Ce, de ce și cum se face cultura de explorant

Ce este cultura de explorant și de ce ar trebui să o folosesc?

Cultura de explorant este cultivarea unor bucăți mici de țesut prelevate chirurgical din țesutul sau organul animal. Este o metodă utilă din mai multe motive.

1. Menținerea arhitecturii histotipice și a proprietăților biochimice ale celulelor înseamnă că se aseamănă mai mult cu țesutul in vivo decât liniile celulare stabilite.
2. Tesuturile de explant își păstrează propriile citokine și factori de creștere, ceea ce înseamnă că proliferarea este mai puțin stresantă și mai relevantă din punct de vedere biologic.
3. Celele care migrează din explant sunt în comunicare moleculară cu celulele însoțitoare ale explantului, ceea ce furnizează semnale biochimice și biomecanice cruciale care sunt esențiale pentru morfogeneza, diferențierea și homeostazia țesuturilor.

Când pot utiliza această metodă?

Cultura de explant este utilizată la stabilirea unei varietăți de linii celulare din diferite surse, inclusiv mamifere, rozătoare și păsări. Deoarece culturile se aseamănă mai mult cu situația in vivo a celulelor, această tehnică este utilă într-o mare varietate de aplicații, inclusiv obținerea de celule stem, cercetarea cancerului, ingineria genetică, producția de vaccinuri, depistarea medicamentelor și testarea toxicologică.

Cum se realizează o cultură de explant?

Obținerea explantului

Un explant poate fi obținut pe cale chirurgicală cu ajutorul unui echipament steril de la mamifere, rozătoare sau organe sau țesuturi aviare. De exemplu, o bucată de țesut gingival în urma unei extracții dentare poate fi prelevată ca explant pentru a stabili fibroblaste gingivale umane sau o bucată de țesut adipos poate fi utilizată pentru a stabili celule stem mezenchimale.

Tăiați și curățați explorantul

După ce ați obținut țesutul, este timpul să îl tăiați și să îl curățați. Vreți să-l plasați mai întâi într-o farfurie Petri care conține aproximativ 1-2 ml de mediu incomplet (mediu fără ser). Apoi, folosind o lamă chirurgicală ascuțită, îl puteți tăia (de obicei, în jur de bucăți de 1×1 mm). Colectați bucățile de explant cu ajutorul unei pense sterile și spălați-le ușor. Spălarea se poate face prin transferarea bucăților într-un tub de centrifugare care conține aproximativ 0,5 ml de mediu incomplet. Se amestecă ușor prin pipetarea mediului de 4 până la 5 ori, se lasă piesele să se așeze și se îndepărtează mediul superior. Acest lucru se poate repeta de 2 sau 3 ori.

Cultura explantelor

Aceste explante obținute se plasează aseptic pe o suprafață acoperită și se lasă să se fixeze pe suprafață în prezența unui mediu de cultură bogat. Acesta este de obicei un mediu minim bazal, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) sau Minimum Essential Medium Eagle (MEM) suplimentat cu 10-15% ser. Explantele sunt apoi cultivate în condiții standard de cultură tisulară (pH 7,2-7,4, temperatură 37°C, 5% CO2 și umiditate) pentru a permite migrarea și proliferarea celulelor.

Trebuie să schimbați mediul la fiecare 3 zile, fără a deranja explantele. În funcție de sănătatea și vârsta țesutului, celulele ies din explant în 15-30 de zile. Odată ce începe ieșirea celulelor din explant, adăugați 5 ml de mediu în balon în zilele următoare.

Subcultură și stabilirea liniei celulare

După ce explantele sunt complet înconjurate de celule, puteți tripsiniza celulele și le puteți subcultiva. Este mai bine să folosiți o concentrație mai mică de tripsină (de exemplu, <0,25% de tripsină timp de 5 min). Alegeți o dimensiune adecvată a balonului pentru însămânțare, în funcție de numărul total de celule obținute.

Provocări în cultura de explante

În timp ce explantele sunt foarte bune de utilizat, există câteva obstacole pe care trebuie să le depășiți înainte de a lucra cu ele. Principalele provocări sunt:

• celulele au nevoie de timp pentru a ieși din explant, prin urmare stabilirea unei linii celulare ar putea dura aproximativ o lună
• posibilitatea contaminării prin explant
• generarea de celule eterogene sau a unei populații mixte de celule.

Dar nu vă faceți griji, iată câteva sfaturi simple pentru a depăși aceste probleme.

Celulele mai tinere cresc mai repede

Dacă doriți să obțineți celulele mai repede (în 15 zile), asigurați-vă că recoltați explantul de la un donator sănătos și tânăr. Deoarece celulele mai tinere se divid și cresc mai repede, acestea își păstrează creșterea caracteristică și in vitro, astfel încât șansele de a obține rapid celulele din explant sunt foarte mari.

Evitați contaminarea

Contaminarea prin explant poate fi evitată prin înmuierea bucății de țesut într-o soluție de povidonă iodată timp de 2-3 min. Îndepărtați reziduurile rămase de povidonă-iod prin clătirea explantului în soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,4). Puteți plasa apoi explantul în mediu minim incomplet și puteți separa țesuturile dure sau moarte, dacă există.

Obținerea unei populații celulare omogene dintr-o populație eterogenă

În mod obișnuit, în cultura de explante se observă celule eterogene la primele treceri. Pentru a depăși această problemă, aplicați cunoștințele dumneavoastră despre morfologia și modelul de creștere a celulelor care vă interesează. În cazul culturii explantelor de țesut gingival, celulele fibroblaste gingivale fusiforme ies primele din explant, înainte de apariția celulelor keratinocitelor gingivale.

Keratinocitele gingivale au o morfologie ovală până la cobblestone, încep să apară la o săptămână după ce celulele fibroblaste au ieșit din explant. și cresc deasupra monostratului de celule fibroblaste (figura 1).

Figura 1. Propagarea celulelor fibroblaste gingivale umane cu keratinocite abia ieșite din țesutul de explant gingival

Dacă scopul este de a stabili o linie celulară de fibroblaste gingivale din țesut gingival, lăsați balonul să devină confluent cu celule fibroblaste și apoi subcultivați-l imediat. Deoarece celulele de keratinocite sunt mai puțin numeroase, acestea dispar în cele 3 sau 4 treceri ulterioare (figura 2).

Figura 2. Un monostrat de celule fibroblaste gingivale umane

Dacă scopul este de a stabili celule de keratinocite din explantul gingival, răzuiți celulele fibroblaste și adăugați mediul specific keratinocitelor în balon, astfel încât să fie susținută doar creșterea keratinocitelor.

Metoda de explorare este o tehnică simplă și eficientă din punct de vedere al costurilor, utilizată pentru a stabili linii celulare care au. proprietăți histolitice, biochimice și biomecanice similare cu cele in vivo. Prin urmare, această metodă este acceptată și utilizată pe scară largă în biologia celulară și moleculară. Folosiți cultura de explante în laboratorul dumneavoastră? Ați lua-o în considerare? Lăsați un comentariu mai jos.