ENU

Zilien in der Zell-Zell-Signalübertragung bei Vertebraten

Im Jahr 2003 wurden in einem ENU-Mutagenese-Screening unerwartet primäre Zilien und IFT in die Shh-Signalübertragung einbezogen: IFT-Mutationen in Mäusen führten zu Phänotypen der Neuralrohr- und Gliedmaßenknospenbildung, die denen ähneln, die aus einer Unterbrechung des Shh-Signalwegs resultieren (Huangfu et al., 2003). Primäre Zilien sind unbewegliche, auf Mikrotubuli basierende Organellen, die aus den meisten Wirbeltierzellen herausragen. Sie gehen von Basalkörpern aus und bestehen aus spezialisierten Membranen (die strukturell von der Plasmamembran getrennt sind), die ein zentrales Axonem umgeben, entlang dessen die IFT-Maschinerie den retrograden und anterograden Transport zwischen der Zilienbasis und -spitze ermöglicht. Eine Störung der Ziliogenese oder der IFT führt zu einem breiten Spektrum menschlicher Ziliopathiesyndrome. Zu den primären Zilienstörungen gehören Polydaktylie, kraniofaziale und Hirnfehlbildungen, Situs inversus, polyzystische Nierenerkrankung, Fettleibigkeit, Diabetes und subtile Defekte in Leber, Milz und Herz (Nigg und Raff, 2009; Goetz und Anderson, 2010; Hildebrandt et al, 2011).

Die Zilienentstehung und der Abbau der primären Zilien sind eng mit der Zellzyklusmaschinerie gekoppelt: Primäre Zilien sind auf ruhenden Zellen vorhanden, aber ihr Abbau ist für den Übergang in den Zellzyklus erforderlich. Fgf- und Wnt-Signale sind für die Zilienbildung in verschiedenen Wirbeltierkontexten erforderlich, einschließlich des Knotens/Kupffer-Vesikels (KV), der Oticus-Vesikel und der Pronephralgänge (Basu und Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Zu den Transkriptionszielen dieser Signalwege, die die Zilienbildung, -musterung oder -funktion vermitteln, gehören Ift88, Enc1-like und die ziliogenen TFs Foxj1 und Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Epistase-Experimente, die KV untersuchten, haben nahegelegt, dass die Wnt-Signalisierung bei der Zilienbildung stromabwärts von Fgfs wirkt (Caron et al., 2012).

In Wirbeltieren nutzt der Shh-Signalweg Zilien als spezialisierte Signalorganelle, in der IFT Veränderungen in der Proteinlokalisierung vermittelt, die für die Gli-Verarbeitung und die sich daraus ergebenden transkriptionellen Reaktionen wesentlich sind (Abbildung 1.1B). Der Hh-Rezeptor Patched (Ptc) befindet sich in Abwesenheit von Hh an der Basis des primären Ziliums. In Anwesenheit von Hh verlässt Ptc das Zilium und Smo tritt ein, und es kommt zu einem Anstieg der in der Spitze lokalisierten Gli. Gli-Sufu-Komplexe reichern sich in den Spitzen der primären Zilien in einer Smo-abhängigen Weise an und müssen für die Aktivierung des Shh-Signalwegs dissoziiert werden (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, dessen Ortholog die Ci/Gli-Verarbeitung fördert und Sufu in Drosophila antagonisiert, wird durch Hh von der Zilienbasis zur Spitze anterograde transportiert. PKA, das Gli als Voraussetzung für die Proteolyse zu GliR phosphoryliert, lokalisiert sich an der Basis der primären Zilien und reguliert die Menge des in der Spitze lokalisierten Gli (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studien zu Shh und Zilien/IFT haben gezeigt, dass einige menschliche Ziliopathie-Merkmale wahrscheinlich auf eine gestörte Shh-Signalübertragung zurückzuführen sind. Darüber hinaus können Ziliendefekte die Onkogenese aufgrund von Mutationen im Shh-Signalweg verstärken oder unterdrücken (Han et al., 2009). Zilien/IFT-Mutanten ähneln häufig LOF- oder GOF-Shh-Mutanten, da sie kontextspezifische Anforderungen an die durch Zilien vermittelte Verarbeitung von Gli zu GliA bzw. GliR erfüllen müssen. Zu den charakteristischen Phänotypen gehören die Ventralisierung des Neuralrohrs (die GliR nutzt) und Polydaktylie (die Gliedmaßenknospen nutzen GliA; diskutiert in Goetz und Anderson, 2010). Mutationen in IFT- und Ciliopathie-Genen haben dazu beigetragen, neue Kontexte zu identifizieren, in denen Zilien für die Zellsignalisierung bei der Entwicklung erforderlich sind. In einigen Fällen haben diese Experimente Licht auf die Ätiologie schlecht verstandener menschlicher Ciliopathie-Merkmale geworfen. So haben zum Beispiel Studien mit Rpgrip11 (einem menschlichen Ciliopathie-Gen) und mit mutierten Ttc21b-Mäusen gezeigt, wie wichtig die primären Zilien für die Vermittlung von Shh-Signalen im ventralen Vorderhirn sind. Ttc21b-Mutanten haben abnorme primäre Zilien mit teilweise defektem retrograden Transport, aber funktionierendem anterograden Transport. Dies führt zu einem GOF-Phänotyp, der sich in einer Anhäufung von Shh-Signalmaschinen in den Zilienspitzen und einer Zunahme der Shh-Expression/Aktivität im ventralen Telencephalon und der Zona limitans intrathalamica zeigt (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Rpgrip1l-Mutanten haben Neuroepithelzellen des Vorderhirns, denen primäre Zilien fehlen und die keine prozessierten Gli produzieren, wie es für Shh LOF erwartet wird (Besse et al., 2011). Diese Mutationen führen beide zu einer Ausdehnung des Subpalliums auf Kosten des Palliums, ähnlich wie bei Gli3-Mutanten, da der vorherrschende Output der Shh-Signalgebung im ventralen Vorderhirn die Verarbeitung von Gli3 zu seiner Repressorform ist (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Wenn das aktive Gli3R-Protein genetisch eingeführt wird, sind Zilien in diesem Zusammenhang überflüssig (Besse et al., 2011). Defekte in der ventralen Vorderhirnstrukturierung können bei einigen Ziliopathien kognitiven Beeinträchtigungen zugrunde liegen.

Shh-bezogene Defekte sind nicht für alle Phänotypen bei menschlichen Ziliopathien verantwortlich. Es hat sich gezeigt, dass IFT/Zilien in einigen Zusammenhängen dazu dienen, die Signalübertragung durch andere Wege zu erleichtern. Während der Hautentwicklung bei Säugetieren sind primäre Zilien für die terminale Differenzierung der suprabasalen Zellen unerlässlich, ein Prozess, der durch Notch/Delta-Signale eingeleitet wird (Abbildung 1F; Blanpain et al., 2006). In ∼60-70 % der suprabasalen Zellen ist Notch in den primären Zilienmembranen konzentriert, und Presenilin, ein Protein des γ-Sekretase-Komplexes, das Notch spaltet, ist in den Basalkörpern lokalisiert (Ezratty et al., 2011). Das Ausschalten von IFT-Genen oder die Eliminierung von Zilien in vivo führt zu einer verringerten Notch-Reporteraktivität und einer beeinträchtigten suprabasalen Zelldifferenzierung. Darüber hinaus wurde NICD, die aktive gespaltene Form von Notch, in den Kernen von Zilienzellen, nicht aber von Zellen ohne Zilien in genetischen Chimären beobachtet (Ezratty et al., 2011).

Zilien wurden auch in die PDGF-Signalübertragung einbezogen. In kultivierten Fibroblasten wurde PDGFRα in primären Zilienmembranen beobachtet, und die RTK-aktivierten Signaltransduktionsproteine MEK1/2 und Akt sind entlang des Ziliums bzw. an der Zilienbasis lokalisiert (Schneider et al., 2005). Studien mit Wildtyp- und Ift88-Mutanten (keine primären Zilien) zeigten, dass sich die primären Zilien der führenden Zellen zu den Wundstellen hin orientieren und für PDGF-AA-induzierte Chemotaxis und Phospho-Akt-Reaktionen in vitro erforderlich sind (Schneider et al., 2010). Insbesondere weisen mutierte Ift88-Mäuse Defekte bei der Wundheilung auf (Schneider et al., 2010). Die PDGF-Signalübertragung durch PDGFRα wurde auch mit dem Abbau der Zilien und dem Übergang der G1-S-Phase in Verbindung gebracht (diskutiert in Christensen et al., 2012), obwohl die In-vivo-Bedeutung dieser Beobachtung noch nicht bekannt ist.

Die Rolle der Zilien bei der kanonischen Wnt-Signalübertragung ist umstritten (besprochen in Wallingford und Mitchell, 2011). Studien an Ift88- und Ift72-mutierten Mäusen und Zebrafischen deuten darauf hin, dass Zilien für die Wnt-Signalgebung während der Embryogenese nicht essentiell sind, und Studien zur Wnt-Signalgebung bei Kif3a-mutierten Mäusen ergaben widersprüchliche Ergebnisse (Huang und Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Bei retrograden IFT-Mutanten berichtete eine Gruppe über keine Veränderung der Wnt-Signalgebung, während eine andere Gruppe eine Abnahme der Wnt-Aktivität in Kontexten, in denen Zilien erhalten bleiben, aber eine Zunahme der Wnt-Signalgebung in Kontexten, in denen Zilien verloren gehen, nachwies (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Studien zu den Zilien-/Ciliopathie-Proteinen Inversin, Chibby und Jouberin belegen die Rolle der Zilien bei der kanonischen Wnt-Signalgebung in bestimmten Entwicklungskontexten. Inversin, das bei menschlichen Patienten mit Nephronophthisis Typ II mutiert ist, wird in Monozilien von Wirbeltieren exprimiert, interagiert physisch mit Disheveled (Dsh) und unterbricht in vitro die kanonische Wnt-Signalübertragung stromabwärts von Dsh (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Inversin-mutierte Mäuse zeigen Phänotypen der Nieren- und Haarmusterung, die an Wnt/Frz-Phänotypen erinnern, sowie Phänotypen der Links-Rechts-Musterung, die wahrscheinlich auf Defekte in der Funktion der Knoten-Monozilien zurückzuführen sind (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, ein Basalkörperprotein, das für die Ziliogenese und das Andocken des Basalkörpers erforderlich ist, interagiert physisch mit β-Catenin und reguliert negativ die kanonische Wnt-Signalübertragung in Drosophila-Embryonen, Lungenepithelien von Säugetieren und kultivierten Säugetierzellen (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Schließlich ist das menschliche Ziliopathie-Protein Jouberin in Mäusen für eine normale Wnt-Signalübertragung und Proliferation an der Kleinhirnmittellinie erforderlich. Dies trägt wahrscheinlich zu dem Defekt bei der Fusion der Kleinhirnhälften bei, der bei Patienten mit Joubert-Syndrom und Mäusen mit Jouberin-Mangel beobachtet wird (Lancaster et al., 2011a). In Zilienzellen, die Wnt ausgesetzt sind, wird Jouberin zusammen mit β-Catenin auf IFT-abhängige Weise in Basalkörpern sequestriert. Jouberin erleichtert die nukleäre Translokation von β-Catenin; seine Sequestrierung in den Basalkörpern behindert die nukleäre Translokation von β-Catenin und dämpft die kanonischen Wnt-Signalantworten (Lancaster et al., 2011b). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Zilien nicht global für die Wnt-Signalgebung während der Embryogenese erforderlich sind, aber in bestimmten Kontexten die Ergebnisse der Wnt-Signalgebung beeinflussen.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Zilien eine spezialisierte sensorische Struktur darstellen, innerhalb derer mehrere Arten von Signalen koordiniert werden. Ein alternatives Modell geht davon aus, dass Zilien eine Spezifität der Signalwege aufweisen (wie Zytoneme, siehe unten) und dadurch die zelluläre Reaktionsfähigkeit einschränken und/oder die Signalantworten räumlich trennen. Die Spezifität der ziliären Signalübertragung könnte durch eine unterschiedliche Ausrichtung der Signalproteine auf die Zilien und/oder durch die Verwendung verschiedener Untergruppen von IFT-Proteinen oder ladungsspezifischer Adaptoren für den Axonemtransport vermittelt werden (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).