Revolutionerande kryo-EM tar över strukturbiologin

En revolutionerande teknik för att bestämma proteiners 3D-form är på stark frammarsch. Förra veckan fick en databas som samlar proteiner och andra molekylära strukturer som bestämts med hjälp av kryoelektronmikroskopi, eller cryo-EM, sin 10 000:e post.

Insändningarna till Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – ett populärt arkiv för strukturer som lösts med hjälp av elektronmikroskopi – har ökat exponentiellt under de senaste åren, till stor del på grund av den explosionsartade ökningen av antalet kryoelektronmikroskop i laboratorier över hela världen (se ”Structure sleuths”). EMDB kurerar strukturer som lösts med andra mikroskopimetoder, men de allra flesta använder kryo-EM.

Tekniken innebär att man snabbfryser lösningar av proteiner eller andra biomolekyler och sedan bombarderar dem med elektroner för att producera mikroskopbilder av enskilda molekyler. Dessa används för att rekonstruera molekylens 3D-form eller struktur. Sådana strukturer är användbara för att avslöja hur proteiner fungerar, hur de fungerar dåligt vid sjukdom och hur man kan rikta in sig på dem med läkemedel.

I årtionden föredrog strukturbiologer att använda röntgenkristallografi, en teknik som innebär att man kristalliserar proteiner, bombarderar dem med röntgenstrålar och rekonstruerar deras form från de avslöjande mönstren av diffrakterat ljus som uppstår. Röntgenkristallografi ger högkvalitativa strukturer, men det är inte lätt att använda den för alla proteiner – vissa kan ta månader eller år att kristallisera, och andra kristalliseras aldrig alls. Kryo-EM kräver inte proteinkristaller, men tekniken försmäktade eftersom den tenderade att producera strukturer med låg upplösning – vissa forskare kallade den för blobologi.

Bild perfekt

Genombrott inom hård- och mjukvara 2012-13 gav upphov till känsligare elektronmikroskop och sofistikerad mjukvara för att omvandla de bilder som de fångade till skarpare molekylära strukturer (se ”Fina detaljer”). Detta banade väg för den nuvarande tillväxten av kryo-EM, säger Sjors Scheres, strukturbiolog och specialist på tekniken vid MRC Laboratory of Molecular Biology (LMB) i Cambridge, Storbritannien.

Richard Henderson, en av LMB:s strukturbiologer som delade 2017 års nobelpris i kemi för sitt arbete med att utveckla tekniken, säger att även efter dessa framsteg gick tillväxten långsamt till en början, eftersom endast ett litet antal laboratorier hade tillgång till utrustningen. Men när de började använda cryo-EM för att ta fram detaljerade kartor över molekyler som ribosomen – cellernas proteinskapande maskiner – fick andra forskare, liksom deras institutioner och finansiärer, snabbt upp ögonen för detta. ”Alla som hade investerat i andra saker och fattat fel beslut, det tog dem ett år att komma ikapp”, säger Henderson.

Han uppskattar att år 2024 kommer fler proteinstrukturer att bestämmas genom kryo-EM än genom röntgenkristallografi. Cryo-EM har redan ersatt röntgenkristallografi för en kategori av proteiner som forskarna är särskilt intresserade av – de som är inbäddade i cellmembran. Många sådana membranbundna proteiner är inblandade i sjukdomar och fungerar som måltavlor för läkemedel.

Förbättrad avbildning

Molekylstrukturerna som bestäms med cryo-EM blir också allt mer detaljerade, tack vare ständiga förbättringar av hård- och mjukvara, säger Scheres.

Inledningsvis var de skarpaste cryo-EM-strukturerna av mycket stabila proteiner som användes för att testa teknikens gränser. Men Scheres har märkt att forskarna allt oftare får fram mycket högupplösta strukturer av medicinskt viktiga molekyler, t.ex. cellmembranproteiner, även om de tenderar att fladdra runt.

”Vi kommer nu till en punkt där de enkla proverna har gjorts och folk tittar på mer komplexa problem”, säger Ardan Patwardhan, strukturbiolog vid European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute i Hinxton, Storbritannien, som leder den grupp som driver EMDB.

Henderson förväntar sig att boomen av cryo-EM-strukturer kommer att avta vid någon tidpunkt. En faktor som kan hämma tillväxten, säger han, är den höga kostnaden för de mest kraftfulla mikroskopen, som kan överstiga 5 miljoner pund (7 miljoner US-dollar). De kostar också tusentals pund per dag att driva och kräver specialiserade laboratorier som minimerar vibrationer. Henderson bedriver en kampanj för att övertyga företag att utveckla billigare, men ändå användbara, mikroskop som skulle kunna sprida tekniken ännu mer. ”För närvarande kan man inte göra fel genom att investera mer i kryo-EM”, säger han.