ENU

Cilia i vertebraternes celle-celle-signalering

I 2003 involverede en ENU mutagenesescreening uventet primære cilia og IFT i Shh-signalering: IFT-mutationer i mus resulterede i neuralrørs- og lemknoppemønsterfænotyper, der ligner dem, der skyldes afbrydelse af Shh-vejen (Huangfu et al., 2003). Primære cilia er ikke-motile, mikrotubuli-baserede organeller, der stikker ud fra de fleste hvirveldyrceller. De strækker sig fra basallegemer og består af specialiserede membraner (strukturelt adskilt fra plasmamembranen) omkring et centralt axoneme, langs hvilket IFT-maskineriet letter retrograd og anterograd transport mellem ciliærbasis og -spids. Forstyrrelser i ciliogenese eller IFT resulterer i et bredt spektrum af humane ciliopati-syndromer. Primære ciliaforstyrrelser omfatter polydaktyli, kraniofaciale og hjernemalformationer, situs inversus, polycystisk nyresygdom, fedme, diabetes og subtile defekter i leveren, milten og hjertet (Nigg og Raff, 2009; Goetz og Anderson, 2010; Hildebrandt et al,

Ciliogenese og nedbrydning af primære cilier er tæt koblet til cellecyklusmaskineriet: primære cilier er til stede på hvilende celler, men deres nedbrydning er nødvendig for overgang til cellecyklusen. Fgf- og Wnt-signalering er påkrævet opstrøms for ciliogenese i flere sammenhænge hos hvirveldyr, herunder knude/Kupffer’s vesikel (KV), otiske vesikler og pronephric ducts (Basu og Brueckner, 2009; Liu et al., 2011; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Transkriptionelle mål for disse signalveje, der medierer ciliernes dannelse, mønsterdannelse eller funktion, omfatter Ift88, Enc1-lignende og de ciliogene TF’er Foxj1 og Rfx2 (Neugebauer et al., 2009; Caron et al., 2012; Qian et al., 2013). Epistaseeksperimenter, der studerer KV, har antydet, at Wnt-signalering fungerer nedstrøms for Fgfs i ciliogenese (Caron et al., 2012).

I hvirveldyr udnytter Shh-vejen cilia som en specialiseret signalorganel, hvor IFT medierer ændringer i proteinlokalisering, der er afgørende for Gli-behandling og deraf følgende transkriptionelle reaktioner (Figur 1.1B). Hh-receptoren Patched (Ptc) befinder sig ved basen af det primære cilium i fravær af Hh. Ved tilstedeværelse af Hh forlader Ptc ciliet, og Smo kommer ind, og der sker en stigning i Gli lokaliseret i spidsen. Gli-Sufu-komplekser er beriget i spidserne af primære cilier på en Smo-afhængig måde og skal dissocieres for aktivering af Shh-vejen (Humke et al., 2010; Tukachinsky et al., 2010). Kif7, hvis ortolog fremmer Ci/Gli-processering og antagoniserer Sufu i Drosophila, gennemgår Hh-induceret anterograd transport fra ciliumbasen til spidsen. PKA, som fosforylerer Gli som en forudsætning for proteolyse til GliR, lokaliseres til basen af primære cilier og regulerer niveauerne af spidslokaliseret Gli (Pan et al., 2006; 2009; Tuson et al., 2011).

Studier af Shh og cilier/IFT har indikeret, at nogle menneskelige ciliopatitræk sandsynligvis skyldes forstyrret Shh-signalering. Desuden kan ciliedefekter forstærke eller undertrykke onkogenese på grund af mutationer i Shh-vejen (Han et al., 2009). Cilia/IFT-mutanter ligner ofte LOF- eller GOF Shh-mutanter på grund af kontekstspecifikke krav til cilia-medieret behandling af Gli til henholdsvis GliA eller GliR. De karakteristiske fænotyper omfatter ventralisering af neuralrøret (som anvender GliR) og polydaktyli (lemknopper anvender GliA; diskuteret i Goetz og Anderson, 2010). Mutationer i IFT- og ciliopatigener har bidraget til at identificere nye sammenhænge, hvor cilia er nødvendige for udviklingscellesignalering. I nogle tilfælde har disse eksperimenter kastet lys over ætiologierne af dårligt forståede menneskelige ciliopatitræk. For eksempel viste undersøgelser af Rpgrip11 (et humant ciliopati-gen) og Ttc21b-mutante mus, at primære cilier er vigtige for formidlingen af Shh-signaler i den ventrale forhjerne. Ttc21b-mutanter har unormale primære cilier med delvist defekt retrograd transport, men funktionel anterograd transport. Dette resulterer i en GOF-fænotype, hvilket fremgår af ophobning af Shh-signalmaskineriet i ciliespidserne og udvidelse af Shh-ekspression/aktivitet i det ventrale telencephalon og zona limitans intrathalamica (Tran et al., 2008; Stottmann et al., 2009). Rpgrip1l-mutanter har forhjernens neuroepithelceller, der mangler primære cilia og er mangelfulde i produktion af forarbejdede Gli, som forventet for Shh LOF (Besse et al., 2011). Disse mutationer resulterer begge i udvidelse af subpallium på bekostning af pallium, svarende til Gli3-mutanter, fordi det fremherskende output af Shh-signalering i den ventrale forhjerne er behandling af Gli3 til sin repressorform (Stottmann et al., 2009; Besse et al., 2011). Hvis aktivt Gli3R-protein indføres genetisk, er cilier overflødige i denne sammenhæng (Besse et al., 2011). Defekter i den ventrale forhjernemønsterering kan ligge til grund for kognitive forringelser i nogle ciliopatier.

Shh-relaterede defekter forklarer ikke alle fænotyper i menneskelige ciliopatier. Det er blevet klart, at IFT/cilier bruges i nogle sammenhænge til at lette signaleringen fra andre veje. Under pattedyrs hududvikling er primære cilier afgørende for den terminale differentiering af suprabasale celler, en proces, der initieres af Notch/Delta-signalering (Figur 1F; Blanpain et al., 2006). I ∼60-70% af suprabasale celler er Notch koncentreret i primære ciliarmembraner, og presenilin, et protein i γ-sekretase-komplekset, som kløver Notch, er lokaliseret ved basale organer (Ezratty et al., 2011). Knock down af IFT-generne eller eliminering af cilia in vivo resulterer i nedsat Notch-reporteraktivitet og nedsat suprabasal celledifferentiering. Desuden blev NICD, den aktive kløvede form af Notch, observeret i kerner af cilierede, men ikke ucilierede celler i genetiske kimærer (Ezratty et al., 2011).

Cilia er også blevet impliceret i PDGF-signalering. I dyrkede fibroblaster er PDGFRα blevet observeret i primære ciliermembraner, og de RTK-aktiverede signaltransduktionsproteiner MEK1/2 og Akt er lokaliseret langs ciliet og ved ciliebasen, henholdsvis (Schneider et al., 2005). Undersøgelser af fibroblaster af vild type og Ift88-mutant (ingen primære cilier) viste, at primære cilier af ledende celler orienterer sig mod sårsteder og er nødvendige for PDGF-AA-induceret kemotaksi og phospho-Akt-reaktioner in vitro (Schneider et al., 2010). Navnlig udviser Ift88-mutante mus defekter i sårreparation (Schneider et al., 2010). PDGF-signalering gennem PDGFRα er også blevet impliceret i ciliernes afmontering og G1-S-faseovergangen (diskuteret i Christensen et al., 2012), selv om den in vivo betydning af denne observation endnu ikke er kendt.

Ciliernes rolle i den kanoniske Wnt-signalering har været kontroversiel (gennemgået i Wallingford og Mitchell, 2011). Undersøgelser af Ift88- og Ift72-mutante mus og zebrafisk antydede, at cilier ikke er essentielle for Wnt-signalering under embryogenese, og undersøgelser af Wnt-signalering i Kif3a-mutante mus gav modstridende resultater (Huang og Schier, 2009; Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). I retrograde IFT-mutanter rapporterede en gruppe ingen ændring i Wnt-signalering, mens en anden gruppe påviste et fald i Wnt-aktivitet i sammenhænge, der opretholder cilia, men en stigning i Wnt-signalering i sammenhænge, der mistede cilia (Ocbina et al., 2009; Lancaster et al., 2011b). Undersøgelser af de ciliære/ciliopati-proteiner Inversin, Chibby og Jouberin understøtter ciliernes rolle i den kanoniske Wnt-signalering i specifikke udviklingssammenhænge. Inversin, som er muteret hos humane patienter med nephronofte type II, udtrykkes i hvirveldyrs monocilia, interagerer fysisk med Disheveled (Dsh) og forstyrrer den kanoniske Wnt-signalering nedstrøms for Dsh in vitro (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Inversin-mutante mus udviser nyre- og hårmønsterfænotyper, der minder om Wnt/Frz-fænotyper, samt venstre-højre-mønsterfænotyper, der sandsynligvis skyldes defekter i knudemonocilia-funktionen (Watanabe et al., 2003; Simons et al., 2005). Chibby, et basallegemeprotein, der er nødvendigt for ciliogenese og basallegemets docking, interagerer fysisk med β-catenin og regulerer negativt den kanoniske Wnt-signalering i Drosophila-embryoer, pattedyrs lungeepithelier og dyrkede pattedyrsceller (Takemaru et al., 2003; Voronina et al., 2009; Love et al., 2010). Endelig er det humane ciliopatiprotein Jouberin påkrævet i mus for normal Wnt-signalering og proliferation ved den cerebellære midterlinje. Dette bidrager sandsynligvis til den cerebellære hemisfærefusionsdefekt, der er observeret hos patienter med Jouberts syndrom hos mennesker og Jouberin-manglende mus (Lancaster et al., 2011a). I cilierede celler, der er udsat for Wnt, er Jouberin sequesteret sammen med β-catenin ved basale organer på en IFT-afhængig måde. Jouberin letter nukleær translokation af β-catenin; dets basalkroppe-sekestrering hindrer nukleær translokation af β-catenin og dæmper de kanoniske Wnt-signalreaktioner (Lancaster et al., 2011b). Tilsammen tyder disse fund på, at cilier ikke er globalt nødvendige for Wnt-signalering under embryogenese, men påvirker Wnt-signaleringens resultater i udvalgte sammenhænge.

Det er blevet antaget, at cilier giver en specialiseret sensorisk struktur, inden for hvilken flere typer signaler koordineres. En alternativ model er, at cilier udviser vejspecificitet (som cytonemer, der diskuteres nedenfor) og derved begrænser cellulær reaktionsevne og/eller rumligt adskiller signaleringsresponser. Ciliær signaleringens vejspecificitet kunne formidles ved differentiel målretning af signalproteiner til cilier og/eller udnyttelse af forskellige undergrupper af IFT-proteiner eller lastspecifikke adaptorer til axonemtransport (Boehlke et al., 2010; Mukhopadhyay et al., 2010; Christopher et al., 2012).