Auswirkungen von Cycloheximid auf die Interpretation von Ribosomen-Profiling-Experimenten in Schizosaccharomyces pombe

Experimentelles Design und Reproduzierbarkeit

Um die Auswirkungen von CHX auf Ribosomen-Profiling-Experimente zu untersuchen, haben wir diese Technik auf S. pombe-Zellen angewandt, die exponentiell (nicht gestresst) und nach 1 Stunde Stickstoffmangel (Ernährungsstress) wuchsen. Jede Kultur wurde in zwei geteilt, und eine davon wurde vor der Entnahme 5 Minuten lang mit CHX in einer Konzentration von 100 µg/ml inkubiert (dies ist die „Standardkonzentration“, die in den meisten veröffentlichten Experimenten verwendet wird). Die Zellen wurden durch Filtration gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, um eine weitere Translation zu verhindern. Beachten Sie, dass CHX in allen Proben in den Lysepuffern enthalten war. Daher beziehen sich alle Hinweise auf die CHX-Behandlung im Folgenden nur auf die Zugabe von CHX zum Kulturmedium. Wir führten zwei unabhängige biologische Wiederholungen für jedes der vier Experimente durch (plus/minus Stickstoff, plus/minus CHX). Für jede Probe wurden ribosomengeschützte Fragmente (RPFs oder Ribosomen-Fußabdrücke), wie in Methoden beschrieben, hergestellt und isoliert und mittels Illumina-Hochdurchsatzsequenzierung analysiert. Wir sequenzierten auch rRNA-abgereicherte RNA aus jeder der acht Proben (RNA-seq). Um die Reproduzierbarkeit der Technik zu bewerten, quantifizierten wir für jedes Experiment die Anzahl der RPF- und RNA-seq-Reads, die jeder annotierten kodierenden Sequenz des S. pombe-Genoms zugeordnet wurden. Die Daten waren sehr gut reproduzierbar, mit durchschnittlichen Korrelationen zwischen unabhängigen biologischen Wiederholungen von 0,97 (Tabelle 1). Im Folgenden konzentrieren wir uns darauf, wie CHX die Experimente zur Erstellung von Ribosomenprofilen beeinflusst. Eine umfassendere Analyse der Biologie der Reaktion von S. pombe-Zellen auf Stickstoffmangel wird an anderer Stelle veröffentlicht.

Um die Auswirkungen von CHX zu untersuchen, haben wir vier Aspekte der Translation untersucht: 1] Gesamt-Ribosomendichte für kodierende Sequenzen einzelner Gene, 2] Vorhandensein von Ribosomen auf 5′-Leader-Sequenzen, 3] Verzerrungen in der Ribosomenlage über kodierende Sequenzen und 4] Verteilung von Ribosomen entlang einzelner Codons.

Ribosomendichte

Wir quantifizierten die Anzahl der RPF-Reads auf kodierenden Sequenzen für jedes annotierte Gen in Zellen, die mit CHX oder mit Mock behandelt wurden. Unter Stickstoff-Starvationsbedingungen war die Korrelation zwischen beiden Behandlungen sehr hoch (durchschnittliches R = 0,96), aber ~4,5 % aller Gene zeigten in Gegenwart von CHX eine durchgängig höhere ribosomale Dichte (2-fach oder höher in beiden Wiederholungen, Abb. 1a und ergänzende Abb. S1). Ähnliche Veränderungen wurden in mRNA-Proben nicht beobachtet (durchschnittliches R = 0,98), was darauf hindeutet, dass dieser Effekt auf Veränderungen in der Translation und nicht im Transkriptom zurückzuführen ist (Abb. 1a, ergänzende Abb. S1).

Auswirkungen von CHX auf die Gesamt-Ribosomendichte in kodierenden Sequenzen. (a) Streudiagramme zum Vergleich der mRNA-Spiegel (oben) und der Ribosomendichte (unten) zwischen unbehandelten und CHX-behandelten Zellen. Die Daten sind für Zellen dargestellt, die in Gegenwart einer Stickstoffquelle (+N) oder unter Stickstoffmangel (-N) wachsen. Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, sind in grün dargestellt. Alle Daten wurden auf RPKMs (Reads Per Kilobase per Million mapped reads) normalisiert. (b) Links: Boxplots zum Vergleich der ribosomalen Dichten zwischen unbehandelten und CHX-behandelten Zellen für Gengruppen mit den angegebenen durchschnittlichen Längen der kodierenden Sequenzen. Rechts: ähnliche Daten für die angegebenen Längen der 5′-Leadersequenzen. Die roten Kästen zeigen das Verhalten der mRNAs, die für ribosomale Proteine kodieren. (c) Vergleich der Veränderungen der mRNA-Konzentrationen und der ribosomalen Dichten zwischen Zellen mit Stickstoffmangel (-N) und nicht gestressten Zellen (+N). Die Daten sind für CHX-behandelte Zellen (links) und für unbehandelte Zellen (links) dargestellt. Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, sind grün dargestellt.

Überraschenderweise umfasste diese Gruppe die meisten Gene, die für ribosomale Proteine (RPs, Abb. 1a und ergänzende Abb. S1, grüne Punkte) kodieren. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass CHX subtile Veränderungen in den mRNA-Spiegeln verursacht, verglichen wir die durch Stickstoffmangel induzierten Veränderungen in Gegenwart oder Abwesenheit von CHX (ergänzende Abb. S2). Die mediane Fold-Änderung der mRNA-Spiegel für RP-Gene betrug 0,25 in CHX-behandelten Proben und 0,24 in unbehandelten Zellen, was bestätigt, dass die Veränderungen der ribosomalen Dichte von RP-Genen bei Stickstoffmangel auf Veränderungen der Translation zurückzuführen sind.

RP-Gene sind im Allgemeinen recht kurz, mit einer medianen Länge von 447 Nukleotiden im Vergleich zu 1.131 für alle Gene. Eine einfache Erklärung für diese Anreicherung könnte daher sein, dass CHX das „Abfließen“ von Ribosomen aus kurzen Genen während der Zellsammlung verhindert und damit ihre scheinbare Ribosomendichte erhöht. Obwohl es einen kleinen Trend gab, dass die Ribosomendichte in kürzeren Genen in Gegenwart von CHX höher war, handelte es sich dabei um einen geringen Effekt, der das Verhalten der ribosomalen Proteingene nicht erklären konnte (Abb. 1b). Die mRNAs, die von diesen Genen kodiert werden, haben tendenziell auch kürzere 5′-Leader-Sequenzen (Median 68,5 Nukleotide gegenüber 173 für alle Gene), aber es gab keine allgemeine Korrelation zwischen 5′-Leader-Längen und höheren Ribosomendichten in CHX (Abb. 1c). Nur 9 kernkodierte Gene (~0,2 %) zeigten eine Verringerung der Ribosomendichte unter CHX (Abb. 1a und ergänzende Abb. S1), und sie wiesen keine gemeinsamen Merkmale auf.

Im Gegensatz dazu hatte das Medikament unter Nicht-Stress-Bedingungen eine sehr schwache Auswirkung auf die ribosomale Dichte (durchschnittliches R = 0,98), wobei weniger als 1 % der Gene Unterschiede in der Dichte von mehr als dem Zweifachen zeigten (23 Gene höher unter CHX und 9 niedriger, Abb. 1a und ergänzende Abb. S1). Interessanterweise war die kleine Gruppe von Genen, die in mit CHX behandelten Zellen geringere Dichten aufwiesen, auch mit ribosomalen Proteingenen angereichert (12/23 mRNAs).

Wir kommen zu dem Schluss, dass mRNAs, die für RPs kodieren, besonders empfindlich auf das Vorhandensein von CHX reagieren, und dass dieses Phänomen nicht allein durch ihre kurzen 5′-Leader- und Kodierungssequenzen erklärt werden kann. Darüber hinaus ist die Wirkung nur unter Ernährungsstress stark. Diese Ergebnisse lassen jedoch nicht erkennen, welche der beiden Proben (CHX-behandelt oder -unbehandelt) die in vivo-Situation besser widerspiegelt. RP-Gene sind beispielsweise reich an optimalen Codons, was bedeutet, dass die Translationsdehnung mit hoher Geschwindigkeit erfolgt. Diese Eigenschaft, zusammen mit ihrer kurzen Länge, könnte sie empfindlicher gegenüber Ribosomenabfluss während der Sammlung machen. In diesem Fall würde CHX die In-vivo-Verteilung stabilisieren. Alternativ ist es auch möglich, dass CHX eine direkte Auswirkung auf die Translation dieser mRNAs hat, was zu unphysiologischen Ribosomendichten führt.

Anschließend untersuchten wir, ob die durch CHX verursachten Veränderungen der Ribosomendichte die Interpretation der translatorischen/transkriptionellen Reaktion auf Stickstoffmangel beeinflussen würden. Wir quantifizierten die Translationseffizienz (TE), indem wir die RPF-Zahlen mit den mRNA-Spiegeln normalisierten, und berechneten die logarithmische Änderung der TE- und Transkriptionsspiegel zwischen Zellen, die in stickstoffhaltigem Medium und Zellen unter Stickstoffmangel gewachsen waren (Abb. 1c und ergänzende Abb. S1B). In Gegenwart von CHX führte der Stickstoffmangel zu einer deutlichen Herabregulierung der mRNA-Spiegel, die für RPs kodieren, hatte aber keinen Einfluss auf deren TE. In Experimenten, die in Abwesenheit von CHX durchgeführt wurden, schienen diese mRNAs dagegen sowohl auf der mRNA- als auch auf der TE-Ebene herunterreguliert zu sein. Somit kann die Vorinkubation mit CHX im Medium die TE bestimmter Gengruppen beeinflussen. Die Häufigkeit von mRNAs, die für RPs kodieren, ist sehr stark koreguliert22,23,24; unsere Ergebnisse zeigen, dass diese mRNAs auch auf der Ebene der Translationseffizienz ein koordiniertes Verhalten zeigen. Der Grund für die extreme Empfindlichkeit dieser mRNAs gegenüber CHX muss noch geklärt werden.

Bei den meisten Genen hat die Behandlung mit CHX jedoch keine Auswirkungen auf die ribosomale Dichte, unabhängig von den Wachstumsbedingungen. Ähnliche Ergebnisse wurden für Säugetierzellen in Kultur berichtet, wobei CHX keine signifikante Auswirkung auf genspezifische Ribosomendichten hatte. Dies wurde jedoch nur in nicht gestressten Zellen untersucht13.

Veränderungen in der Verwendung von Upstream Open Reading Frames

S. cerevisiae-Zellen zeigen eine Anhäufung von Ribosomen-Fußabdrücken in 5′-Leader-Sequenzen, die unter Stressbedingungen zunimmt, was auf eine stärkere Verwendung von uORFs schließen lässt1, 9, 10. Diese Schlussfolgerungen sind jedoch umstritten und werden auf die Verwendung von CHX in Zellkulturen zurückgeführt8.

Um diese Frage in S. pombe zu klären, verglichen wir die Anhäufung von Leseabdrücken in 5′-Leader- und kodierenden Sequenzen (Abb. 2a) vor und nach Stickstoffmangel. Wir quantifizierten diesen Wert zunächst, indem wir das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl der Ribosomen-Fußabdrücke in 5′-Leadern und in kodierenden Sequenzen maßen. Der Stickstoffmangel in CHX-behandelten Zellen führte zu einem durchschnittlichen Anstieg um das 5,5-fache, während unbehandelte Zellen einen durchschnittlichen Anstieg um das 2,1-fache aufwiesen (beide Anreicherungen waren in allen biologischen Replikaten gleich, Abb. 2b). Da die Gesamtverhältnisse durch Veränderungen in einer kleinen Anzahl von sehr häufig vorkommenden Genen dominiert werden könnten, quantifizierten wir auch die Verhältnisse zwischen den Fußabdrücken in 5′-Leitsequenzen und kodierenden Sequenzen für alle einzelnen Transkripte, die den Expressionsschwellenwert überschritten (siehe Methoden für Details und Abb. 2c und ergänzende Abb. S3 für die Ergebnisse). In Übereinstimmung mit dem vorherigen Ergebnis gab es einen deutlichen Anstieg der Ribosomen-Fußabdrücke in 5′-Leader-Sequenzen bei Stickstoffmangel für die meisten Gene (Abb. 2c und ergänzende Abb. S3; beachten Sie, dass der Anstieg im zweiten Replikat geringer, aber immer noch signifikant ist), mit einem mittleren Anstiegsverhältnis von 3,8 bzw. 1,9 für plus/minus CHX (Abb. 2d, beachten Sie das ähnliche Verhalten beider Replikate). Im Gegensatz zu den Ergebnissen aus S. cerevisiae wurde also die 5′-Leader-Ribosomendichte durch Ernährungsstress in allen Experimenten erhöht, obwohl der Effekt in CHX-behandelten Zellen wesentlich höher war. Ein möglicher Vorbehalt ist natürlich, dass in der S. cerevisiae-Studie eine andere Art von Stress verwendet wurde8. Angesichts der Tatsache, dass eine gewisse Akkumulation sowohl mit als auch ohne medikamentöse Behandlung zu beobachten ist, können wir jedoch schlussfolgern, dass Stickstoffmangel in S. pombe zu höheren ribosomalen Dichten an 5′-Leadersequenzen führt. Dieser Anstieg der Dichte könnte auf die Translation von uORFs zurückzuführen sein, obwohl wir nicht ausschließen können, dass er das erhöhte Rauschen in gestressten Proben widerspiegelt. Die ergänzende Abb. S4 zeigt zwei Beispiele von uORFs, die als Reaktion auf Stickstoffmangel induziert werden. Die biologische Bedeutung und die mechanistische Grundlage dieses Phänomens (sowie die Frage, ob es allgemein für alle Stressbedingungen gilt) sind noch unbekannt.

Auswirkungen von CHX auf die Ribosomendichte an 5′-Leadersequenzen. (a) Experimenteller Aufbau: RPFs in kodierenden Sequenzen (CDS) und 5′-Leadersequenzen werden unter verschiedenen Versuchsbedingungen quantifiziert. (b) Verhältnis der gesamten Reads, die auf 5′-Leader-Sequenzen abgebildet werden, zu den gesamten Reads, die auf kodierende Sequenzen (CDS) abgebildet werden, für unbelastete Zellen (+N) und Zellen unter Stickstoffmangel (-N) sowie für mit CHX behandelte oder unbehandelte Zellen (±CHX). Die Zahlen geben die Fold-Differenz zwischen Paaren von -N- und +N-Proben an. Die Daten sind für zwei biologische Wiederholungen dargestellt. (c) Streudiagramm zum Vergleich des Verhältnisses von Reads, die auf 5′-Leader-Sequenzen abbilden, zu Reads, die auf kodierende Sequenzen (CDS) für einzelne Gene abbilden; jedes Diagramm vergleicht unbelastete Zellen (+N) und Zellen unter Stickstoffmangel (-N). Die Daten werden für mit CHX behandelte (links) oder unbehandelte (rechts) Zellen dargestellt. Die roten Linien entsprechen einem Verhältnis von 1. (d) Durchschnittswerte für die in (c) dargestellten Verhältnisse. Die Zahlen geben die Fold-Differenz zwischen Paaren von -N- und +N-Proben an. Die Daten sind für zwei biologische Wiederholungen dargestellt.

Verteilung der Ribosomen entlang kodierender Sequenzen

S. cerevisiae-Zellen weisen eine asymmetrische Ribosomenverteilung entlang kodierender Sequenzen auf, mit einer breiten Spitze höherer Ribosomenbelegung in den ersten ~300-400 Nukleotiden der kodierenden Sequenz1, 9, 14, 20, die durch verschiedene Belastungen stark verstärkt wird1, 8, 12.

Wir untersuchten dieses Phänomen in S. pombe auf zwei Arten: erstens durch die Berechnung des Verhältnisses zwischen den Fußabdrücken in den Nukleotiden 10 bis 400 und 401 bis 800 (Abb. 3a-c, die ersten 9 Nukleotide wurden nicht berücksichtigt, um Verzerrungen zu vermeiden, die durch die Anhäufung von Ribosomen am einleitenden AUG entstehen); zweitens durch die Untersuchung des Verhaltens eines Metagenes, das die genomweite Ribosomendichte entlang kodierender Sequenzen darstellt (Abb. 3d und ergänzende Abb. S5).

Auswirkungen von CHX auf die Ribosomenverteilung entlang kodierender Sequenzen. (a) Experimenteller Aufbau: RPFs auf den Nukleotiden 10 bis 400 und auf den Nukleotiden 401-800 werden unter verschiedenen Versuchsbedingungen quantifiziert, und das Verhältnis zwischen beiden Zahlen wird berechnet. (b) Mittlere Verhältnisse, berechnet wie in A beschrieben, für alle kodierenden Sequenzen, in An- und Abwesenheit einer Stickstoffquelle (±N) und in An- und Abwesenheit einer CHX-Behandlung (±CHX). Die Zahlen geben den Fold-Unterschied zwischen gepaarten -N- und +N-Proben an. Die Daten werden für zwei biologische Replikate dargestellt. (c) Streudiagramm zum Vergleich der in A für einzelne Gene ermittelten Verhältnisse; jedes Diagramm vergleicht nicht gestresste Zellen (+N) und Zellen mit Stickstoffmangel (-N). Die Daten werden für mit CHX behandelte (links) und unbehandelte (rechts) Zellen dargestellt. Die roten Linien entsprechen einem Verhältnis von 1. (d) Metagene, die die durchschnittlichen Verteilungen von RPFs entlang kodierender Sequenzen in vier Versuchsbedingungen zeigen. Ein laufendes Fenster von 60 Nukleotiden wurde verwendet, um die gezeichneten Linien zu glätten.

In Abwesenheit von Stress zeigten S. pombe-Zellen sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Medikaments kleine Schultern, ähnlich denen, die für S. cerevisiae ohne CHX1, 14, 20 berichtet wurden (Abb. 3d und ergänzende Abb. S5). Bei Nährstoffstress verhielt sich S. pombe ähnlich wie S. cerevisiae 12. In Anwesenheit von CHX kam es bei den meisten Genen zu einer deutlichen Anhäufung von Reads im 5′-Teil der kodierenden Sequenz (Abb. 3c und ergänzende Abb. S5, linker Plot), was sich auch in einem ~2,0-fachen Anstieg der durchschnittlichen Dichte in den ersten 400 Nukleotiden der mRNA widerspiegelte (Abb. 3b). Im Gegensatz dazu war dieser Anstieg in Abwesenheit des Medikaments vernachlässigbar, sowohl bei der Untersuchung einzelner Gene (Abb. 3c (rechtes Diagramm) und ergänzende Abb. S5) als auch bei der Messung der durchschnittlichen Verhältnisse (Abb. 3b, beachten Sie, dass sich beide Replikate gleich verhalten). Außerdem wurde die CHX-Abhängigkeit der Akkumulation von Reads bei Stickstoffmangel durch die Metagene-Daten bestätigt (Abb. 3d und ergänzende Abb. S5). Schließlich stellten wir fest, dass dieser Effekt spezifisch für RPFs war, indem wir eine Metagene auf der Grundlage von mRNA-seq-Daten aufzeichneten (ergänzende Abb. S5).

Wir überlegten auch, ob diese Beobachtungen auch für kleinere Gene gelten würden. Zu diesem Zweck haben wir Metagene für RP-Gene und für kleine Gene (weniger als 200 Codons) ohne RP-Gene erstellt. In beiden Fällen verursachte CHX eine deutliche Zunahme auf der 5′-Seite der kodierenden Sequenzen (vor allem bei RP-Genen), die sowohl von der Stickstoffarmut als auch von der CHX-Behandlung abhängig war (ergänzende Abb. S5).

Außerdem kam es zu einer Anhäufung von Ribosomen auf Initiationscodons (ergänzende Abb. S6). Dieses Merkmal war bereits in unbehandelten Zellen vorhanden, wurde jedoch durch die CHX-Inkubation verstärkt (sowohl in Kontrollzellen als auch in Zellen mit Stickstoffmangel). Diese Anreicherung war in stickstoffarmen Zellen etwas höher, unabhängig von der CHX-Behandlung (ergänzende Abb. S6).

Es gibt also eine deutliche Anhäufung von Ribosomen im Anfangsteil von kodierenden Sequenzen, die in S. pombe und S. cerevisiae konserviert ist und die sowohl mit als auch ohne CHX-Vorbehandlung beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu wird die stressinduzierte Verstärkung in Abwesenheit von CHX in beiden Hefen nicht durchgängig beobachtet, so dass es keine ausreichenden Hinweise darauf gibt, dass sie in vivo auftritt. In Zukunft könnte der Einsatz von in vivo-Vernetzungsstrategien25 dazu beitragen, zwischen diesen beiden Interpretationen zu unterscheiden.

Codonbelegung

Im Prinzip steht die normalisierte ribosomale Belegung einzelner Codons im Zusammenhang mit der Zeit, die das Ribosom an jedem Codon verbringt, und kann somit zur Schätzung der durchschnittlichen codonspezifischen Translationsraten verwendet werden. Die ersten Experimente zur Untersuchung dieses Phänomens ergaben jedoch widersprüchliche Ergebnisse17,18,19,20. Eine elegante Studie von Hussmann et al., die neuartige Experimente, eine Metaanalyse zahlreicher Ribosomen-Profiling-Experimente aus S. cerevisiae und eine mathematische Modellierung umfasste9, ergab, dass diese Widersprüche durch die Wirkung von CHX auf die Bestimmung der codonspezifischen Ribosomenbelegung erklärt werden können. Experimente verschiedener Gruppen, die in Anwesenheit von CHX durchgeführt wurden, wiesen ähnliche Ribosomen-Codon-Besetzungen auf wie die Experimente, die ohne das Medikament durchgeführt wurden. Die Korrelationen zwischen CHX- und Nicht-CHX-Versuchen waren jedoch sehr gering. Darüber hinaus ergaben Experimente mit CHX kodonspezifische Translationsraten, die negativ mit der Häufigkeit kognitiver tRNAs korrelierten, während die Experimente ohne CHX-Behandlung die erwarteten positiven Korrelationen zeigten9, 20. Hussmann et al. schlugen vor, dass die Ribosomen die Translation in Gegenwart von CHX im Medium nicht sofort einstellen. Stattdessen wird die Translation für einige wenige Codons mit codonspezifischen Translationsraten fortgesetzt9, was zu artefaktischen Codonbelegungen führt.

Um dieses Phänomen zu untersuchen, analysierten wir codonspezifische ribosomale Belegungen an A-Sites wie in Methoden beschrieben. Kurz gesagt, wir ordneten jeden Read, der einer kodierenden Sequenz zugeordnet war, der A-Site eines Ribosoms zu (das entspricht dem Nukleotid 16 eines ribosomal geschützten Fragments). Anschließend berechneten wir die normalisierte Belegung für jedes Codon im gesamten Genom (indem wir die Häufigkeit, mit der das Ribosom auf jedem Codon positioniert ist, durch die Häufigkeit des Codons in der mRNA teilten). Ohne Verzerrungen sollte dieser Wert die durchschnittliche Zeit widerspiegeln, die das Ribosom an jedem Codon verbringt.

Wir verglichen zunächst die Wirkung von CHX auf die codonspezifischen ribosomalen Belegungen (Abb. 4, ergänzende Abbildungen S7 und S8). Überraschenderweise war die Korrelation zwischen beiden Experimenten sehr hoch, mit Durchschnittswerten von 0,82 für Stickstoff-Starvation (Abb. 4a und ergänzende Abb. S7) und 0,86 für nicht gestresste Zellen (Abb. 4b und ergänzende Abb. S7). Bei ähnlichen Vergleichen in S. cerevisiae war die Mehrzahl der Korrelationen negativ9. So gehörten beispielsweise seltene Codons wie CCG (Prolin) und CGG (Arginin) in Abwesenheit von CHX zu den am stärksten besetzten Codons, verloren diese Anreicherung jedoch in CHX-behandelten Proben9. Im Gegensatz dazu waren in dem S. pombe-Datensatz sowohl CCG als auch CGG unabhängig von der Anwesenheit von CHX angereichert (wenn auch weniger stark in unbehandelten Zellen, Abb. 4c und ergänzende Abb. S7). Darüber hinaus hatte der Ernährungsstress nur eine sehr geringe Auswirkung auf die codonspezifischen ribosomalen Belegungen sowohl in Gegenwart (Abb. 4c und ergänzende Abb. S7, durchschnittliches R = 0,96) als auch in Abwesenheit von CHX (Abb. 4d und ergänzende Abb. S7). 4d und ergänzende Abb. S7, durchschnittliches R = 0,98).

Auswirkungen von CHX auf die relativen Codonbesetzungen. Streudiagramme mit den relativen Codonbesetzungen, die wie in Methoden beschrieben ermittelt wurden. Jeder Punkt entspricht einem einzelnen Codon. Terminationscodons sind nicht dargestellt. Die Positionen der seltenen Codons CCG und CGG sind angegeben. Die gepunkteten Linien entsprechen den 1,5-fachen Unterschieden. Die Pearson-Korrelationen zwischen den Datensätzen sind angegeben. (a) Vergleich der Auswirkungen der CHX-Behandlung in Zellen mit Stickstoffmangel. (b) Wie in (a), für Zellen, die mit einer Stickstoffquelle gewachsen sind. (c) Vergleich der Auswirkungen von Stickstoffmangel in Gegenwart von CHX. (d) Wie in (c), in Abwesenheit von CHX.

Schließlich untersuchten wir die Korrelation zwischen der tRNA-Häufigkeit und den codonspezifischen Belegungen. Dazu wurde der tRNA Adaptation Index (tAI) verwendet, ein Maß für die tRNA-Nutzung für jedes Codon, das teilweise auf der tRNA-Kopienzahl basiert (höhere Zahlen sagen eine effizientere Translation voraus)26. Experimente mit S. cerevisiae, die in Anwesenheit von CHX in der Kultur durchgeführt wurden, zeigen negative Korrelationen zwischen dem Kehrwert des tAI (1/tAI) und den codonspezifischen Belegungen, was darauf hindeutet, dass Codons mit niedrigem tAI (und damit niedrigen tRNA-Häufigkeiten) schneller übersetzt werden. Im Gegensatz dazu zeigten Experimente mit nicht mit CHX vorbehandelten Zellen die erwartete positive Korrelation zwischen 1/tAI (obwohl die tatsächlichen Werte von Experiment zu Experiment sehr unterschiedlich waren)9. In S. pombe stellten wir fest, dass in jedem der acht Experimente zur Erstellung von Ribosomenprofilen die codonspezifischen Belegungen eine positive Korrelation mit 1/tAI aufwiesen, mit einem Durchschnitt von 0,39 (Tabelle 2).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass CHX in S. pombe eine relativ geringe Auswirkung auf die Position der Ribosomen auf spezifischen Codons hat. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass S. pombe-Zellen besonders empfindlich auf CHX reagieren, so dass CHX die Ribosomenbewegungen schneller und vollständiger blockiert als in S. cerevisiae. Diese Eigenschaft würde die Bewegung von Ribosomen mit veränderten Raten (wie sie in S. cerevisiae postuliert wird) verhindern und dazu führen, dass mit CHX behandelte und unbehandelte S. pombe-Zellen im stationären Zustand ähnliche Ribosomenverteilungen aufweisen würden. Die Tatsache, dass seltene Codons in Gegenwart von CHX weniger angereichert sind, legt jedoch nahe, dass CHX bei Experimenten zur Bestimmung codonspezifischer Ribosomenverteilungen weggelassen werden sollte.