Sykloheksimidin vaikutukset ribosomiprofilointikokeiden tulkintaan Schizosaccharomyces pomben ribosomiprofilointikokeiden tulkintaan
Kokeellinen suunnittelu ja toistettavuus
Tarkastellaksemme CHX:n vaikutuksia ribosomiprofilointikokeisiin sovelsimme kyseistä tekniikkaa kokeisiin, jotka suoritettiin vuonna 2016 S. pombe-soluihin, jotka kasvoivat eksponentiaalisesti (ilman stressiä) ja 1 tunnin typpinälän jälkeen (ravitsemuksellinen stressi). Kukin viljelmä jaettiin kahteen osaan, ja toista niistä inkuboitiin CHX:n kanssa 100 µg/ml:n pitoisuudella 5 minuutin ajan ennen keruuta (tämä on ’standardi’ pitoisuus, jota käytetään useimmissa julkaistuissa kokeissa). Solut kerättiin suodattamalla ja pikajäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä, jotta estettäisiin myöhempi muuntaminen. Huomaa, että kaikkien näytteiden lyysipuskureissa oli CHX:ää. Näin ollen kaikki jäljempänä olevat viittaukset CHX-käsittelyyn koskevat ainoastaan sen lisäämistä elatusaineeseen. Teimme kaksi riippumatonta biologista toistoa jokaisesta neljästä kokeesta (plus/minus typpi, plus/minus CHX). Valmistimme ja eristimme kustakin näytteestä ribosomisuojattuja fragmentteja (RPF:t tai ribosomijalanjäljet) menetelmissä kuvatulla tavalla ja analysoimme ne käyttämällä Illumina-sekvensointia suurella läpimenolla. Sekvensoimme myös rRNA-poistettua RNA:ta kustakin kahdeksasta näytteestä (RNA-seq). Arvioidaksemme tekniikan toistettavuutta kvantifioimme kunkin kokeen osalta niiden RPF- ja RNA-seq-lukujen määrän, jotka sopivat kuhunkin S. pomben genomin annotoituun koodaavaan sekvenssiin. Tiedot olivat hyvin toistettavissa, ja riippumattomien biologisten toistojen keskimääräinen korrelaatio oli 0,97 (taulukko 1). Keskitymme jäljempänä siihen, miten CHX vaikuttaa ribosomiprofilointikokeisiin. Täydellisempi analyysi S. pombe -solujen biologisesta vasteesta typen nälkään julkaistaan muualla.
Tutkittaessa CHX:n vaikutuksia tutkimme neljää translaation näkökohtaa: 1] ribosomien kokonaistiheys yksittäisten geenien koodaavissa sekvensseissä, 2] ribosomien esiintyminen 5′:n johtavissa sekvensseissä, 3] ribosomien sijainnin vääristymät koodaavissa sekvensseissä ja 4] ribosomien jakautuminen pitkin yksittäisiä koodoneja.
Ribosomitiheys
Kvantitatiivisesti määrittelimme RPF-lukulukemien lukumäärän koodaavissa sekvensseissä kunkin annotoidun geenin osalta CHX:llä käsitellyissä soluissa tai pilkkukäsitellyissä. Typpinälässä molempien käsittelyjen välinen korrelaatio oli hyvin korkea (keskimääräinen R = 0,96), mutta ~4,5 %:lla kaikista geeneistä havaittiin johdonmukaisesti korkeampi ribosomitiheys CHX:n läsnä ollessa (2-kertainen tai korkeampi molemmissa replikaateissa, kuva 1a ja täydentävä kuva S1). Vastaavia muutoksia ei havaittu mRNA-näytteissä (keskimääräinen R = 0,98), mikä osoittaa, että tämä vaikutus johtui muutoksista translaatiossa eikä transkriptomissa (Kuva 1a, Täydentävä kuva S1).
Yllättäen tähän ryhmään kuului suurin osa ribosomaalisia proteiineja koodaavista geeneistä (RP:t, kuva 1a ja täydentävä kuva S1, vihreät pisteet). Sulkeaksemme pois sen mahdollisuuden, että CHX aiheuttaisi hienovaraisia muutoksia mRNA-tasoissa, vertasimme typen nälkiinnyttämisen aiheuttamia muutoksia CHX:n läsnäollessa tai ilman CHX:ää (Täydentävä kuva S2). RP-geenien mRNA-tasojen mediaani-kertainen muutos oli 0,25 CHX:llä käsitellyissä näytteissä ja 0,24 käsittelemättömissä soluissa, mikä vahvistaa sen, että RP-geenien ribosomitiheyden muutokset typpinälässä johtuvat translaatiossa tapahtuvista muutoksista.
RP-geenit ovat yleisesti ottaen melko lyhyitä, ja niiden mediaanipituus on 447 nukleotidia, kun se on kaikilla geeneillä 1131. Siksi yksinkertainen selitys tälle rikastumiselle voisi olla se, että CHX estää ribosomien ”valumisen” lyhyistä geeneistä solukeräyksen aikana, mikä lisää niiden näennäistä ribosomitiheyttä. Vaikka oli kuitenkin havaittavissa pieni suuntaus siihen, että lyhyempien geenien ribosomitiheys oli korkeampi CHX:n läsnä ollessa, tämä vaikutus oli vähäinen, eikä se voinut selittää ribosomiproteiinigeenien käyttäytymistä (kuva 1b). Näiden geenien koodaamilla mRNA:illa on myös taipumus lyhyempiin 5′-johtosekvensseihin (mediaani 68,5 nukleotidia verrattuna 173:een kaikilla geeneillä), mutta 5′-johtosekvenssien pituuksien ja korkeampien ribosomitiheyksien välillä ei ollut yleistä korrelaatiota CHX:n vaikutuksesta (kuva 1c). Vain 9:ssä ydinkoodatussa geenissä (~0,2 %) havaittiin ribosomitiheyksien vähenemistä CHX:ssä (Kuva 1a ja Täydentävä kuva S1), eikä niissä ollut mitään yhteisiä piirteitä.
Vastakohtaisesti stressittömissä olosuhteissa lääkkeellä oli hyvin heikko vaikutus ribosomitiheyteen (keskimääräinen R = 0,98), ja alle 1 %:lla geeneistä havaittiin yli 2-kertaisia eroja tiheydessä (23 geeniä korkeampi tiheys CHX:ssä ja 9 matalampi tiheys CHX:ssä, Kuva 1a ja Täydentävä kuva S1). Mielenkiintoista on, että pieni ryhmä geenejä, joiden tiheydet olivat alhaisemmat CHX:llä käsitellyissä soluissa, oli myös rikastunut ribosomiproteiinigeeneihin (12/23 mRNA:ta).
Johtopäätöksemme on, että RP:tä koodaavat mRNA:t ovat erityisen herkkiä CHX:n läsnäololle ja että tätä ilmiötä ei voida selittää pelkästään niiden lyhyillä 5′:n johtavilla ja koodaavilla sekvensseillä. Lisäksi vaikutus on voimakas vain ravitsemuksellisessa stressissä. Näistä tuloksista ei kuitenkaan käy ilmi, kumpi kahdesta näytteestä (CHX-käsitelty vai käsittelemätön) kuvastaa paremmin in vivo -tilannetta. Esimerkiksi RP-geeneissä on runsaasti optimaalisia koodoneja, mikä viittaa siihen, että translaation pidentyminen tapahtuu suurella nopeudella. Tämä ominaisuus yhdessä niiden lyhyen pituuden kanssa saattaa tehdä niistä herkempiä ribosomien valumiselle keräyksen aikana. Tällöin CHX vakiinnuttaisi in vivo -jakauman. Vaihtoehtoisesti on myös mahdollista, että CHX vaikuttaa suoraan näiden mRNA:iden translaatioon, mikä johtaa epäfysiologisiin ribosomitiheyksiin.
Tarkastelimme tämän jälkeen, vaikuttaisivatko CHX:n aiheuttamat muutokset ribosomitiheydessä tulkintaan translationaalisesta/transkriptiivisestä vasteesta typpinälkään. Määritimme translaatiotehokkuudet (TE) normalisoimalla RPF-laskennan mRNA-tasoilla ja laskimme TE- ja transkriptiotasojen log-muutoksen typpeä sisältävässä väliaineessa kasvatettujen solujen ja typpinälkiytyneissä soluissa kasvatettujen solujen välillä (kuva 1c ja täydentävä kuva S1B). CHX:n läsnäollessa typpinälkä johti RP:tä koodaavien mRNA:iden tasojen selvään laskuun, mutta ei vaikuttanut niiden TE:hen. Sitä vastoin kokeissa, jotka tehtiin ilman CHX:ää, nämä mRNA:t näyttivät olevan alasreguloituneita sekä mRNA- että TE-tasolla. Näin ollen CHX:n esi-inkubointi väliaineessa voi vaikuttaa tiettyjen geeniryhmien TE:hen. RP:tä koodaavien mRNA:iden runsaus on hyvin tiukasti yhteissäännelty22,23,24; tuloksemme osoittavat, että nämä mRNA:t käyttäytyvät koordinoidusti myös translaatiotehokkuuden tasolla. Syy näiden mRNA:iden äärimmäiseen herkkyyteen CHX:lle on vielä selvittämättä.
Vähemmistön geenien osalta CHX-käsittelyllä ei kuitenkaan ole vaikutusta ribosomitiheyteen kasvuolosuhteesta riippumatta. Samanlaisia tuloksia on raportoitu nisäkässoluista, joita on kasvatettu viljelyssä, eikä CHX:llä ole merkittävää vaikutusta geenispesifisiin ribosomitiheyksiin. Tätä on kuitenkin tutkittu vain stressaamattomissa soluissa13.
Ylävirran avoimien lukukehysten käytön muutokset
S. cerevisiae -soluissa näkyy 5′-johtavien sekvenssien ribosomijälkien kasaantumista, joka lisääntyy stressitilanteessa, mikä viittaa uORF:ien suurempaan käyttöön1, 9, 10. Nämä johtopäätökset on kuitenkin kiistetty, ja niiden on katsottu johtuvan CHX:n käytöstä soluviljelyssä8.
Vastaillaksemme tätä kysymystä S. pombe -bakteerissa vertasimme lukujen kertymistä 5′-johtaviin sekvensseihin ja koodaaviin sekvensseihin (kuva 2a) ennen ja jälkeen typen nälkäkuurin. Määritimme tämän arvon aluksi mittaamalla 5′-johtavissa ja koodaavissa sekvensseissä olevien ribosomijälkien kokonaismäärän suhdetta. CHX:llä käsitellyissä soluissa typen nälkiinnyttäminen aiheutti keskimäärin 5,5-kertaisen lisäyksen, kun taas käsittelemättömien solujen keskimääräinen lisäys oli 2,1-kertainen (molemmat rikastumiset olivat yhdenmukaisia eri biologisissa toistoissa, kuva 2b). Koska kokonaissuhteita voivat hallita muutokset pienessä määrässä erittäin runsaasti esiintyviä geenejä, kvantifioimme myös 5′-johtajien ja koodaavien sekvenssien jalanjälkien väliset suhteet kaikkien yksittäisten transkriptien osalta, jotka läpäisivät ekspressiokynnyksen (ks. tarkemmat tiedot menetelmistä ja tulokset kuvassa 2c ja täydentävässä kuvassa S3). Edellisen tuloksen mukaisesti ribosomien jalanjäljet 5′-johtavissa sekvensseissä lisääntyivät selvästi typen nälkiinnyttämisen yhteydessä suurimmassa osassa geenejä (Kuva 2c ja Täydentävä kuva S3; huomaa, että toisessa toistossa lisäys on pienempi, mutta silti merkittävä), ja keskimääräiset lisäyssuhteet olivat 3,8 ja 1,9 plus/miinus CHX:n tapauksessa (Kuva 2d, huomaa molempien toistojen samankaltainen käyttäytyminen). Toisin kuin S. cerevisiae -tuloksissa, ravitsemusstressi lisäsi siis 5′-johtavien ribosomien tiheyksiä jokaisessa kokeessa, vaikkakin vaikutus oli huomattavasti suurempi CHX:llä käsitellyissä soluissa. Mahdollinen varoitus on tietenkin se, että S. cerevisiae -tutkimuksessa käytettiin erityyppistä stressiä8. Kun kuitenkin otetaan huomioon, että jonkin verran kasautumista on havaittu sekä lääkehoidon kanssa että ilman lääkehoitoa, voimme päätellä, että S. pombe -lajissa typpinälkä johtaa suurempiin ribosomitiheyksiin 5′-johtavissa sekvensseissä. Tämä tiheyden lisääntyminen voi johtua uORF:ien translaatiosta, vaikkakaan emme voi sulkea pois sitä, että se heijastaa lisääntynyttä kohinaa stressaantuneissa näytteissä. Täydentävässä kuvassa S4 esitetään kaksi esimerkkiä uORF:ista, jotka indusoituvat vastauksena typen nälkään. Tämän ilmiön biologista merkitystä ja mekanistista perustaa (samoin kuin sitä, onko se yleinen kaikissa stressitilanteissa) ei vielä tunneta.
Ribosomien jakautuminen koodaavia sekvenssejä pitkin
S. Cerevisiae-soluissa on havaittavissa epäsymmetrinen ribosomien jakautuminen koodaavissa sekvensseissä, ja koodaavan sekvenssin ensimmäisten ~300-400 nukleotidin kohdalla on laaja korkeamman ribosomimäärän huippu1, 9, 14, 20, jota erilaiset stressit voimistavat voimakkaasti1, 8, 12.
Tutkimme tätä ilmiötä S. pombea kahdella tavalla: ensinnäkin laskemalla nukleotidien 10-400 ja 401-800 jalanjälkien suhdetta (Kuva 3a-c, ensimmäisiä yhdeksää nukleotidia ei otettu huomioon, jotta vältettäisiin ribosomien kasautumisen aiheuttamat vääristymät aloittaviin AUG:iin); toiseksi tutkimalla koko genomin laajuista ribosomitiheyttä koodaavien sekvenssien varrella edustavan metageenin käyttäytymistä (Kuva 3a-c). 3d ja täydentävä kuva S5).
Leave a Reply