Sykloheksimidin vaikutukset ribosomiprofilointikokeiden tulkintaan Schizosaccharomyces pomben ribosomiprofilointikokeiden tulkintaan

Kokeellinen suunnittelu ja toistettavuus

Tarkastellaksemme CHX:n vaikutuksia ribosomiprofilointikokeisiin sovelsimme kyseistä tekniikkaa kokeisiin, jotka suoritettiin vuonna 2016 S. pombe-soluihin, jotka kasvoivat eksponentiaalisesti (ilman stressiä) ja 1 tunnin typpinälän jälkeen (ravitsemuksellinen stressi). Kukin viljelmä jaettiin kahteen osaan, ja toista niistä inkuboitiin CHX:n kanssa 100 µg/ml:n pitoisuudella 5 minuutin ajan ennen keruuta (tämä on ’standardi’ pitoisuus, jota käytetään useimmissa julkaistuissa kokeissa). Solut kerättiin suodattamalla ja pikajäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä, jotta estettäisiin myöhempi muuntaminen. Huomaa, että kaikkien näytteiden lyysipuskureissa oli CHX:ää. Näin ollen kaikki jäljempänä olevat viittaukset CHX-käsittelyyn koskevat ainoastaan sen lisäämistä elatusaineeseen. Teimme kaksi riippumatonta biologista toistoa jokaisesta neljästä kokeesta (plus/minus typpi, plus/minus CHX). Valmistimme ja eristimme kustakin näytteestä ribosomisuojattuja fragmentteja (RPF:t tai ribosomijalanjäljet) menetelmissä kuvatulla tavalla ja analysoimme ne käyttämällä Illumina-sekvensointia suurella läpimenolla. Sekvensoimme myös rRNA-poistettua RNA:ta kustakin kahdeksasta näytteestä (RNA-seq). Arvioidaksemme tekniikan toistettavuutta kvantifioimme kunkin kokeen osalta niiden RPF- ja RNA-seq-lukujen määrän, jotka sopivat kuhunkin S. pomben genomin annotoituun koodaavaan sekvenssiin. Tiedot olivat hyvin toistettavissa, ja riippumattomien biologisten toistojen keskimääräinen korrelaatio oli 0,97 (taulukko 1). Keskitymme jäljempänä siihen, miten CHX vaikuttaa ribosomiprofilointikokeisiin. Täydellisempi analyysi S. pombe -solujen biologisesta vasteesta typen nälkään julkaistaan muualla.

Taulukko 1 Riippumattomien toistojen välinen korrelaatio.

Tutkittaessa CHX:n vaikutuksia tutkimme neljää translaation näkökohtaa: 1] ribosomien kokonaistiheys yksittäisten geenien koodaavissa sekvensseissä, 2] ribosomien esiintyminen 5′:n johtavissa sekvensseissä, 3] ribosomien sijainnin vääristymät koodaavissa sekvensseissä ja 4] ribosomien jakautuminen pitkin yksittäisiä koodoneja.

Ribosomitiheys

Kvantitatiivisesti määrittelimme RPF-lukulukemien lukumäärän koodaavissa sekvensseissä kunkin annotoidun geenin osalta CHX:llä käsitellyissä soluissa tai pilkkukäsitellyissä. Typpinälässä molempien käsittelyjen välinen korrelaatio oli hyvin korkea (keskimääräinen R = 0,96), mutta ~4,5 %:lla kaikista geeneistä havaittiin johdonmukaisesti korkeampi ribosomitiheys CHX:n läsnä ollessa (2-kertainen tai korkeampi molemmissa replikaateissa, kuva 1a ja täydentävä kuva S1). Vastaavia muutoksia ei havaittu mRNA-näytteissä (keskimääräinen R = 0,98), mikä osoittaa, että tämä vaikutus johtui muutoksista translaatiossa eikä transkriptomissa (Kuva 1a, Täydentävä kuva S1).

Kuvio 1
kuvio1

CHX:n vaikutukset ribosomitiheyksien kokonaistiheyteen koodaavissa sekvensseissä. (a) Hajontakaaviot, joissa verrataan mRNA-tasoja (ylhäällä) ja ribosomitiheyksiä (alhaalla) käsittelemättömien ja CHX-käsiteltyjen solujen välillä. Tiedot on esitetty soluille, jotka kasvavat typpilähteen läsnä ollessa (+N) tai typen puutteessa (-N). Ribosomiproteiineja koodaavat geenit on esitetty vihreällä. Kaikki tiedot on normalisoitu RPKM-arvoihin (Reads Per Kilobase per Million mapped reads). (b) Vasemmalla: Boxplotit, joissa verrataan ribosomitiheyksiä käsittelemättömien ja CHX:llä käsiteltyjen solujen välillä sellaisten geeniryhmien osalta, joilla on ilmoitettu koodaavien sekvenssien keskimääräinen pituus. Oikealla: vastaavat tiedot ilmoitettujen 5′-johtavien sekvenssien pituuksien osalta. Punaiset laatikot osoittavat ribosomaalisia proteiineja koodaavien mRNA:iden käyttäytymisen. (c) Vertailu mRNA-tasojen ja ribosomitiheyksien muutoksista typpinälkäisten (-N) ja stressaamattomien (+N) solujen välillä. Tiedot esitetään CHX-käsitellyille soluille (vasemmalla) ja käsittelemättömille soluille (vasemmalla). Ribosomaalisia proteiineja koodaavat geenit on esitetty vihreällä.

Yllättäen tähän ryhmään kuului suurin osa ribosomaalisia proteiineja koodaavista geeneistä (RP:t, kuva 1a ja täydentävä kuva S1, vihreät pisteet). Sulkeaksemme pois sen mahdollisuuden, että CHX aiheuttaisi hienovaraisia muutoksia mRNA-tasoissa, vertasimme typen nälkiinnyttämisen aiheuttamia muutoksia CHX:n läsnäollessa tai ilman CHX:ää (Täydentävä kuva S2). RP-geenien mRNA-tasojen mediaani-kertainen muutos oli 0,25 CHX:llä käsitellyissä näytteissä ja 0,24 käsittelemättömissä soluissa, mikä vahvistaa sen, että RP-geenien ribosomitiheyden muutokset typpinälässä johtuvat translaatiossa tapahtuvista muutoksista.

RP-geenit ovat yleisesti ottaen melko lyhyitä, ja niiden mediaanipituus on 447 nukleotidia, kun se on kaikilla geeneillä 1131. Siksi yksinkertainen selitys tälle rikastumiselle voisi olla se, että CHX estää ribosomien ”valumisen” lyhyistä geeneistä solukeräyksen aikana, mikä lisää niiden näennäistä ribosomitiheyttä. Vaikka oli kuitenkin havaittavissa pieni suuntaus siihen, että lyhyempien geenien ribosomitiheys oli korkeampi CHX:n läsnä ollessa, tämä vaikutus oli vähäinen, eikä se voinut selittää ribosomiproteiinigeenien käyttäytymistä (kuva 1b). Näiden geenien koodaamilla mRNA:illa on myös taipumus lyhyempiin 5′-johtosekvensseihin (mediaani 68,5 nukleotidia verrattuna 173:een kaikilla geeneillä), mutta 5′-johtosekvenssien pituuksien ja korkeampien ribosomitiheyksien välillä ei ollut yleistä korrelaatiota CHX:n vaikutuksesta (kuva 1c). Vain 9:ssä ydinkoodatussa geenissä (~0,2 %) havaittiin ribosomitiheyksien vähenemistä CHX:ssä (Kuva 1a ja Täydentävä kuva S1), eikä niissä ollut mitään yhteisiä piirteitä.

Vastakohtaisesti stressittömissä olosuhteissa lääkkeellä oli hyvin heikko vaikutus ribosomitiheyteen (keskimääräinen R = 0,98), ja alle 1 %:lla geeneistä havaittiin yli 2-kertaisia eroja tiheydessä (23 geeniä korkeampi tiheys CHX:ssä ja 9 matalampi tiheys CHX:ssä, Kuva 1a ja Täydentävä kuva S1). Mielenkiintoista on, että pieni ryhmä geenejä, joiden tiheydet olivat alhaisemmat CHX:llä käsitellyissä soluissa, oli myös rikastunut ribosomiproteiinigeeneihin (12/23 mRNA:ta).

Johtopäätöksemme on, että RP:tä koodaavat mRNA:t ovat erityisen herkkiä CHX:n läsnäololle ja että tätä ilmiötä ei voida selittää pelkästään niiden lyhyillä 5′:n johtavilla ja koodaavilla sekvensseillä. Lisäksi vaikutus on voimakas vain ravitsemuksellisessa stressissä. Näistä tuloksista ei kuitenkaan käy ilmi, kumpi kahdesta näytteestä (CHX-käsitelty vai käsittelemätön) kuvastaa paremmin in vivo -tilannetta. Esimerkiksi RP-geeneissä on runsaasti optimaalisia koodoneja, mikä viittaa siihen, että translaation pidentyminen tapahtuu suurella nopeudella. Tämä ominaisuus yhdessä niiden lyhyen pituuden kanssa saattaa tehdä niistä herkempiä ribosomien valumiselle keräyksen aikana. Tällöin CHX vakiinnuttaisi in vivo -jakauman. Vaihtoehtoisesti on myös mahdollista, että CHX vaikuttaa suoraan näiden mRNA:iden translaatioon, mikä johtaa epäfysiologisiin ribosomitiheyksiin.

Tarkastelimme tämän jälkeen, vaikuttaisivatko CHX:n aiheuttamat muutokset ribosomitiheydessä tulkintaan translationaalisesta/transkriptiivisestä vasteesta typpinälkään. Määritimme translaatiotehokkuudet (TE) normalisoimalla RPF-laskennan mRNA-tasoilla ja laskimme TE- ja transkriptiotasojen log-muutoksen typpeä sisältävässä väliaineessa kasvatettujen solujen ja typpinälkiytyneissä soluissa kasvatettujen solujen välillä (kuva 1c ja täydentävä kuva S1B). CHX:n läsnäollessa typpinälkä johti RP:tä koodaavien mRNA:iden tasojen selvään laskuun, mutta ei vaikuttanut niiden TE:hen. Sitä vastoin kokeissa, jotka tehtiin ilman CHX:ää, nämä mRNA:t näyttivät olevan alasreguloituneita sekä mRNA- että TE-tasolla. Näin ollen CHX:n esi-inkubointi väliaineessa voi vaikuttaa tiettyjen geeniryhmien TE:hen. RP:tä koodaavien mRNA:iden runsaus on hyvin tiukasti yhteissäännelty22,23,24; tuloksemme osoittavat, että nämä mRNA:t käyttäytyvät koordinoidusti myös translaatiotehokkuuden tasolla. Syy näiden mRNA:iden äärimmäiseen herkkyyteen CHX:lle on vielä selvittämättä.

Vähemmistön geenien osalta CHX-käsittelyllä ei kuitenkaan ole vaikutusta ribosomitiheyteen kasvuolosuhteesta riippumatta. Samanlaisia tuloksia on raportoitu nisäkässoluista, joita on kasvatettu viljelyssä, eikä CHX:llä ole merkittävää vaikutusta geenispesifisiin ribosomitiheyksiin. Tätä on kuitenkin tutkittu vain stressaamattomissa soluissa13.

Ylävirran avoimien lukukehysten käytön muutokset

S. cerevisiae -soluissa näkyy 5′-johtavien sekvenssien ribosomijälkien kasaantumista, joka lisääntyy stressitilanteessa, mikä viittaa uORF:ien suurempaan käyttöön1, 9, 10. Nämä johtopäätökset on kuitenkin kiistetty, ja niiden on katsottu johtuvan CHX:n käytöstä soluviljelyssä8.

Vastaillaksemme tätä kysymystä S. pombe -bakteerissa vertasimme lukujen kertymistä 5′-johtaviin sekvensseihin ja koodaaviin sekvensseihin (kuva 2a) ennen ja jälkeen typen nälkäkuurin. Määritimme tämän arvon aluksi mittaamalla 5′-johtavissa ja koodaavissa sekvensseissä olevien ribosomijälkien kokonaismäärän suhdetta. CHX:llä käsitellyissä soluissa typen nälkiinnyttäminen aiheutti keskimäärin 5,5-kertaisen lisäyksen, kun taas käsittelemättömien solujen keskimääräinen lisäys oli 2,1-kertainen (molemmat rikastumiset olivat yhdenmukaisia eri biologisissa toistoissa, kuva 2b). Koska kokonaissuhteita voivat hallita muutokset pienessä määrässä erittäin runsaasti esiintyviä geenejä, kvantifioimme myös 5′-johtajien ja koodaavien sekvenssien jalanjälkien väliset suhteet kaikkien yksittäisten transkriptien osalta, jotka läpäisivät ekspressiokynnyksen (ks. tarkemmat tiedot menetelmistä ja tulokset kuvassa 2c ja täydentävässä kuvassa S3). Edellisen tuloksen mukaisesti ribosomien jalanjäljet 5′-johtavissa sekvensseissä lisääntyivät selvästi typen nälkiinnyttämisen yhteydessä suurimmassa osassa geenejä (Kuva 2c ja Täydentävä kuva S3; huomaa, että toisessa toistossa lisäys on pienempi, mutta silti merkittävä), ja keskimääräiset lisäyssuhteet olivat 3,8 ja 1,9 plus/miinus CHX:n tapauksessa (Kuva 2d, huomaa molempien toistojen samankaltainen käyttäytyminen). Toisin kuin S. cerevisiae -tuloksissa, ravitsemusstressi lisäsi siis 5′-johtavien ribosomien tiheyksiä jokaisessa kokeessa, vaikkakin vaikutus oli huomattavasti suurempi CHX:llä käsitellyissä soluissa. Mahdollinen varoitus on tietenkin se, että S. cerevisiae -tutkimuksessa käytettiin erityyppistä stressiä8. Kun kuitenkin otetaan huomioon, että jonkin verran kasautumista on havaittu sekä lääkehoidon kanssa että ilman lääkehoitoa, voimme päätellä, että S. pombe -lajissa typpinälkä johtaa suurempiin ribosomitiheyksiin 5′-johtavissa sekvensseissä. Tämä tiheyden lisääntyminen voi johtua uORF:ien translaatiosta, vaikkakaan emme voi sulkea pois sitä, että se heijastaa lisääntynyttä kohinaa stressaantuneissa näytteissä. Täydentävässä kuvassa S4 esitetään kaksi esimerkkiä uORF:ista, jotka indusoituvat vastauksena typen nälkään. Tämän ilmiön biologista merkitystä ja mekanistista perustaa (samoin kuin sitä, onko se yleinen kaikissa stressitilanteissa) ei vielä tunneta.

Kuvio 2
kuvio2

CHX:n vaikutukset ribosomitiheyksiin 5′-johtavissa sekvensseissä. (a) Koejärjestely: RPF:t koodaavissa sekvensseissä (CDS) ja 5′ johtavissa sekvensseissä kvantifioidaan eri koeolosuhteissa. (b) 5′-johtajasekvenssejä kartoittavien kokonaislukemien suhde koodaavia sekvenssejä (CDS) kartoittaviin kokonaislukemiin stressittömissä soluissa (+N) ja typpinälkäisissä soluissa (-N) sekä CHX:llä käsitellyissä tai käsittelemättömissä soluissa (±CHX). Numerot ilmaisevat kertaeron -N- ja +N-näyteparien välillä. Tiedot on esitetty kahdesta biologisesta toistosta. (c) Hajontakuvio, jossa verrataan 5′:n johtaviin sekvensseihin ja koodaaviin sekvensseihin (CDS) kohdistuvien lukujen suhdetta yksittäisten geenien osalta; kussakin kuviossa verrataan stressaamattomia soluja (+N) ja typpinälkäisiä soluja (-N). Tiedot esitetään CHX:llä käsitellyistä soluista (vasemmalla) ja käsittelemättömistä soluista (oikealla). Punaiset viivat vastaavat suhdetta 1. (d) Kohdassa (c) esitettyjen suhteiden keskiarvot. Numerot ilmaisevat kertaeron -N- ja +N-näyteparien välillä. Tiedot on esitetty kahdesta biologisesta toistosta.

Ribosomien jakautuminen koodaavia sekvenssejä pitkin

S. Cerevisiae-soluissa on havaittavissa epäsymmetrinen ribosomien jakautuminen koodaavissa sekvensseissä, ja koodaavan sekvenssin ensimmäisten ~300-400 nukleotidin kohdalla on laaja korkeamman ribosomimäärän huippu1, 9, 14, 20, jota erilaiset stressit voimistavat voimakkaasti1, 8, 12.

Tutkimme tätä ilmiötä S. pombea kahdella tavalla: ensinnäkin laskemalla nukleotidien 10-400 ja 401-800 jalanjälkien suhdetta (Kuva 3a-c, ensimmäisiä yhdeksää nukleotidia ei otettu huomioon, jotta vältettäisiin ribosomien kasautumisen aiheuttamat vääristymät aloittaviin AUG:iin); toiseksi tutkimalla koko genomin laajuista ribosomitiheyttä koodaavien sekvenssien varrella edustavan metageenin käyttäytymistä (Kuva 3a-c). 3d ja täydentävä kuva S5).

Kuvio 3
kuvio3

Kuvio 3

kuvio3

CHX:n vaikutukset ribosomien jakaantumiseen koodaavissa sekvensseissä. (a) Koejärjestely: RPF:t nukleotideilla 10-400 ja nukleotideilla 401-800 kvantifioidaan eri koeolosuhteissa, ja molempien lukujen suhde lasketaan. (b) A kohdassa kuvatulla tavalla lasketut keskimääräiset suhteet kaikille koodaaville sekvensseille typpilähteen läsnä ollessa ja ilman typpilähdettä (±N) sekä CHX-käsittelyn läsnä ollessa ja ilman CHX-käsittelyä (±CHX). Numerot ilmaisevat parittaisten -N- ja +N-näytteiden välisen kertaeron. Tiedot on esitetty kahdesta biologisesta toistosta. (c) Hajontakuvio, jossa verrataan A kohdassa määriteltyjä suhdelukuja yksittäisten geenien osalta; kussakin kuviossa verrataan stressaamattomia soluja (+N) ja typpinälkäisiä soluja (-N). Tiedot esitetään CHX:llä käsitellyistä (vasemmalla) ja käsittelemättömistä (oikealla) soluista. Punaiset viivat vastaavat suhdetta 1. (d) Metageeni, joka esittää RPF:ien keskimääräiset jakaumat koodaavia sekvenssejä pitkin neljässä koeolosuhteessa. Juoksevaa 60 nukleotidin ikkunaa käytettiin tasoittamaan piirrettyjä viivoja.

Kuormituksen puuttuessa S. pombe -soluissa esiintyi pieniä hartioita sekä lääkkeen läsnäollessa että ilman lääkettä, jotka olivat samankaltaisia kuin ne, jotka on raportoitu ilman CHX:ää olleelle S. cerevisiae -solulle1, 14, 20 (kuva 3d ja täydentävä kuva S5). Ravintostressin yhteydessä S. pombe käyttäytyi samalla tavalla kuin S. cerevisiae 12. CHX:n läsnä ollessa lukemat kasaantuivat selvästi koodaavan sekvenssin 5′-osaan suurimmassa osassa geenejä (kuva 3c ja täydentävä kuva S5, vasen kaavio), mikä näkyi myös keskimääräisen tiheyden ~2,0-kertaisena kasvuna mRNA:n ensimmäisissä 400 nukleotidissa (kuva 3b). Sitä vastoin tämä lisäys oli vähäpätöinen lääkkeen puuttuessa sekä yksittäisiä geenejä tarkasteltaessa (kuva 3c (oikea kuvaaja) ja täydentävä kuva S5) että keskimääräisiä suhdelukuja mitattaessa (kuva 3b, huomaa, että molemmat replikaatit käyttäytyivät johdonmukaisesti). Lisäksi lukemien kertymisen CHX-riippuvuus typpinälässä vahvistettiin metageenitiedoilla (kuva 3d ja täydentävä kuva S5). Lopuksi todettiin, että tämä vaikutus oli spesifinen RPF:lle piirtämällä mRNA-seq-tietoihin perustuva metageeni (täydentävä kuva S5).

Pohdimme myös, soveltuisivatko nämä havainnot myös pienempiin geeneihin. Tässä tarkoituksessa loimme metageenit RP-geeneille ja pienille geeneille (alle 200 koodonia) RP-geenejä lukuun ottamatta. Molemmissa tapauksissa CHX aiheutti koodaavien sekvenssien 5′-puolella (erityisesti RP-geeneissä) selkeää lisääntymistä, joka oli riippuvainen sekä typen nälkiinnyttämisestä että CHX-käsittelystä (Täydentävä kuva S5).

Lisäksi oli havaittavissa ribosomien kasaantumista initiaatiokodoneihin (Täydentävä kuva S6). Tätä piirrettä esiintyi jo käsittelemättömissä soluissa, vaikkakin se lisääntyi CHX-inkuboinnin yhteydessä (sekä kontrolli- että typpinälkäisissä soluissa). Tämä rikastuminen oli hieman suurempaa typen kanssa nälkiintyneissä soluissa CHX-käsittelystä riippumatta (Täydentävä kuva S6).

Tämä on siis selkeä ribosomien kertyminen koodaavien sekvenssien alkuosaan, joka on konservoitunut S. pombe- ja S. cerevisiae -bakteereissa ja joka on havaittavissa sekä CHX-esikäsittelyllä että ilman sitä. Sitä vastoin stressin aiheuttamaa lisääntymistä ei havaita johdonmukaisesti ilman CHX:ää molemmissa hiivoissa, eikä näin ollen ole riittävästi näyttöä siitä, että sitä esiintyy in vivo. Tulevaisuudessa in vivo -ristikytkentästrategioiden25 käyttö voi auttaa erottamaan nämä kaksi tulkintaa toisistaan.

Kodonien miehitys

Periaatteessa yksittäisten koodonien normalisoitu ribosomaalinen miehitys liittyy aikaan, jonka ribosomi viettää kussakin koodonissa, ja näin ollen sitä voidaan käyttää keskimääräisten koodonispesifisten translaatiovauhtien arviointiin. Ensimmäiset kokeet tämän ilmiön tutkimiseksi antoivat kuitenkin ristiriitaisia tuloksia17,18,19,20. Hussmannin ym. tyylikkäässä tutkimuksessa, johon sisältyi uusia kokeita, lukuisten S. cerevisiae -bakteerista tehtyjen ribosomiprofilointikokeiden metaanalyysi ja matemaattinen mallinnus9 , todettiin, että nämä ristiriitaisuudet voitiin selittää CHX:n vaikutuksella kodonispesifisten ribosomimääritysten määrittämiseen. Eri ryhmien kokeissa, jotka tehtiin CHX:n läsnä ollessa, oli samanlaisia ribosomikodonien miehityksiä kuin ilman lääkettä tehdyissä kokeissa. CHX:n ja ilman CHX:ää tehtyjen kokeiden väliset korrelaatiot olivat kuitenkin hyvin alhaiset. Lisäksi CHX:n kanssa tehdyt kokeet johtivat koodonispesifisiin translaatiomääriin, jotka osoittivat negatiivisia korrelaatioita kognatiivisen tRNA:n runsauden kanssa, kun taas kokeet, joihin ei sisältynyt CHX-käsittelyä, osoittivat odotettuja positiivisia korrelaatioita9, 20. Hussmann et al. ehdottivat, että ribosomit eivät pysäytä translaatiota välittömästi, kun väliaineessa on CHX:ää. Sen sijaan translaatio jatkuu muutamien koodonien osalta koodonispesifisillä translaationopeuksilla9, mikä aiheuttaa artefaktuaalisia koodonien miehityksiä.

Tämän ilmiön tutkimiseksi analysoimme koodonispesifisiä ribosomien miehityksiä A-kohdissa menetelmissä kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna määrittelimme jokaisen lukeman, joka karttui koodaavaan sekvenssiin, ribosomin A-kohtaan (joka vastaa ribosomilta suojatun fragmentin nukleotidia 16). Tämän jälkeen laskimme kunkin koodonin normalisoidun miehityksen koko genomissa (jakamalla frekvenssi, jolla ribosomi sijaitsee kussakin koodonissa, koodonin määrällä mRNA:ssa). Jos vääristymiä ei ole, tämän arvon odotetaan heijastavan keskimääräistä aikaa, jonka ribosomi viettää kussakin kodonissa.

Vertailimme ensin CHX:n vaikutusta kodonispesifisiin ribosomaalisiin miehityksiin (kuva 4, täydentävät kuvat S7 ja S8). Yllättäen korrelaatio molempien kokeiden välillä oli hyvin korkea, keskiarvot olivat 0,82 typpinälässä (Kuva 4a ja Täydentävä kuva S7) ja 0,86 stressittömissä soluissa (Kuva 4b ja Täydentävä kuva S7). Vastaavissa vertailuissa S. cerevisiae -bakteerilla suurin osa korrelaatioista oli negatiivisia9. Esimerkiksi harvinaisilla koodoneilla, kuten CCG (proliini) ja CGG (arginiini), oli suurimpia miehityksiä ilman CHX:ää, mutta ne menettivät tämän rikastumisen CHX:llä käsitellyissä näytteissä9. Sitä vastoin S. pombe -aineistossa sekä CCG että CGG rikastuivat CHX:n läsnäolosta riippumatta (vaikkakin vähemmän voimakkaasti käsittelemättömissä soluissa, kuva 4c ja täydentävä kuva S7). Lisäksi ravitsemusstressillä oli hyvin vähäinen vaikutus kodonispesifisiin ribosomaalisiin miehityksiin sekä CHX:n läsnäollessa (kuva 4c ja täydentävä kuva S7, keskimääräinen R = 0,96) että ilman CHX:ää (kuva 4c ja täydentävä kuva S7, keskimääräinen R = 0,96). 4d ja Täydentävä kuva S7, keskimääräinen R = 0,98).

Kuvio 4
kuvio4

CHX:n vaikutus suhteellisiin kodonien miehityksiin. Menetelmissä kuvatulla tavalla saatuja suhteellisia koodonien miehityksiä kuvaavat hajontakuviot. Kukin piste vastaa yhtä kodonia. Lopetuskoodoneja ei ole esitetty. Harvinaisten koodonien CCG ja CGG sijainti on merkitty. Pisteviivat vastaavat 1,5-kertaisia eroja. Aineistojen väliset Pearsonin korrelaatiot on merkitty. (a) CHX-käsittelyn vaikutusten vertailu typpinälkäisissä soluissa. (b) Kuten kohdassa (a), typpilähteellä kasvatetuille soluille. (c) Typpinälän vaikutusten vertailu CHX:n läsnä ollessa. (d) Kuten kohdassa (c), ilman CHX:ää.

Viimeiseksi arvioimme korrelaatiota tRNA:n runsauden ja koodonispesifisten miehitysten välillä. Tämä tehtiin käyttämällä tRNA-adaptaatioindeksiä (tRNA Adaptation Index, tAI), joka on kunkin koodonin tRNA-käytön mitta, joka perustuu osittain tRNA:n kopiolukuun (korkeammat luvut ennustavat tehokkaampaa translaatiota)26. S. cerevisiae -kokeet, jotka suoritettiin CHX:n läsnä ollessa viljelmässä, osoittavat negatiivista korrelaatiota tAI:n käänteisluvun (1/tAI) ja koodonispesifisen miehityksen välillä, mikä ennustaa, että koodonit, joilla on matala tAI (ja siten matala tRNA:n määrä), käännetään nopeammin. Sitä vastoin kokeet soluilla, joita ei esikäsitelty CHX:llä, osoittivat odotetun positiivisen korrelaation 1/tAI:n välillä (vaikkakin todelliset arvot vaihtelivat suuresti kokeiden välillä)9. S. pombe -bakteerissa havaitsimme, että jokaisessa kahdeksassa ribosomiprofilointikokeessa koodonispesifisillä miehityksillä oli positiivinen korrelaatio 1/tAI:n kanssa, keskimäärin 0,39 (taulukko 2).

Taulukko 2 Suhteellisten koodonien miehitysten ja 1/tAI:n väliset korrelaatiot.

Tuloksemme osoittavat, että CHX:llä on S. pombe -bakteerissa verrattain vähäinen vaikutus ribosomien asentoon spesifisten koodonien päällä. Tämä voisi selittyä sillä, että S. pomben solut ovat erityisen herkkiä CHX:lle, jolloin CHX estäisi ribosomien liikkeet nopeammin ja täydellisemmin kuin S. cerevisiaessa. Tämä ominaisuus estäisi ribosomien liikkumisen muuttuneella nopeudella (jonka oletetaan tapahtuvan S. cerevisiaessa) ja johtaisi tilanteeseen, jossa S. pomben CHX:llä käsitellyillä ja käsittelemättömillä soluilla olisi samankaltaiset ribosomijakaumat vakaassa tilassa. Se, että harvinaiset koodonit rikastuvat vähemmän CHX:n läsnä ollessa, viittaa kuitenkin siihen, että CHX olisi jätettävä pois kokeissa, joiden tarkoituksena on määrittää koodonispesifiset ribosomijakaumat.

Leave a Reply