O Que, Porquê e Como da Cultura Explicativa

O que é Cultura Explicativa e Porque Devo Usá-la?

Cultura Vegetal é a cultura de pequenos pedaços de tecido removidos cirurgicamente de tecido ou órgão animal. É um método útil por várias razões.

1. A manutenção da arquitetura histópica e propriedades bioquímicas das células significa que se assemelha mais ao tecido in vivo do que linhas celulares estabelecidas.
2. Os tecidos vegetais retêm suas próprias citocinas e fatores de crescimento, o que significa que a proliferação é menos estressante e mais relevante biologicamente.
3. As células que migram do explante estão em comunicação molecular com as células companheiras do explante, isto fornece sinais bioquímicos e biomecânicos cruciais que são essenciais para a morfogênese, diferenciação e homeostasia dos tecidos.

Quando posso usar este método?

A cultura de plantas é usada no estabelecimento de uma variedade de linhas celulares de diferentes fontes, incluindo mamíferos, roedores e aves. Como as culturas se assemelham mais à situação in vivo das células, esta técnica é útil em uma grande variedade de aplicações, incluindo a obtenção de células-tronco, pesquisa de câncer, engenharia genética, produção de vacinas, triagem de drogas e testes toxicológicos.

Como posso realizar uma cultura explicativa?

Obtendo o Explant

Um explante pode ser obtido cirurgicamente usando equipamento estéril de mamíferos, roedores ou órgãos ou tecidos aviários. Por exemplo, um pedaço de tecido gengival após a extração dentária pode ser removido como um explante para estabelecer fibroblastos gengivais humanos ou um pedaço de tecido adiposo pode ser usado para estabelecer células-tronco mesenquimais.

Cortar e Limpar o Explant

Pós ter o seu tecido, é hora de cortá-lo e limpá-lo. Você quer colocá-lo primeiro numa placa de Petri contendo cerca de 1-2 mL de meio incompleto (meio sem soro). Depois, usando uma lâmina cirúrgica afiada, você pode cortá-lo (geralmente em pedaços de cerca de 1×1 mm). Recolha os pedaços de explante usando uma pinça esterilizada e lave suavemente. A lavagem pode ser feita transferindo os pedaços para um tubo centrífugo contendo cerca de 0,5 mL de meio incompleto. Misture suavemente, pipetando o meio 4 a 5 vezes, e deixe as peças assentarem e removerem o meio superior. Isto pode ser repetido 2 ou 3 vezes.

Cultura dos Explosivos

Estes explantes obtidos são colocados assepticamente sobre uma superfície revestida e permitem a fixação à superfície na presença de um meio de cultura rico. Este é geralmente um meio mínimo basal, o meio de cultura Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ou Minimum Essential Medium Eagle (MEM) suplementado com soro de 10-15%. Os explantes são então cultivados em condições padrão de cultura de tecidos (pH 7,2-7,4, temperatura 37°C, 5% CO2 e umidade) para permitir a migração e proliferação celular.

Você precisa trocar o meio de cultura a cada 3 dias sem perturbar os explantes. Dependendo da saúde e da idade do tecido, as células saem do explante dentro de 15-30 dias. Uma vez que o crescimento de células começa a partir do explante, adicionar 5 mL de meio ao frasco nos dias seguintes.

Subcultura e Estabelecimento da Linha Celular

Após os explantes estarem completamente cercados pelas células, pode-se tentar a tripsinização das células e subcultura. É melhor usar uma menor concentração de tripsina (por exemplo <0,25% de tripsina durante 5 min). Escolha um tamanho apropriado de frasco para semear, dependendo do número total de células obtidas.

Desafios na Cultura Explicativa

Embora os explantes sejam ótimos para usar, há alguns obstáculos que você precisa superar antes de trabalhar com eles. Os principais desafios são:

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• células levam tempo para sair do explante, portanto o estabelecimento de uma linha celular pode levar cerca de um mês
• a possibilidade de contaminação por explicações
• a geração de células heterogêneas ou uma população mista de células.

Mas não se preocupe, aqui estão algumas dicas simples para superar estes problemas.

As células jovens crescem mais rápido

Se você quiser obter suas células mais rapidamente (dentro de 15 dias), certifique-se de coletar o explante de um doador saudável e mais jovem. Como as células mais jovens se dividem e crescem mais rapidamente, elas também retêm o seu crescimento característico in vitro, portanto as chances de obter as células rapidamente do explante são muito altas.

Contaminação Evita a Contaminação

A contaminação por explicação pode ser evitada mergulhando o pedaço de tecido em uma solução de iodo povidona por 2 a 3 min. Remover o resíduo restante do iodo povidona-iodo por lavagem do explante em solução salina tampão fosfato (pH 7,4). Você pode então colocar o explante em meio mínimo incompleto e separar tecidos duros ou mortos se houver algum.

Obter uma população celular homogênea de um Heterogêneo

Usualmente, em cultura explante células heterogêneas são observadas em passagens iniciais. Para superar este problema, aplique seus conhecimentos sobre a morfologia e padrão de crescimento das células em que você está interessado. No caso da cultura explante de tecido gengival, as células fibroblastos gengivais em forma de fuso emergem primeiro do explante, antes do aparecimento das células queratinócitos gengivais.

Queratinócitos gengivais aparecem oval a cobblestone na morfologia, começam a aparecer uma semana após o surgimento dos fibroblastos do explante. e crescem acima da monocamada de fibroblastos (Figura 1).

Figura 1. Propagação de fibroblastos gengivais humanos com queratinócitos acabados de sair do tecido explante gengival

Se o objetivo é estabelecer uma linha de fibroblastos gengivais a partir do tecido gengival, deixe o frasco tornar-se confluente com os fibroblastos e, em seguida, subculture-o imediatamente. Como as células queratinócitas são em menor número elas desaparecem nas 3 a 4 passagens subseqüentes (Figura 2).

Figura 2. Uma monocamada de células de fibroblastos gengivais humanos

Se o objetivo é estabelecer células queratinócitas de explante gengival, raspar as células de fibroblastos e adicionar queratinócitos específicos ao frasco para que apenas o crescimento de queratinócitos seja suportado.

Método Explante é uma técnica simples e econômica usada para estabelecer linhas celulares que têm. propriedades histológicas, bioquímicas e biomecânicas semelhantes ao in vivo. Portanto, este método é aceito e amplamente utilizado em biologia celular e molecular. Você usa cultura explant em seu laboratório? Você o consideraria? Deixe um comentário abaixo.