Crio-EM revoluționar pune stăpânire pe biologia structurală

O tehnică revoluționară pentru determinarea formei 3D a proteinelor este în plină expansiune. Săptămâna trecută, o bază de date care colectează structuri proteice și alte structuri moleculare determinate prin crio-microscopie electronică, sau crio-EM, a dobândit cea de-a 10.000-a intrare.

Subscrierile la Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – un depozit popular pentru structuri rezolvate cu ajutorul microscopiei electronice – au crescut exponențial în ultimii ani, în mare parte datorită creșterii explozive a numărului de microscoape crio-electronice în laboratoarele din întreaga lume (vezi „Structure sleuths”). EMDB conservă structuri rezolvate cu alte metode de microscopie, dar marea majoritate utilizează crio-EM.

Tehnica presupune congelarea rapidă a soluțiilor de proteine sau alte biomolecule și apoi bombardarea lor cu electroni pentru a produce imagini microscopice ale moleculelor individuale. Acestea sunt folosite pentru a reconstrui forma 3D, sau structura, a moleculei. Astfel de structuri sunt utile pentru a descoperi cum funcționează proteinele, cum funcționează defectuos în caz de boală și cum să le țintească cu medicamente.

Decenii la rând, biologii structurali au preferat să folosească cristalografia cu raze X, o tehnică care presupune cristalizarea proteinelor, bombardarea lor cu raze X și reconstruirea formei lor din modelele revelatoare de lumină difractată rezultate. Cristalografia cu raze X produce structuri de înaltă calitate, dar nu este ușor de utilizat cu toate proteinele – unele pot avea nevoie de luni sau ani pentru a se cristaliza, iar altele nu se cristalizează niciodată. Crio-EM nu necesită cristale de proteine, dar tehnica a lâncezit deoarece avea tendința de a produce structuri de joasă rezoluție – unii oameni de știință au numit-o blobologie.

Imagine perfectă

În 2012-13, progrese în hardware și software au produs microscoape electronice mai sensibile și software sofisticat pentru transformarea imaginilor pe care le captau în structuri moleculare mai clare (a se vedea „Detalii fine”). Acest lucru a deschis calea pentru creșterea actuală a crio-EM, spune Sjors Scheres, un biolog structural și specialist în această tehnică la MRC Laboratory of Molecular Biology (LMB) din Cambridge, Marea Britanie.

Richard Henderson, un biolog structural de la LMB care a împărțit Premiul Nobel pentru Chimie 2017 pentru activitatea sa de dezvoltare a tehnicii, spune că, chiar și după aceste progrese, creșterea a fost lentă la început, deoarece doar un număr mic de laboratoare au avut acces la echipamente. Dar când au început să folosească crio-EM pentru a produce hărți detaliate ale moleculelor, cum ar fi ribozomul – mașinăriile de fabricare a proteinelor din celule -, alți oameni de știință, precum și instituțiile și finanțatorii lor, au fost rapid luați în seamă. „Tuturor celor care investiseră în alte lucruri și luaseră decizii greșite, le-a luat un an să recupereze decalajul”, spune Henderson.

El estimează că, până în 2024, vor fi determinate mai multe structuri proteice prin crio-EM decât prin cristalografie cu raze X. Crio-EM a suplinit deja cristalografia cu raze X pentru o categorie de proteine de care oamenii de știință sunt deosebit de interesați – cele încorporate în membranele celulare. Multe astfel de proteine legate de membrană sunt implicate în boli și servesc drept ținte pentru medicamente.

Imagistică avansată

Structurile moleculelor determinate prin crio-EM devin, de asemenea, tot mai detaliate, datorită îmbunătățirilor continue ale hardware-ului și software-ului, spune Scheres.

Inițial, cele mai clare structuri crio-EM au fost ale unor proteine foarte stabile care au fost folosite pentru a testa limitele tehnologiei. Dar Scheres a observat că cercetătorii obțin din ce în ce mai mult structuri de foarte înaltă rezoluție ale unor molecule importante din punct de vedere medical, cum ar fi proteinele membranelor celulare, chiar dacă acestea tind să se clatine.

„Ajungem acum la punctul în care probele ușoare au fost făcute și oamenii se uită la probleme mai complexe”, spune Ardan Patwardhan, un biolog structuralist la Laboratorul European de Biologie Moleculară-Institutul European de Bioinformatică din Hinxton, Marea Britanie, care conduce echipa care administrează EMDB.

Henderson se așteaptă ca boom-ul structurilor crio-EM să încetinească la un moment dat. Un factor care ar putea afecta creșterea, spune el, este costul ridicat al celor mai puternice microscoape, care poate depăși 5 milioane de lire sterline (7 milioane de dolari). De asemenea, funcționarea acestora costă mii de lire sterline în fiecare zi și necesită laboratoare specializate care să minimizeze vibrațiile. Henderson face campanie pentru a convinge firmele să dezvolte microscoape mai ieftine, dar totuși utile, care ar putea răspândi tehnica și mai mult. „În momentul de față, nu poți da greș dacă investești mai mult în crio-EM”, spune el.

.