, il est également possible que la CHX ait un effet direct sur la traduction de ces ARNm, conduisant à des densités ribosomiques non physiologiques.

Nous avons ensuite examiné si les changements de densité ribosomique causés par la CHX affecteraient l’interprétation de la réponse traductionnelle/transcriptionnelle à la privation d’azote. Nous avons quantifié les efficacités traductionnelles (TE) en normalisant le nombre de FPR par les niveaux d’ARNm, et calculé le changement logarithmique des TE et des niveaux de transcription entre les cellules cultivées dans un milieu contenant de l’azote et les cellules privées d’azote (Fig. 1c et Fig. supplémentaire S1B). En présence de CHX, la privation d’azote a entraîné une nette régulation à la baisse des niveaux d’ARNm codant pour les PR, mais n’a pas affecté leur TE. En revanche, dans les expériences réalisées en l’absence de CHX, ces ARNm semblent être régulés à la baisse tant au niveau de l’ARNm que du TE. Ainsi, la pré-incubation avec CHX dans le milieu peut affecter le TE de groupes spécifiques de gènes. L’abondance des ARNm codant pour les PR est très étroitement co-régulée22,23,24 ; nos résultats démontrent que ces ARNm présentent également un comportement coordonné au niveau de l’efficacité traductionnelle. La raison de l’extrême sensibilité de ces ARNm à la CHX reste à clarifier.

Pour la majorité des gènes, cependant, le traitement à la CHX n’a aucun effet sur la densité ribosomale, quelle que soit la condition de croissance. Des résultats similaires ont été rapportés pour les cellules de mammifères cultivées en culture, le CHX n’ayant aucun effet significatif sur les densités ribosomiques spécifiques des gènes. Cependant, cela n’a été examiné que dans des cellules non stressées13.

Changements dans l’utilisation des cadres de lecture ouverts en amont

Les cellules de S. cerevisiae affichent une accumulation d’empreintes de ribosomes dans les séquences de tête 5′ qui est accrue dans des conditions de stress, ce qui suggère une utilisation plus élevée des uORF1, 9, 10. Cependant, ces conclusions ont été contestées et attribuées à l’utilisation de CHX en culture cellulaire8.

Pour aborder cette question chez S. pombe, nous avons comparé l’accumulation de lectures dans les séquences 5′ leader et codantes (Fig. 2a) avant et après la privation d’azote. Nous avons initialement quantifié cette valeur en mesurant le rapport entre le nombre total d’empreintes de ribosomes dans les leaders 5′ et dans les séquences codantes. La privation d’azote dans les cellules traitées au CHX a provoqué une augmentation moyenne de 5,5 fois, tandis que les cellules non traitées ont eu une augmentation moyenne de 2,1 fois (les deux enrichissements étaient cohérents entre les répétitions biologiques, Fig. 2b). Comme les ratios totaux pourraient être dominés par les changements dans un petit nombre de gènes très abondants, nous avons également quantifié les ratios entre les empreintes dans les leaders 5′ et les séquences codantes pour tous les transcrits individuels qui ont passé le seuil d’expression (voir Méthodes pour les détails, et Fig. 2c et Fig. S3 supplémentaire pour les résultats). Conformément au résultat précédent, il y avait une augmentation claire des empreintes de ribosomes dans les séquences 5′ leaders lors de la privation d’azote pour la majorité des gènes (Fig. 2c et Supplementary Fig. S3 ; notez que l’augmentation dans la deuxième réplique est plus faible, mais toujours significative), avec des ratios d’augmentation moyens de 3,8 et 1,9 pour plus/moins CHX, respectivement (Fig. 2d, notez le comportement similaire des deux répliques). Ainsi, contrairement aux résultats de S. cerevisiae, les densités ribosomiques 5′ leader ont été augmentées par le stress nutritionnel dans chaque expérience, bien que l’effet ait été sensiblement plus élevé dans les cellules traitées au CHX. Une mise en garde possible est, bien sûr, que l’étude de S. cerevisiae a utilisé un type de stress différent8. Néanmoins, étant donné qu’une certaine accumulation est observée à la fois avec et sans traitement médicamenteux, nous pouvons conclure que chez S. pombe la privation d’azote conduit à des densités ribosomiques plus élevées sur les séquences 5′ leader. Cette augmentation de la densité peut être due à la traduction des uORF, bien que nous ne puissions pas exclure qu’elle reflète un bruit accru dans les échantillons stressés. La figure supplémentaire S4 présente deux exemples d’uORFs induits en réponse à la privation d’azote. L’importance biologique et la base mécanistique de ce phénomène (ainsi que la question de savoir s’il est général à toutes les conditions de stress) sont encore inconnues.

Effets du CHX sur les densités de ribosomes sur les séquences 5′ leader. (a) Plan expérimental : Les FPR dans les séquences codantes (CDS) et les séquences 5′ leader sont quantifiés dans différentes conditions expérimentales. (b) Rapport entre le total des lectures cartographiant les séquences 5′ leader et le total des lectures cartographiant les séquences codantes (CDS) pour les cellules non stressées (+N) et les cellules privées d’azote (-N), et pour les cellules traitées ou non par CHX (±CHX). Les chiffres indiquent la différence en plis entre les paires d’échantillons -N et +N. Les données sont présentées pour deux réplicats biologiques. (c) Diagramme de dispersion comparant le rapport entre les lectures cartographiant les séquences de tête 5′ et les lectures cartographiant les séquences codantes (CDS) pour des gènes individuels ; chaque tracé compare des cellules non stressées (+N) et des cellules privées d’azote (-N). Les données sont présentées pour les cellules traitées au CHX (à gauche) ou non traitées (à droite). Les lignes rouges correspondent à un ratio de 1. (d) Valeurs moyennes pour les ratios présentés en (c). Les chiffres indiquent la différence de plis entre les paires d’échantillons -N et +N. Les données sont affichées pour deux réplicats biologiques.

Distribution des ribosomes le long des séquences codantes

S. cerevisiae cellules affichent une distribution asymétrique des ribosomes à travers les séquences codantes, avec un large pic de plus grande occupation des ribosomes dans les ~300-400 nucléotides initiaux de la séquence codante1, 9, 14, 20 qui est fortement renforcée par différents stress1, 8, 12.

Nous avons étudié ce phénomène dans S. pombe de deux façons : premièrement, en calculant le rapport entre les empreintes dans les nucléotides 10 à 400 et 401 à 800 (Fig. 3a-c, les 9 premiers nucléotides n’ont pas été considérés pour éviter les biais créés par l’accumulation de ribosomes à l’AUG initiateur) ; deuxièmement, en examinant le comportement d’un métagène représentant la densité de ribosomes à l’échelle du génome le long des séquences codantes (Fig. 3d et Fig. S5 supplémentaire).

Effets du CHX sur la distribution des ribosomes le long des séquences codantes. (a) Plan expérimental : Les FPR sur les nucléotides 10 à 400 et sur les nucléotides 401-800 sont quantifiés dans différentes conditions expérimentales, et le rapport entre les deux nombres est calculé. (b) Rapports moyens calculés comme décrit en A pour toutes les séquences codantes, en présence et en l’absence d’une source d’azote (±N) et en présence et en l’absence d’un traitement au CHX (±CHX). Les chiffres indiquent la différence de plis entre les échantillons appariés -N et +N. Les données sont présentées pour deux réplicats biologiques. (c) Diagramme de dispersion comparant les rapports obtenus comme défini en A pour les gènes individuels ; chaque diagramme compare les cellules non stressées (+N) et les cellules privées d’azote (-N). Les données sont présentées pour les cellules traitées au CHX (à gauche) ou non traitées (à droite). Les lignes rouges correspondent à un rapport de 1. (d) Métagène affichant les distributions moyennes des FPR le long des séquences codantes dans quatre conditions expérimentales. Une fenêtre courante de 60 nucléotides a été utilisée pour lisser les lignes tracées.

En l’absence de stress, les cellules de S. pombe ont montré de petites épaules à la fois en présence et en l’absence du médicament, similaires à celles rapportées pour S. cerevisiae sans CHX1, 14, 20 (figure 3d et figure supplémentaire S5). En cas de stress nutritionnel, S. pombe s’est comporté de manière similaire à S. cerevisiae 12. En présence de CHX, il y avait une nette accumulation de lectures dans la partie 5′ de la séquence codante dans la majorité des gènes (Fig. 3c et Supplementary Fig. S5, tracé de gauche), ce qui se reflétait également dans une augmentation d’environ 2,0 fois de la densité moyenne dans les 400 premiers nucléotides de l’ARNm (Fig. 3b). En revanche, cette augmentation était négligeable en l’absence du médicament, à la fois lorsque les gènes individuels ont été examinés (Fig. 3c (tracé de droite) et Fig. S5 supplémentaire) et lorsque les rapports moyens ont été mesurés (Fig. 3b, note que les deux répliques se sont comportées de manière cohérente). De plus, la dépendance de l’accumulation de lectures à l’égard du CHX lors de la privation d’azote a été confirmée par les données métagéniques (Fig. 3d et Supplementary Fig. S5). Enfin, nous avons établi que cet effet était spécifique aux FPR, en traçant un métagène basé sur les données mRNA-seq (figure supplémentaire S5).

Nous avons également cherché à savoir si ces observations s’appliqueraient également aux gènes plus petits. Dans ce but, nous avons généré des métagènes pour les gènes RP et pour les petits gènes (moins de 200 codons) à l’exclusion des gènes RP. Dans les deux cas, la CHX a provoqué une nette augmentation du côté 5′ des séquences codantes (surtout pour les gènes RP), qui dépendait à la fois de la privation d’azote et du traitement à la CHX (figure supplémentaire S5).

En outre, il y avait une accumulation de ribosomes sur les codons d’initiation (figure supplémentaire S6). Cette caractéristique était déjà présente dans les cellules non traitées, bien qu’elle ait été élevée avec l’incubation au CHX (à la fois dans les cellules témoins et les cellules privées d’azote). Cet enrichissement était légèrement plus élevé dans les cellules privées d’azote, indépendamment du traitement CHX (Supplementary Fig. S6).

Il y a donc une accumulation claire de ribosomes dans la partie initiale des séquences codantes, conservée chez S. pombe et S. cerevisiae, et qui peut être observée à la fois avec et sans prétraitement CHX. En revanche, le renforcement induit par le stress n’est pas observé de manière constante en l’absence de CHX chez les deux levures, et il n’y a donc pas suffisamment de preuves pour indiquer qu’il se produit in vivo. À l’avenir, l’utilisation de stratégies de réticulation in vivo25 pourrait aider à distinguer ces deux interprétations.

Occupation des codons

En principe, l’occupation ribosomale normalisée des codons individuels est liée au temps que le ribosome passe à chaque codon, et peut donc être utilisée pour estimer les taux de traduction moyens spécifiques aux codons. Cependant, les premières expériences visant à étudier ce phénomène ont donné des résultats contradictoires17,18,19,20. Une étude élégante menée par Hussmann et al. qui a fait appel à de nouvelles expériences, à une méta-analyse de nombreuses expériences de profilage des ribosomes de S. cerevisiae et à une modélisation mathématique9, a révélé que ces contradictions pouvaient s’expliquer par l’effet du CHX sur la détermination des occupations des ribosomes spécifiques des codons. Les expériences de différents groupes réalisées en présence de CHX présentaient des occupations de codons ribosomiques similaires les unes aux autres, tout comme celles réalisées sans le médicament. Cependant, les corrélations entre les expériences avec CHX et celles sans CHX étaient très faibles. De plus, les expériences avec CHX ont entraîné des taux de traduction spécifiques aux codons qui ont montré des corrélations négatives avec l’abondance des ARNt cognés, alors que celles qui n’incluaient pas de traitement par CHX ont montré les corrélations positives attendues9, 20. Hussmann et al. ont proposé que les ribosomes n’arrêtent pas immédiatement la traduction en présence de CHX dans le milieu. Au lieu de cela, la traduction continue pour quelques codons avec des taux de traduction spécifiques au codon9, provoquant des occupations de codons artefactuelles.

Pour étudier ce phénomène, nous avons analysé les occupations ribosomiques spécifiques au codon sur les sites A comme décrit dans Méthodes. Brièvement, nous avons assigné chaque lecture qui a mappé à une séquence codante au site A d’un ribosome (qui correspond au nucléotide 16 d’un fragment protégé par le ribosome). Nous avons ensuite calculé l’occupation normalisée pour chaque codon à travers le génome (en divisant la fréquence avec laquelle le ribosome est positionné sur chaque codon par l’abondance du codon sur l’ARNm). En l’absence de biais, on s’attendrait à ce que cette valeur reflète le temps moyen que le ribosome passe sur chaque codon.

Nous avons d’abord comparé l’effet du CHX sur les occupations ribosomiques spécifiques aux codons (figure 4, figures supplémentaires S7 et S8). Étonnamment, la corrélation entre les deux expériences était très élevée, avec des valeurs moyennes de 0,82 pour la privation d’azote (Fig. 4a et Supplementary Fig. S7) et de 0,86 pour les cellules non stressées (Fig. 4b et Supplementary Fig. S7). Dans des comparaisons similaires chez S. cerevisiae, la majorité des corrélations étaient négatives9. Par exemple, les codons rares tels que CCG (proline) et CGG (arginine) avaient parmi les occupations les plus élevées en l’absence de CHX, mais perdaient cet enrichissement dans les échantillons traités au CHX9. En revanche, dans l’ensemble de données de S. pombe, le CCG et le CGG étaient enrichis indépendamment de la présence de CHX (bien que moins fortement dans les cellules non traitées, Fig. 4c et Fig. S7 supplémentaire). De plus, le stress nutritionnel a eu très peu d’effet sur les occupations ribosomiques spécifiques aux codons, que ce soit en présence (Fig. 4c et Supplementary Fig. S7, R moyen = 0,96) ou en l’absence de CHX (Fig. 4d et figure supplémentaire S7, R moyen = 0,98).

Effets du CHX sur les occupations relatives des codons. Diagrammes de dispersion affichant les occupations relatives des codons obtenues comme décrit dans Méthodes. Chaque point correspond à un seul codon. Les codons de terminaison ne sont pas affichés. Les positions des codons rares CCG et CGG sont indiquées. Les lignes pointillées correspondent à des différences de 1,5 fois. Les corrélations de Pearson entre les ensembles de données sont indiquées. (a) Comparaison des effets du traitement par CHX dans des cellules privées d’azote. (b) Comme en (a), pour les cellules cultivées avec une source d’azote. (c) Comparaison des effets de la privation d’azote en présence de CHX. (d) Comme en (c), en l’absence de CHX.

Enfin, nous avons évalué la corrélation entre l’abondance des ARNt et les occupations spécifiques des codons. Pour ce faire, nous avons utilisé l’indice d’adaptation des ARNt (tAI), qui est une mesure de l’utilisation des ARNt pour chaque codon, en partie basée sur le nombre de copies d’ARNt (un nombre plus élevé prédit une traduction plus efficace)26. Les expériences menées sur S. cerevisiae en présence de CHX dans la culture montrent des corrélations négatives entre l’inverse du tAI (1/tAI) et les occupations spécifiques des codons, ce qui permet de prédire que les codons ayant un faible tAI (et donc de faibles abondances d’ARNt) seraient traduits plus rapidement. En revanche, les expériences avec des cellules non prétraitées au CHX ont montré la corrélation positive attendue entre 1/tAI (bien que les valeurs réelles aient été très variables selon les expériences)9. Chez S. pombe, nous avons constaté que dans chacune des huit expériences de profilage des ribosomes, les occupations spécifiques des codons affichaient une corrélation positive avec 1/tAI, avec une moyenne de 0,39 (tableau 2).

Nos résultats montrent que chez S. pombe, la CHX a un effet relativement mineur sur la position des ribosomes sur des codons spécifiques. Cela pourrait s’expliquer par le fait que les cellules de S. pombe sont particulièrement sensibles à la CHX, de sorte que la CHX bloquerait les mouvements des ribosomes plus rapidement et plus complètement que chez S. cerevisiae. Cette propriété empêcherait le mouvement des ribosomes à des vitesses modifiées (ce qui est supposé se produire chez S. cerevisiae), et conduirait à une situation dans laquelle les cellules de S. pombe traitées au CHX et non traitées auraient des distributions de ribosomes similaires en régime permanent. Cependant, le fait que les codons rares soient moins enrichis en présence de CHX suggère que le CHX devrait être omis dans les expériences visant à déterminer les distributions de ribosomes spécifiques aux codons.