Integrated Microscopy Center

Som en standardmikrotom fungerer en kryostat til at opnå tynde (1-10 mm tykkelse) snit fra et stykke væv, men mens en standardmikrotom udfører operationen ved stuetemperatur, giver kryostaten operatøren mulighed for at skære vævet ved lav temperatur (-20 til -30 C). I en kryostat er kniven og prøven anbragt i en opretstående stationær fryser/kammer, mens hjulet til at dreje prøveholderen er placeret eksternt.

Tvæv til kryostatsnitning behøver ikke at blive fikseret i formalin i timer eller dage, som det er tilfældet ved rutinemæssig histologi. I stedet kryofikseres vævene straks efter udtagning af prøverne. Til kryofiksering anbringes vævsstykkerne i et tyktflydende, gelagtigt medium (OCT) og nedsænkes i isopentan, der er afkølet med tøris eller flydende nitrogen.

Til sektionering placeres de frosne OCT-vævsblokke på en metalplade, som bringer deres temperatur ned på -20 til -30 C. Når denne temperatur er nået, monteres prøven på mikrotomspændet og sektioneres. Når der er opnået snit af tilfredsstillende kvalitet, monteres de på et objektglas ved stuetemperatur (~20 C). Den højere temperatur på objektglasset i forhold til vævsafsnittet får afsnittet til øjeblikkeligt at smelte og klæbe til glasset.

Den samlede proces fra kryofiksering til opnåelse af sektioner på glasplader kan tage så lidt som 10 til 20 minutter, hvilket giver mulighed for hurtig analyse af prøverne.

Anvendelser

Kryostatsektionering giver to hovedfordele i forhold til standard histologisk mikrotomsektionering. For det første er gennemløbstiden fra fiksering til vævssnit meget kortere. For det andet er proteinantigeniciteten bedre bevaret, og derfor er kryostatsektioner velegnede til immunofluorescensfarvning af flere proteiner i den samme vævssektion.

En ulempe ved kryostatsektionering i forhold til standard histologisk mikrotomsektionering er, at de cytologiske træk ved hæmatoxylin-eosin (H&E) farvede paraffinindlejrede vævssektioner er bedre end ved H&E farvede kryostatsektioner. Dette skyldes, at der kan dannes iskrystaller under kryofikseringsprocessen, som vil forvrænge cytoarkitekturen. Desuden har kryofikserede væv, der er indlejret i OCT, tendens til at frysetørre, og de bør ideelt set skæres umiddelbart efter kryofiksering eller opbevares under forhold, der minimerer frysetørring.

Specifikationer for Shandon FE-kryostaten

• Touch screen display til indstilling af sektioneringsparametre
• Sektionstykkelsesjustering 1-20 μm i 1μm justeringer og 20-60 μm i 5μm justeringer
• Vertikal skærehøjde 57mm
• Horisontal prøvefremføring på 25 mm
• Kryokammertemperaturkontrol 0° til -35°C
• Kryobar og dedikeret justerbart kryobar-kølesystem til -55°C. Kryobarens kølesystem afkøler prøven på så lidt som to timer og forhindrer samtidig frysning
• Prøveholderens temperaturkontrol 0° til 40°C (±10° af kammertemperaturen)
• Positivt låsende svinghjul for at forhindre skader ved arbejde omkring bladet og prøven
• Automatisk gasningscyklus til desinfektion af kammeret
• Bruger CFC-frie kølemidler og skumisolering
• Dobbelt kompressorsystem for at sikre prøvernes integritet ved at holde prøverne frosne, hvis cryobaren svigter
• Ergonomisk design, herunder en justerbar fodstøtte i tre niveauer for at hjælpe med at reducere træthed, mens man sidder eller står, og et hævet skæreområde for at hjælpe med at forhindre rygspændinger under sektionering