Mutationer i FLNB forårsager boomerang-dysplasi | Journal of Medical Genetics
Boomerang-dysplasi (OMIM #112310) er en dødelig skeletdysplasi, der er karakteriseret ved uorganiseret skeletforbening.1 Karakteristiske radiologiske fund omfatter uregelmæssig ossifikation af lemmernes knogler og hvirvler, underudvikling af acetabulum og hypoplastiske, boomerangformede femora, hvorfra lidelsen har sit navn.1 Mindst otte tilfælde er beskrevet i litteraturen til dato.1-8 En lignende dødelig skeletdysplasi, Piepkorn-dysplasi,9 er blevet foreslået som allelisk til boomerang-dysplasi.2,7 Bruskhistologi viser både desorganiserede bruskanlagen i den lange knogle under udvikling og hyppige multinuklede chondrocytter i reservezonen i vækstpladen.1 Andre udviklingsmæssige abnormiteter uden for skelettet er blevet beskrevet, herunder omphalocele og encephalocele.
Sammenfald i de radiografiske og histologiske fund af boomerangdysplasi og atelosteogenese I (AOI; OMIM #108720) og III (AOIII; OMIM #108721) har antydet allelisme for disse lidelser.2,10 I alle tre enheder omfatter de radiografiske fund mangelfuld og uregelmæssig forbening af knogler og hvirvellegemer med distal humerushypoplasi og leddislokationer ud over kraniofaciale abnormiteter.11 Desuden er der observeret multinuklede chondrocytter i både AOI og boomerangdysplasi. Boomerangdysplasi adskiller sig fra AO på grundlag af en mere alvorlig defekt i mineraliseringen med fuldstændig fravær af forbening i nogle lemelementer og hvirvelsegmenter.3 En overvægt af mænd blandt de rapporterede tilfælde af boomerangdysplasi7 og visse fænotypiske ligheder med forstyrrelser i spektret af otopalatodigitale syndromer forårsaget af mutationer i FLNA-genet12,13 foreslog for nogle forfattere en X-relateret ætiologi.7
For nylig beskrev vi forbindelsen mellem mutationer i det gen, der koder for det 280 kDa cytoskeletale protein filamin B, og flere lidelser, der er karakteriseret ved skeletdefekter og leddislokationer.14 Filamin B er et modulært protein. Et actinbindingsdomæne bestående af to calponinhomologidomæner (CH1 og CH2) er placeret ved aminoterminen, efterfulgt af et stangdomæne bestående af 24 strukturelt homologe gentagelser og afsluttet i et carboxyterminalt dimeriseringsdomæne.15 Det aktinbindende domæne i filamin B ligner dem, der findes i andre cytoskeletale proteiner, såsom β-spectrin, dystrofin og α-actinin-4.
Fire forskellige tilstande er blevet tilskrevet mutationer i FLNB: AOI, AOIII, recessivt nedarvet spondylcarpotarsalt syndrom (OMIM #272460) og en dominerende form af Larsens syndrom (OMIM #150250). Individer med AOI, AOIII og dominant arvet Larsen syndrom viste sig at være heterozygote for missense mutationer i FLNB.14 Størstedelen af de mutationer, der fører til AOI eller AOIII, fører til substitutioner lokaliseret til CH2-domænet i filamin B’s aktinbindende domæne. Den eneste undtagelse er mutationen 2251G→C, lokaliseret i exon 15, som forudsiges at føre til substitutionen G751R i gentagelse 6, fundet hos et individ med AOIII.14 Under det arbejde, der identificerede gruppen af lidelser som følge af mutationer i FLNB, blev et individ med boomerangdysplasi vurderet for mutationer ved direkte sekventering, men der blev ikke identificeret nogen mutation.14
I betragtning af de radiografiske, fænotypiske og histologiske beviser, der tyder på, at boomerangdysplasi er relateret til lidelser forårsaget af mutationer i gener, der koder for filaminer, undersøgte vi to individer med boomerangdysplasi for mutationer i FLNA og FLNB ved hjælp af denaturerende højtydende væskekromatografi (DHPLC) analyse som screeningsteknik.
Individuel 1 var det tilfælde, der tidligere var undersøgt ved direkte sekventering. Dette mandlige foster var det første barn af ikke-konsanguinerede, raske forældre. Ultralydsscanning i andet trimester afslørede thorakal hypoplasi og markant forkortelse af alle lemmer med uregelmæssig ossifikation af flere skeletelementer. Fosteret blev født ved 22 ugers gestation. Post mortem-analysen viste udtalt thorakal hypoplasi, korte lemmer og den karakteristiske ansigtsdysmorfisme, der er forbundet med boomerangdysplasi. Der var ingen encephalocoele eller omphalocoele til stede. De radiografiske fund var typiske for boomerangdysplasi (fig. 1).
Røntgenbillede af tilfælde 1. Calvarium, rygsøjle og pubis er underosset med en tydelig thorakal skoliose. Der er alvorlig mikromelia med uossede humeri, fraværende femora og stærkt bøjede og forkortede radii, ulnae og tibiae. Der ses ingen forbening i hænder eller fødder.
Individ 2 var et foster på 17 ugers gestation, som tidligere er beskrevet i detaljer af Wessels et al.8 Dette foster udviste alvorlig mikromelia med to af de tre lange rørknogler, der manglede i alle fire lemmer. Ved radiografisk undersøgelse var de resterende radiusben boomerangformede, skinnebenene var segmentlignende, rygsøjlen var dårligt forbenet, og thorax var hypoplastisk. Histologisk var bruskmatrixen hypocellulær med tilstedeværelse af multinukleede kæmpe-kondrocytter.
Den kodende region og intron-exon splejsningsforbindelser af både FLNA og FLNB blev amplificeret fra genomisk DNA fra begge tilfælde ved hjælp af introniske primere, der er beskrevet tidligere13,14 (reaktionsbetingelser og primersekvenser er tilgængelige på anmodning). Til analyse af FLNA blev ampliconprodukterne visualiseret ved agarosegelelektroforese og derefter blandet med lige store mængder PCR-amplificerede produkter fra en ubeslægtet sund mandlig kontrol før heteroduplexdannelse. Prøverne blev underkastet DHPLC på et WAVE DNA-fragmentanalysesystem (Transgenomic Inc.) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Amplikoner, der viser anomale sporformer, blev re-amplificeret og cyklus-sekventeret på en ABI 3100-sekventeringsmaskine. Identificerede mutationer blev bekræftet ved restriktionsenzymdigest af amplificeret DNA, og afstamning blev bekræftet som erklæret for tilfælde 1 ved segregering af seks ikke-linkede mikrosatellitmarkører. Forældreprøver var ikke tilgængelige for tilfælde 2. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Otago.
Undersøgelse af FLNB (exon 1-46) afslørede mutationer hos begge personer. I tilfælde 1 blev det påvist, at individet var heterozygot for mutationen 512T→G, som forudsiges at føre til substitutionen L171R. Denne mutation skaber et sted for restriktionsenzymet HpaII, hvilket gjorde det muligt at påvise, at den var opstået de novo i denne familie (fig. 2), hvilket gav genetisk bevis for patogenicitet. Set i bakspejlet var denne mutation til stede i den oprindelige analyse, men den blev overset. Den anden mutation, 703T→C, blev fundet i exon 4 i tilfælde 2 og forudsiger substitutionen S235P (fig. 2). Forældreprøver var ikke tilgængelige, men denne mutation var ikke til stede i 100 kontrolkromosomer. Begge mutationer forudsiges at ændre rester inden for CH2-regionen af filamin B’s actinbindingsdomæne. Disse rester er meget evolutionært bevaret blandt filaminer fra hvirveldyr (fig. 3). Mutationerne tyder på, at disse aminosyrer spiller en kritisk rolle i actinbindingsdomænets funktion. For 703T→C-mutationen er den samme substitution blevet observeret på den analoge rest i ACTN4, et gen, der koder for cytoskelettets adapterprotein α-actinin-4 (fig. 3), hos en patient med fokal og segmental glomerulosklerose.16
Kromatogrammer og restriktionsendonukleasefordøjelser, der påviser mutationer, der er forbundet med boomerangdysplasi. (A) Tilfælde 1, der viser heterozygositet for mutationen 512T→G og restriktionsendonukleasefordøjelse ved hjælp af HpaII. Analyse af forældrene (spor 1 og 3) er vist sammen med analysen af proband (spor 2). (B) Tilfælde 2, der viser heterozygositet for mutationen 703T→C og restriktionsendonukleasefordøjelse med DrdI. Analyse af amplificeret DNA fra proband (lane 1) og en sund, ubeslægtet kontrol (lane 2). Fragmentstørrelser er angivet i bp.
ClustalW-udligning af filamin og proteiner med aktinbindende domæner fra menneske, mus, Drosophilia melanogaster, Anopheles gambiae, Dictyostelium discoideum og Caenorhabditis elegans. (A) sekvenskontekster omkring resterne L171; (B) S235. Hyp-Fln, hypotetisk filamin.
Sygdomsrelaterede substitutioner inden for det aktinbindende domæne af filamin B fører til en mangfoldighed af fænotyper. Vi har tidligere rapporteret om substitutioner, der fører til AOI (n = 3), AOIII (n = 1) og Larsens syndrom (n = 2).14 Alle disse fænotyper er forbundet med defekter i skeletogenese og leddannelse. Identifikationen af mutationer, der fører til substitutioner inden for filamin B’s actinbindingsdomæne i filamin B hos to patienter med boomerangdysplasi, bekræfter, at denne tilstand er allelisk til disse lidelser, hvilket afspejler tidligere kliniske mistanker om slægtskab.2,3
En del af de mutationer, der forårsager det otopalatodigitale spektrum af skeletforstyrrelser, ligger inden for den analoge CH2-region i FLNA. Disse mutationer fører også til et bredt spektrum af fænotypisk sværhedsgrad.13 Der er ingen simpel korrelation mellem placeringen af disse mutationer og sværhedsgraden af de resulterende defekter i skeletforbening. Mens otopalatodigitalt syndrom type 1 manifesterer sig mere mildt end otopalatodigitalt syndrom type 2, kan disse tilstande skyldes substitutioner på rester i umiddelbar nærhed af hinanden eller endog på den samme rest.13,17 Observationen af, at mutationer i det actinbindende domæne af FLNB også kan føre til et bredt spektrum af sværhedsgrad, rekapitulerer dette mønster. Den substitution, der forudsiges af den mutation, der blev fundet hos individ 1, L171R, ligger i umiddelbar nærhed af stedet for en substitution (A173V), der er årsag til AOI.14 På samme måde ligger S235P-substitutionen, der er rapporteret her, inden for den samme proteinfold som E227K, en substitution, der er forbundet med den mindre alvorlige, ikke-dødelige fænotype, Larsen syndrom.14 På trods af rapporter om sygdomsassocierede substitutioner i rester inden for CH2 af det aktinbindende domæne af dystrophin, α-actinin-4,17 filamin A,13 og filamin B,14 er en funktionel rolle for denne proteinfold ikke blevet endeligt belyst. Da CH2-domæner isoleret set ikke har nogen medfødte actinbindende egenskaber, er det blevet postuleret, at CH2’s rolle i actinbindingen i bedste fald er indirekte.18
Filaminer virker primært til at stabilisere actin i cellen, enten som parallelle bundter eller ortogonale gelnetværk.19,20 Der er identificeret flere bindingspartnere for filamin A, hvoraf langt de fleste associerer gennem filaminrepeats 16-24 (gennemgået i Stossel et al21). Fem bindingspartnere er blevet vist at associere med filamin B: actin, FBLP-1,22 presenilin (PS1 og PS2),23 og GPIβα.24 Det er endnu uvist, om mutationer inden for de actinbindende domæner af filamin A og B udøver deres patogene virkning primært ved at forstyrre actinbindingen eller gennem en funktionel afhængighed mellem actinassociation og bindingsinteraktioner med andre proteiner.
Multinucleated giant cells findes blandt chondrocytter i vækstpladen hos personer med boomerangdysplasi. Disse forekomster kan skyldes defekt cellespaltning under proliferation af chondrocytter i den epifysiske vækstplade. Vi har tidligere påvist udbredt ekspression af FLNB i vækstpladen og især i spaltningsfuren af delende chondrocytter.14 Processen med ændret cellespaltning, der fører til både den defekte skeletmønsterdannelse og mineralisering i boomerangdysplasi/atelosteogenese-gruppen af lidelser, skal stadig belyses.
Den identifikation af mutationer, der forårsager boomerangdysplasi i FLNB, bekræfter boomerangdysplasi som en del af chondrodysplasispektret, herunder AOI og III og det ikke-dødelige Larsen-syndrom. Fænotypisk overlapning mellem boomerangdysplasi og AO, som rapporteret her og tidligere, og kolokalisering af mutationer, der ligger til grund for disse sygdomme, i exoner, der koder for actinbindingsdomænet i FLNB, er tegn på et klinisk-patologisk spektrum for disse sygdomme. Denne yderligere udvidelse af det fænotypiske spektrum, der er forbundet med mutationer i FLNB, understreger betydningen af et funktionelt actincytoskelet for mange normale morfogenetiske processer, herunder skeletogenese.
Leave a Reply