Vliv cykloheximidu na interpretaci experimentů s ribozomovým profilováním u Schizosaccharomyces pombe

Experimentální design a reprodukovatelnost

Pro zkoumání vlivu CHX na experimenty s ribozomovým profilováním jsme tuto techniku aplikovali na S. pombe rostoucí exponenciálně (bez stresu) a po 1 hodině dusíkového hladovění (nutriční stres). Každá kultura byla rozdělena na dvě části a jedna z nich byla před odběrem inkubována s CHX o koncentraci 100 µg/ml po dobu 5 minut (to je „standardní“ koncentrace používaná ve většině publikovaných experimentů). Buňky byly odebrány filtrací a okamžitě bleskově zmraženy v kapalném dusíku, aby se zabránilo další translaci. Všimněte si, že CHX byl přítomen v lyzačních pufrech pro všechny vzorky. Proto se všechny níže uvedené odkazy na ošetření CHX vztahují pouze na jeho přidání do kultivačního média. Pro každý ze čtyř experimentů jsme provedli dvě nezávislá biologická opakování (plus/minus dusík, plus/minus CHX). Pro každý vzorek jsme připravili a izolovali fragmenty chráněné ribozomy (RPF nebo ribozomové stopy), jak je popsáno v Metodách, a analyzovali je pomocí vysoce výkonného sekvenování Illumina. Z každého z osmi vzorků jsme také sekvenovali RNA zbavenou rRNA (RNA-seq). Pro vyhodnocení reprodukovatelnosti techniky jsme pro každý experiment kvantifikovali počet RPF a RNA-seq čtení, která se mapovala na každou anotovanou kódující sekvenci genomu S. pombe. Data byla vysoce reprodukovatelná, s průměrnou korelací mezi nezávislými biologickými replikáty 0,97 (tabulka 1). Níže se zaměříme na to, jak CHX ovlivňuje experimenty s profilováním ribozomů. Kompletnější analýza biologie reakce buněk S. pombe na hladovění dusíkem bude publikována jinde.

Pro zkoumání účinků CHX jsme zkoumali čtyři aspekty translace: 1] celkovou hustotu ribozomů pro kódující sekvence jednotlivých genů, 2] přítomnost ribozomů na 5′ vůdčích sekvencích, 3] odchylky v umístění ribozomů napříč kódujícími sekvencemi a 4] distribuci ribozomů podél jednotlivých kodonů.

Hustota ribozomů

Kvantifikovali jsme počet čtení RPF na kódujících sekvencích pro každý anotovaný gen v buňkách ošetřených CHX nebo ošetřených mockem. Za podmínek hladovění dusíkem byla korelace mezi oběma ošetřeními velmi vysoká (průměrné R = 0,96), ale ~4,5 % všech genů vykazovalo konzistentně vyšší ribozomální hustotu v přítomnosti CHX (2krát nebo více v obou replikátech, obr. 1a a doplňkový obr. S1). Podobné změny nebyly pozorovány u vzorků mRNA (průměrné R = 0,98), což naznačuje, že tento účinek byl způsoben změnami v translaci, a nikoli v transkriptomu (obr. 1a, doplňkový obr. S1).

Vliv CHX na celkovou hustotu ribozomů na kódující sekvence. (a) Grafy rozptylu porovnávající hladiny mRNA (nahoře) a hustoty ribozomů (dole) mezi neošetřenými a CHX ošetřenými buňkami. Údaje jsou uvedeny pro buňky rostoucí v přítomnosti zdroje dusíku (+N) nebo hladovějící po dusíku (-N). Geny kódující ribozomální proteiny jsou znázorněny zeleně. Všechna data byla normalizována na RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads). (b) Vlevo: krabicové grafy porovnávající hustotu ribozomálních proteinů mezi neošetřenými buňkami a buňkami ošetřenými CHX pro skupiny genů s uvedenými průměrnými délkami kódujících sekvencí. Vpravo: podobná data pro uvedené délky 5′ vůdčích sekvencí. Červené rámečky zobrazují chování mRNA kódujících ribozomální proteiny. (c) Srovnání změn hladin mRNA a hustoty ribozomů mezi buňkami hladovějícími po dusíku (-N) a buňkami bez stresu (+N). Údaje jsou uvedeny pro buňky ošetřené CHX (vlevo) a pro neošetřené buňky (vlevo). Geny kódující ribozomální proteiny jsou znázorněny zeleně.

Překvapivě tato skupina zahrnovala většinu genů kódujících ribozomální proteiny (RP, obr. 1a a doplňkový obr. S1, zelené tečky). Abychom vyloučili možnost, že CHX způsobuje jemné změny v hladinách mRNA, porovnali jsme změny vyvolané hladověním dusíkem v přítomnosti nebo nepřítomnosti CHX (doplňkový obr. S2). Medián násobné změny hladin mRNA pro RP geny byl 0,25 u vzorků ošetřených CHX a 0,24 u neošetřených buněk, což potvrzuje, že změny v hustotě ribozomálních genů RP při hladovění dusíkem jsou způsobeny změnami translace.

RP geny jsou obecně poměrně krátké, s mediánem délky 447 nukleotidů ve srovnání s 1 131 u všech genů. Jednoduchým vysvětlením tohoto obohacení by proto mohlo být, že CHX zabraňuje „odtékání“ ribozomů z krátkých genů během sběru buněk, čímž zvyšuje jejich zdánlivou hustotu ribozomů. Ačkoli však byla zjištěna malá tendence, že hustota ribozomů v kratších genech je vyšší v přítomnosti CHX, jednalo se o malý účinek, který nemohl vysvětlit chování genů ribozomálních proteinů (obr. 1b). MRNA kódované těmito geny mají také tendenci mít kratší 5′ vedoucí sekvence (medián 68,5 nukleotidů oproti 173 u všech genů), ale mezi délkou 5′ vedoucí sekvence a vyšší hustotou ribozomů v CHX nebyla žádná celková korelace (obr. 1c). Pouze 9 genů s jaderným kódem (~0,2 %) vykazovalo snížení hustoty ribozomů v CHX (obr. 1a a doplňkový obr. S1) a neměly žádné společné rysy.

Naopak v podmínkách bez stresu mělo léčivo velmi slabý vliv na hustotu ribozomů (průměrné R = 0,98), přičemž méně než 1 % genů vykazovalo rozdíly v hustotě vyšší než 2násobné (23 genů vyšší v CHX a 9 nižší, obr. 1a a doplňkový obr. S1). Zajímavé je, že malá skupina genů, která vykazovala nižší hustotu v buňkách ošetřených CHX, byla také obohacena o geny ribozomálních proteinů (12/23 mRNA).

Dospěli jsme k závěru, že mRNA kódující RP jsou obzvláště citlivé na přítomnost CHX a že tento jev nelze vysvětlit pouze jejich krátkými 5′ vedoucími a kódujícími sekvencemi. Kromě toho je tento účinek silný pouze při nutričním stresu. Tyto výsledky však neodhalují, který ze dvou vzorků (ošetřený nebo neošetřený CHX) lépe odráží situaci in vivo. Například geny RP jsou bohaté na optimální kodony, což znamená, že k elongaci translace dochází vysokou rychlostí. Tato vlastnost spolu s jejich krátkou délkou je může činit citlivějšími na stékání ribozomů během sběru. V tomto případě by CHX stabilizoval jejich distribuci in vivo. Alternativně je také možné, že CHX má přímý vliv na translaci těchto mRNA, což vede k nefyziologické hustotě ribozomů.

Poté jsme zkoumali, zda změny v hustotě ribozomů způsobené CHX ovlivní interpretaci translační/transkripční odpovědi na hladovění dusíkem. Kvantifikovali jsme translační účinnost (TE) normalizací počtu RPF podle hladin mRNA a vypočítali jsme logaritmickou změnu TE a hladin transkriptů mezi buňkami pěstovanými v médiu obsahujícím dusík a buňkami hladovějícími po dusíku (obr. 1c a doplňkový obr. S1B). V přítomnosti CHX vedlo hladovění dusíkem k jasnému snížení hladin mRNA kódujících RP, ale neovlivnilo jejich TE. Naopak v experimentech prováděných v nepřítomnosti CHX se tyto mRNA jevily jako downregulované jak na úrovni mRNA, tak na úrovni TE. Předinkubace s CHX v médiu tedy může ovlivnit TE specifických skupin genů. Množství mRNA kódujících RP je velmi úzce koregulováno22,23,24; naše výsledky ukazují, že tyto mRNA vykazují koordinované chování také na úrovni translační účinnosti. Důvod extrémní citlivosti těchto mRNA na CHX je třeba ještě objasnit.

U většiny genů však nemá léčba CHX žádný vliv na hustotu ribozomů bez ohledu na podmínky růstu. Podobné výsledky byly zaznamenány u savčích buněk pěstovaných v kultuře, kde CHX nemá žádný významný vliv na hustotu ribozomů specifických pro daný gen. Toto však bylo zkoumáno pouze u nestresovaných buněk13.

Změny ve využití upstream Open Reading Frames

Buňky S. cerevisiae vykazují akumulaci ribozomových stop v 5′ vůdčích sekvencích, která se zvyšuje za podmínek stresu, což naznačuje vyšší využití uORFs1, 9, 10. Tyto závěry však byly zpochybňovány a připisovány použití CHX v buněčné kultuře8.

Pro řešení této otázky jsme u S. pombe porovnávali akumulaci čtení v 5′ vůdčích a kódujících sekvencích (obr. 2a) před a po hladovění dusíkem. Tuto hodnotu jsme nejprve kvantifikovali měřením poměru mezi celkovým počtem otisků ribozomů v 5′ vůdčích a v kódujících sekvencích. Hladovění dusíkem u buněk ošetřených CHX způsobilo průměrný 5,5násobný nárůst, zatímco u neošetřených buněk byl průměrný nárůst 2,1násobný (obě obohacení byla konzistentní napříč biologickými replikáty, obr. 2b). Vzhledem k tomu, že celkovým poměrům by mohly dominovat změny v malém počtu vysoce hojných genů, kvantifikovali jsme také poměry mezi stopami v 5′ lídrech a kódujících sekvencích pro všechny jednotlivé transkripty, které prošly prahem exprese (podrobnosti viz Metody a výsledky na obr. 2c a doplňkovém obr. S3). V souladu s předchozím výsledkem došlo u většiny genů k jasnému nárůstu otisků ribozomů v 5′ vůdčích sekvencích při hladovění dusíkem (obr. 2c a doplňkový obr. S3; všimněte si, že nárůst v druhé replice je menší, ale stále významný), přičemž průměrné poměry nárůstu byly 3,8 a 1,9 pro plus/minus CHX (obr. 2d, všimněte si podobného chování obou replik). Na rozdíl od výsledků u S. cerevisiae se tedy hustota 5′ vůdčích ribozomů zvýšila v důsledku nutričního stresu v každém experimentu, ačkoli tento účinek byl podstatně vyšší u buněk ošetřených CHX. Možnou výhradou je samozřejmě to, že studie S. cerevisiae použila jiný typ stresu8. Nicméně vzhledem k tomu, že určitá akumulace byla pozorována jak při léčbě léčivem, tak bez ní, můžeme dojít k závěru, že u S. pombe vede hladovění dusíkem k vyšší hustotě ribozomů na 5′ vůdčích sekvencích. Toto zvýšení hustoty může být způsobeno translací uORF, i když nemůžeme vyloučit, že odráží zvýšený šum ve stresovaných vzorcích. Doplňkový obr. S4 uvádí dva příklady uORF indukovaných v reakci na hladovění dusíkem. Biologický význam a mechanistický základ tohoto jevu (stejně jako to, zda je obecný pro všechny stresové podmínky) zatím neznáme.

Vliv CHX na hustotu ribozomů na 5′ vedoucí sekvence. (a) Experimentální design: RPF v kódujících sekvencích (CDS) a 5′ vůdčích sekvencích jsou kvantifikovány za různých experimentálních podmínek. (b) Poměr celkových čtení mapujících 5′ vedoucí sekvence k celkovým čtením mapujícím kódující sekvence (CDS) pro nestresované buňky (+N) a buňky hladovějící po dusíku (-N) a pro buňky ošetřené nebo neošetřené CHX (±CHX). Čísla označují násobný rozdíl mezi dvojicemi vzorků -N a +N. Údaje jsou uvedeny pro dvě biologická opakování. (c) Graf rozptylu porovnávající poměr čtení mapujících 5′ vedoucí sekvence a čtení mapujících kódující sekvence (CDS) pro jednotlivé geny; každý graf porovnává buňky bez stresu (+N) a buňky hladovějící po dusíku (-N). Údaje jsou uvedeny pro buňky ošetřené CHX (vlevo) nebo neošetřené (vpravo). Červené čáry odpovídají poměru 1. (d) Průměrné hodnoty pro poměry uvedené v (c). Čísla označují násobný rozdíl mezi dvojicemi vzorků -N a +N. Údaje jsou zobrazeny pro dvě biologická opakování.

Rozdělení ribozomů podél kódujících sekvencí

S. Buňky cerevisiae vykazují asymetrickou distribuci ribozomů napříč kódujícími sekvencemi s širokým vrcholem vyššího obsazení ribozomů v počátečních ~300-400 nukleotidech kódující sekvence1, 9, 14, 20, které je silně zesíleno různými stresy1, 8, 12.

Tento jev jsme zkoumali u S. pombe dvěma způsoby: za prvé, výpočtem poměru mezi stopami v nukleotidech 10 až 400 a 401 až 800 (obr. 3a-c, prvních 9 nukleotidů nebylo bráno v úvahu, aby se zabránilo zkreslení vzniklému nahromaděním ribozomů na iniciačních AUG); za druhé, zkoumáním chování metagenu reprezentujícího hustotu ribozomů podél kódujících sekvencí v celém genomu (obr. 3d a doplňkový obr. S5).

Vliv CHX na rozložení ribozomů podél kódujících sekvencí. (a) Experimentální design: RPF na nukleotidech 10 až 400 a na nukleotidech 401-800 jsou kvantifikovány za různých experimentálních podmínek a je vypočten poměr mezi oběma počty. (b) Průměrné poměry vypočtené podle popisu v části A pro všechny kódující sekvence, v přítomnosti a nepřítomnosti zdroje dusíku (±N) a v přítomnosti a nepřítomnosti ošetření CHX (±CHX). Čísla udávají násobný rozdíl mezi párovými vzorky -N a +N. Údaje jsou uvedeny pro dvě biologická opakování. (c) Graf rozptylu porovnávající poměry získané podle definice v části A pro jednotlivé geny; každý graf porovnává buňky bez stresu (+N) a buňky s nedostatkem dusíku (-N). Údaje jsou uvedeny pro buňky ošetřené CHX (vlevo) nebo neošetřené (vpravo). Červené čáry odpovídají poměru 1. (d) Metageny zobrazující průměrné rozložení RPF podél kódujících sekvencí ve čtyřech experimentálních podmínkách. Pro vyhlazení vynesených čar bylo použito běžící okno o délce 60 nukleotidů.

Buňky S. pombe vykazovaly v nepřítomnosti stresu malá ramena jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti léčiva, podobně jako v případě S. cerevisiae bez CHX1, 14, 20 (obr. 3d a doplňkový obr. S5). Při nutričním stresu se S. pombe chovala podobně jako S. cerevisiae12. V přítomnosti CHX došlo u většiny genů ke zřetelné akumulaci čtení v 5′ části kódující sekvence (obr. 3c a doplňkový obr. S5, levý graf), což se projevilo také ~2,0násobným zvýšením průměrné hustoty v prvních 400 nukleotidech mRNA (obr. 3b). Naopak v nepřítomnosti léčiva byl tento nárůst zanedbatelný, a to jak při zkoumání jednotlivých genů (obr. 3c (pravý graf) a doplňkový obr. S5), tak při měření průměrných poměrů (obr. 3b, všimněte si, že obě replikace se chovaly konzistentně). Závislost akumulace čtení na CHX při hladovění dusíkem navíc potvrdila i metagénová data (obr. 3d a doplňkový obr. S5). Nakonec jsme zjistili, že tento účinek je specifický pro RPF, a to vykreslením metagenu na základě dat mRNA-seq (Doplňkový obr. S5).

Přemýšleli jsme také o tom, zda se tato pozorování vztahují i na menší geny. S tímto cílem jsme vytvořili metageny pro RP geny a pro malé geny (méně než 200 kodonů) s výjimkou RP genů. V obou případech způsobil CHX zřetelný nárůst na 5′ straně kódujících sekvencí (zejména u genů RP), který byl závislý jak na hladovění dusíkem, tak na ošetření CHX (Doplňkový obr. S5)

Kromě toho došlo k nahromadění ribozomů na iniciačních kodonech (Doplňkový obr. S6). Tento rys byl přítomen již v neošetřených buňkách, ačkoli byl zvýšen při inkubaci s CHX (jak v kontrolních buňkách, tak v buňkách zbavených dusíku). Toto obohacení bylo o něco vyšší v buňkách hladověných dusíkem, a to nezávisle na ošetření CHX (Doplňkový obr. S6).

Je tedy zřejmá akumulace ribozomů v iniciální části kódujících sekvencí, která je konzervovaná u S. pombe a S. cerevisiae a kterou lze pozorovat jak s předúpravou CHX, tak bez ní. Naproti tomu stresem indukované zesílení není u obou kvasinek konzistentně pozorováno v nepřítomnosti CHX, a proto není dostatek důkazů, které by naznačovaly, že k němu dochází in vivo. V budoucnu může k rozlišení mezi těmito dvěma interpretacemi přispět použití strategií zesíťování in vivo25.

Zaměstnanost kodonů

Normalizovaná ribozomální obsazenost jednotlivých kodonů v zásadě souvisí s časem, který ribozom stráví u každého kodonu, a lze ji tedy použít k odhadu průměrné rychlosti translace specifické pro kodon. První experimenty zkoumající tento jev však přinesly rozporuplné výsledky17,18,19,20. Elegantní studie Hussmanna a spol., která zahrnovala nové experimenty, metaanalýzu četných experimentů profilování ribozomů ze S. cerevisiae a matematické modelování9 , zjistila, že tyto rozpory lze vysvětlit účinkem CHX na určení obsazenosti kodonů specifickými ribozomy. Pokusy od různých skupin prováděné v přítomnosti CHX měly navzájem podobné obsazení kodonů ribozomů, stejně jako pokusy prováděné bez léčiva. Korelace mezi pokusy s CHX a bez CHX však byly velmi nízké. Experimenty s CHX navíc vedly k tomu, že míra translace specifická pro kodon vykazovala negativní korelace s množstvím kognitivní tRNA, zatímco experimenty, které nezahrnovaly ošetření CHX, vykazovaly očekávané pozitivní korelace9, 20 . Hussmann a spol. navrhli, že ribosomy nezastaví translaci okamžitě v přítomnosti CHX v médiu. Místo toho translace pokračuje pro několik kodonů s kodonově specifickou rychlostí translace9 , což způsobuje arteficiální obsazení kodonů.

Pro zkoumání tohoto jevu jsme analyzovali obsazení kodonů specifických pro ribosomy na místech A, jak je popsáno v metodách. Stručně řečeno, každé čtení, které bylo mapováno na kódující sekvenci, jsme přiřadili k místu A ribosomu (které odpovídá nukleotidu 16 fragmentu chráněného ribosomem). Poté jsme pro každý kodon napříč genomem vypočítali normalizovanou obsazenost (vydělením frekvence, s níž se ribosom nachází na každém kodonu, četností výskytu kodonu v mRNA). Při absenci zkreslení by tato hodnota měla odrážet průměrný čas, který ribozom stráví na každém kodonu.

Nejprve jsme porovnali vliv CHX na obsazenost ribozomů specifických pro kodon (obr. 4, doplňkové obr. S7 a S8). Překvapivě byla korelace mezi oběma experimenty velmi vysoká, s průměrnými hodnotami 0,82 pro dusíkové hladovění (obr. 4a a doplňkový obr. S7) a 0,86 pro nestresované buňky (obr. 4b a doplňkový obr. S7). Při podobných srovnáních u S. cerevisiae byla většina korelací záporná9. Například vzácné kodony jako CCG (prolin) a CGG (arginin) měly v nepřítomnosti CHX jednu z nejvyšších obsazeností, ale ve vzorcích ošetřených CHX toto obohacení ztratily9. Naproti tomu v souboru dat S. pombe byly CCG i CGG obohaceny bez ohledu na přítomnost CHX (i když méně výrazně v neošetřených buňkách, obr. 4c a doplňkový obr. S7). Nutriční stres měl navíc velmi malý vliv na obsazenost ribozomů specifických pro kodon, a to jak v přítomnosti (obr. 4c a doplňkový obr. S7, průměrné R = 0,96), tak v nepřítomnosti CHX (obr. 4c a doplňkový obr. S7). 4d a doplňkový obr. 7, průměrné R = 0,98).

Vliv CHX na relativní obsazenost kodonů. Grafy rozptylu zobrazující relativní obsazenost kodonů získané podle popisu v Metodách. Každá tečka odpovídá jednomu kodonu. Ukončovací kodony nejsou zobrazeny. Pozice vzácných kodonů CCG a CGG jsou vyznačeny. Tečkované čáry odpovídají 1,5násobným rozdílům. Pearsonovy korelace mezi soubory dat jsou vyznačeny. (a) Srovnání účinků ošetření CHX v buňkách zbavených dusíku. (b) Stejně jako v bodě (a) pro buňky pěstované se zdrojem dusíku. (c) Srovnání účinků hladovění dusíkem v přítomnosti CHX. (d) Jako v bodě (c), v nepřítomnosti CHX.

Nakonec jsme hodnotili korelaci mezi množstvím tRNA a obsazením specifických kodonů. K tomu jsme použili index adaptace tRNA (tAI), což je míra využití tRNA pro každý kodon částečně založená na počtu kopií tRNA (vyšší počet předpovídá efektivnější translaci)26 . Experimenty S. cerevisiae prováděné v přítomnosti CHX v kultuře ukazují negativní korelaci mezi inverzní hodnotou tAI (1/tAI) a obsazením specifických kodonů, což předpovídá, že kodony s nízkým tAI (a tedy s nízkým množstvím tRNA) budou překládány rychleji. Naproti tomu experimenty s buňkami, které nebyly předem ošetřeny CHX, ukázaly očekávanou pozitivní korelaci mezi 1/tAI (ačkoli skutečné hodnoty se mezi experimenty velmi lišily)9 . U S. pombe jsme zjistili, že v každém z osmi experimentů profilování ribozomů vykazovaly obsazenosti specifických kodonů pozitivní korelaci s 1/tAI s průměrnou hodnotou 0,39 (tabulka 2).

Naše výsledky ukazují, že u S. pombe má CHX relativně malý vliv na pozici ribozomů na specifických kodonech. To lze vysvětlit tím, že buňky S. pombe jsou obzvláště citlivé na CHX, takže CHX zablokuje pohyb ribozomů rychleji a úplněji než u S. cerevisiae. Tato vlastnost by zabránila pohybu ribozomů změněnou rychlostí (postulovanému u S. cerevisiae) a vedla by k situaci, kdy by buňky S. pombe ošetřené CHX a neošetřené buňky měly v ustáleném stavu podobné rozložení ribozomů. Nicméně skutečnost, že vzácné kodony jsou v přítomnosti CHX méně obohaceny, naznačuje, že CHX by měl být vynechán v experimentech zaměřených na stanovení distribuce ribozomů specifických pro kodony

.