Mutace v genu FLNB způsobují bumerangovou dysplazii | Journal of Medical Genetics

Bumerangová dysplazie (OMIM #112310) je letální skeletální dysplazie charakterizovaná dezorganizovanou osifikací skeletu.1 Mezi charakteristické radiologické nálezy patří nepravidelná osifikace kostí končetin a obratlů, nedostatečný vývoj acetabula a hypoplastické stehenní kosti ve tvaru bumerangu, od čehož je odvozen název poruchy.1 V literatuře bylo dosud popsáno nejméně osm případů.1-8 Podobná letální dysplazie skeletu, Piepkornova dysplazie,9 byla navržena jako alelická k bumerangové dysplazii.2,7 Histologie chrupavky prokazuje jak dezorganizovaný anlagen chrupavky vyvíjející se dlouhé kosti, tak časté vícejaderné chondrocyty v rezervní zóně růstové ploténky.1 Byly popsány i další vývojové abnormality mimo skelet, včetně omfalokély a encefalokély.

Podobnosti v radiografických a histologických nálezech bumerangové dysplazie a atelosteogeneze I (AOI; OMIM #108720) a III (AOIII; OMIM #108721) naznačují alelismus těchto poruch.2,10 U všech tří jednotek zahrnují radiografické nálezy kromě kraniofaciálních abnormalit také nedostatečnou a nepravidelnou osifikaci kostí a obratlových těl s hypoplazií distálního humeru a kloubními dislokacemi.11 U AOI i bumerangové dysplazie byly navíc pozorovány vícejaderné chondrocyty. Bumerangová dysplazie se od AO odlišuje na základě závažnějšího defektu mineralizace s úplnou absencí osifikace některých končetinových elementů a segmentů obratlů.3 Převaha mužů mezi popsanými případy bumerangové dysplazie7 a určitá fenotypová podobnost s poruchami spektra otopalatodigitálního syndromu způsobenými mutacemi v genu FLNA12,13 naznačují některým autorům etiologii spojenou s X.7

Nedávno jsme popsali souvislost mutací v genu kódujícím 280 kDa cytoskeletální protein filamin B s několika poruchami charakterizovanými defekty skeletu a kloubními dislokacemi.14 Filamin B je modulární protein. Na aminoterminálu se nachází aktinová vazebná doména složená ze dvou kalponinových homologních domén (CH1 a CH2), za níž následuje tyčinkovitá doména složená z 24 strukturně homologních opakování a zakončená karboxyterminální dimerizační doménou.15 Aktinová vazebná doména u filaminu B je podobná doménám, které se nacházejí u jiných cytoskeletálních proteinů, jako je β-spektrin, dystrofin a α-aktinin-4.

Čtyři odlišné stavy byly připsány mutacím ve FLNB: AOI, AOIII, recesivně dědičný spondylkarpotarzální syndrom (OMIM #272460) a dominantní forma Larsenova syndromu (OMIM #150250). Bylo zjištěno, že jedinci s AOI, AOIII a dominantně dědičným Larsenovým syndromem jsou heterozygoti pro missense mutace ve FLNB.14 Většina mutací vedoucích k AOI nebo AOIII vede k substitucím lokalizovaným v doméně CH2 aktinové vazebné domény filaminu B. Jedinou výjimkou je mutace 2251G→C umístěná v exonu 15, která podle předpokladů vede k substituci G751R v repetici 6, zjištěná u jedince s AOIII.14 Během prací, které identifikovaly skupinu poruch vzniklých v důsledku mutací ve FLNB, byl jeden jedinec s bumerangovou dysplazií hodnocen na přítomnost mutací přímým sekvenováním, ale žádná mutace nebyla zjištěna.14

Vzhledem k radiografickým, fenotypovým a histologickým důkazům, které naznačují, že bumerangová dysplazie souvisí s poruchami způsobenými mutacemi v genech kódujících filaminy, jsme vyšetřili dva jedince s bumerangovou dysplazií na přítomnost mutací v genech FLNA a FLNB pomocí denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografie (DHPLC) jako screeningové techniky.

Jedinec 1 byl případ, který byl dříve vyšetřen přímým sekvenováním. Tento plod mužského pohlaví byl prvním dítětem nekonsangvinních, zdravých rodičů. Ultrazvukové vyšetření ve druhém trimestru odhalilo hypoplazii hrudníku a výrazné zkrácení všech končetin s nepravidelnou osifikací více kosterních elementů. Plod byl porozen ve 22. týdnu těhotenství. Posmrtná analýza prokázala výraznou hypoplazii hrudníku, krátké končetiny a charakteristický obličejový dysmorfismus spojený s bumerangovou dysplazií. Nebyla přítomna encefalokéla ani omfalokéla. Rentgenologické nálezy byly typické pro bumerangovou dysplazii (obr. 1).

U jedince 2 se jednalo o plod v 17. týdnu těhotenství, o kterém již dříve podrobně referovali Wessels et al.8 Tento plod vykazoval těžkou mikromélii s chybějícími dvěma ze tří dlouhých trubicových kostí všech čtyř končetin. Při rentgenologickém vyšetření měly zbývající vřetenní kosti tvar bumerangu, holenní kosti byly segmentové, páteř byla špatně osifikovaná a hrudník byl hypoplastický. Histologicky byla matrix chrupavky hypocelulární s přítomností vícejaderných obrovských chondrocytů.

Kódující oblasti a intron-exonové sestřihové spoje FLNA i FLNB byly amplifikovány z genomové DNA získané z obou případů pomocí intronických primerů popsaných dříve13,14 (reakční podmínky a sekvence primerů jsou k dispozici na vyžádání). Pro analýzu FLNA byly produkty amplikonů vizualizovány elektroforézou v agarózovém gelu a poté smíchány se stejným množstvím produktů PCR amplifikovaných z nepříbuzné kontroly zdravého muže před vytvořením heteroduplexu. Vzorky byly podrobeny DHPLC na systému pro analýzu fragmentů DNA WAVE (Transgenomic Inc.) podle pokynů výrobce. Amplikony vykazující anomální formy stop byly reamplifikovány a cyklicky sekvenovány na sekvenátoru ABI 3100. Identifikované mutace byly potvrzeny štěpením amplifikované DNA restrikčními enzymy a rodičovství bylo potvrzeno jako deklarované pro případ 1 segregací šesti nespojitých mikrosatelitních markerů. U případu 2 nebyly rodičovské vzorky k dispozici. Tato studie byla schválena etickou komisí Otago.

Vyšetření FLNB (exony 1-46) odhalilo mutace u obou subjektů. V případě 1 se ukázalo, že jedinec je heterozygotem pro mutaci 512T→G, která podle předpokladu vede k záměně L171R. Tato mutace vytváří místo pro restrikční enzym HpaII, což umožnilo prokázat, že v této rodině vznikla de novo (obr. 2), a poskytnout tak genetický důkaz patogenity. Zpětně se ukazuje, že tato mutace byla přítomna již v původní analýze, ale byla přehlédnuta. Druhá mutace, 703T→C, byla nalezena v exonu 4 v případě 2 a předpovídá substituci S235P (obr. 2). Rodičovské vzorky nebyly k dispozici, ale tato mutace nebyla přítomna ve 100 kontrolních chromozomech. Obě mutace předpovídají změnu zbytků v oblasti CH2 aktinové vazebné domény filaminu B. Tyto zbytky jsou mezi filaminy obratlovců vysoce evolučně konzervované (obr. 3). Mutace naznačují, že tyto aminokyseliny hrají kritickou roli ve funkci aktinové vazebné domény. U mutace 703T→C byla stejná záměna pozorována na analogickém zbytku v genu ACTN4, který kóduje cytoskeletální adaptorový protein α-aktinin-4 (obr. 3), u pacienta s fokální a segmentální glomerulosklerózou.16

Substituce související s onemocněním v rámci aktinové vazebné domény filaminu B vedou k různým fenotypům. Již dříve jsme zaznamenali substituce vedoucí k AOI (n = 3), AOIII (n = 1) a Larsenovu syndromu (n = 2).14 Všechny tyto fenotypy jsou spojeny s defekty ve skeletogenezi a tvorbě kloubů. Identifikace mutací vedoucích k substitucím v aktin vázající doméně filaminu B u dvou pacientů s bumerangovou dysplazií potvrzuje, že toto onemocnění je alelické k těmto poruchám, což odráží předchozí klinické podezření na příbuznost.2,3

Podíl mutací, které způsobují otopalatodigitální spektrum skeletálních poruch, leží v analogické oblasti CH2 u FLNA. Tyto mutace rovněž vedou k širokému spektru fenotypové závažnosti.13 Mezi umístěním těchto mutací a závažností výsledných defektů osifikace skeletu neexistuje jednoduchá korelace. Zatímco otopalatodigitální syndrom typu 1 se projevuje mírněji než otopalatodigitální syndrom typu 2, tyto stavy mohou být důsledkem záměn v reziduích v těsné blízkosti nebo dokonce ve stejném reziduu.13,17 Pozorování, že mutace v doméně vázající aktin FLNB mohou také vést k širokému spektru závažnosti, tento vzorec rekapituluje. Předpokládaná mutace nalezená u jedince 1, L171R, se nachází v těsné blízkosti místa záměny (A173V), která je příčinou AOI.14 Podobně se zde uváděná záměna S235P nachází ve stejném proteinovém záhybu jako E227K, záměna spojená s méně závažným, neletálním fenotypem, Larsenovým syndromem.14 Navzdory zprávám o substitucích souvisejících s onemocněním ve zbytcích uvnitř CH2 domény vázající aktin dystrofinu, α-aktininu-4,17 filaminu A,13 a filaminu B,14 nebyla funkční role tohoto proteinového záhybu definitivně objasněna. Vzhledem k tomu, že domény CH2 nemají izolovaně žádné vrozené vazebné vlastnosti pro aktin, předpokládá se, že úloha CH2 při vazbě aktinu je přinejlepším nepřímá.18

Filaminy působí především tak, že stabilizují aktin v buňce, a to buď jako paralelní svazky, nebo ortogonální gelové sítě.19,20 Pro filamin A bylo identifikováno více vazebných partnerů, přičemž naprostá většina se asociuje prostřednictvím filaminových repetic 16-24 (přehled v Stossel et al.21 ). Bylo prokázáno, že s filaminem B se asociuje pět vazebných partnerů: aktin, FBLP-1,22 presenilin (PS1 a PS2)23 a GPIβα.24 Zbývá zjistit, zda mutace v aktinových vazebných doménách filaminů A a B uplatňují svůj patogenní účinek především narušením vazby na aktin, nebo prostřednictvím funkční závislosti mezi asociací s aktinem a vazebnými interakcemi s jinými proteiny.

Multinukleární obrovské buňky se nacházejí mezi chondrocyty v růstové ploténce jedinců s bumerangovou dysplazií. Tyto projevy by mohly být důsledkem defektního štěpení buněk během proliferace chondrocytů v epifyzární růstové ploténce. Již dříve jsme prokázali rozsáhlou expresi FLNB v rámci růstové ploténky a především ve štěpné rýze dělících se chondrocytů14. Proces změněného štěpení buněk vedoucí k defektnímu vzorování skeletu i mineralizaci u skupiny poruch bumerangové dysplazie/atelosteogeneze je třeba ještě objasnit.

Identifikace mutací způsobujících bumerangovou dysplazii ve FLNB potvrzuje, že bumerangová dysplazie je součástí spektra chondrodysplazií včetně AOI a III a neletálního Larsenova syndromu. Fenotypové překrývání bumerangové dysplazie a AO, jak bylo uvedeno zde i dříve, a kolokalizace mutací, které jsou základem těchto onemocnění, v exonech kódujících aktinovou vazebnou doménu FLNB svědčí o klinicko-patologickém spektru těchto poruch. Toto další rozšíření fenotypového spektra spojeného s mutacemi v genu FLNB zdůrazňuje význam funkčního aktinového cytoskeletu pro mnoho normálních morfogenetických procesů, včetně skeletogeneze.

.