Rewolucyjny krio-EM przejmuje biologię strukturalną

Rewolucyjna technika określania trójwymiarowego kształtu białek przeżywa rozkwit. W zeszłym tygodniu baza danych, która gromadzi białka i inne struktury molekularne określone za pomocą mikroskopii elektronowej, czyli krioEM, uzyskała swój 10-tysięczny wpis.

Zgłoszenia do Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – popularnego repozytorium struktur rozwiązanych za pomocą mikroskopii elektronowej – wzrosły wykładniczo w ostatnich latach, głównie z powodu gwałtownego wzrostu liczby mikroskopów elektronowych w laboratoriach na całym świecie (patrz „Poszukiwacze struktur”). EMDB przechowuje struktury rozwiązane za pomocą innych metod mikroskopii, ale zdecydowana większość z nich wykorzystuje krioEM.

Technika ta polega na błyskawicznym zamrażaniu roztworów białek lub innych biomolekuł, a następnie bombardowaniu ich elektronami w celu uzyskania obrazów mikroskopowych poszczególnych cząsteczek. Są one wykorzystywane do rekonstrukcji trójwymiarowego kształtu lub struktury cząsteczki. Struktury takie są przydatne do odkrycia, jak białka działają, jak źle funkcjonują w chorobie i jak kierować je z drugs.

Przez dziesięciolecia, biologów strukturalnych wolał używać krystalografii rentgenowskiej, techniki, która obejmuje krystalizację białek, pummelling je z promieniowaniem rentgenowskim i rekonstrukcji ich kształtu z powstałych tell-tale wzory rozproszonego światła. Krystalografia rentgenowska pozwala uzyskać wysokiej jakości struktury, ale nie jest łatwa do zastosowania w przypadku wszystkich białek – krystalizacja niektórych z nich może trwać miesiące lub lata, a inne w ogóle się nie krystalizują. KrioEM nie wymaga kryształów białek, ale technika ta podupadła, ponieważ miała tendencję do wytwarzania struktur o niskiej rozdzielczości – niektórzy naukowcy nazywali ją blobologią.

Obraz doskonały

Przełomy w sprzęcie i oprogramowaniu w latach 2012-13 zaowocowały bardziej czułymi mikroskopami elektronowymi i wyrafinowanym oprogramowaniem do przekształcania przechwyconych obrazów w ostrzejsze struktury molekularne (patrz 'Drobne szczegóły’). To utorowało drogę dla obecnego wzrostu cryo-EM, mówi Sjors Scheres, biolog strukturalny i specjalista w tej technice w MRC Laboratory of Molecular Biology (LMB) w Cambridge, UK.

Richard Henderson, biolog strukturalny z LMB, który podzielił się Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 2017 roku za pracę nad rozwojem tej techniki, mówi, że nawet po tych postępach wzrost był początkowo powolny, ponieważ tylko niewielka liczba laboratoriów miała dostęp do sprzętu. Ale kiedy zaczęli używać cryo-EM do tworzenia szczegółowych map cząsteczek, takich jak rybosom – maszyny do tworzenia białek w komórkach – inni naukowcy, a także ich instytucje i fundatorzy, szybko zwrócili na to uwagę. „Wszyscy ludzie, którzy zainwestowali w inne rzeczy i podjęli błędne decyzje, potrzebowali roku, aby nadrobić zaległości”, mówi Henderson.

Oszacował, że do 2024 roku więcej struktur białkowych zostanie określonych za pomocą krio-EM niż za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Cryo-EM już wyparła krystalografię rentgenowską w przypadku jednej kategorii białek, którą naukowcy są szczególnie zainteresowani – tych osadzonych w błonach komórkowych. Wiele takich białek związanych z błonami jest powiązanych z chorobami i służy jako cele dla leków.

Zaawansowane obrazowanie

Struktury cząsteczek określane za pomocą krio-EM są również coraz bardziej szczegółowe, dzięki ciągłym ulepszeniom sprzętu i oprogramowania, mówi Scheres.

Początkowo najostrzejsze struktury krio-EM dotyczyły wysoce stabilnych białek, które były używane do testowania granic tej technologii. Ale Scheres zauważył, że badacze coraz częściej uzyskują struktury o bardzo wysokiej rozdzielczości ważnych z medycznego punktu widzenia cząsteczek, takich jak białka błony komórkowej, nawet jeśli mają one tendencję do rozpadania się.

„Dochodzimy teraz do punktu, w którym łatwe próbki zostały wykonane, a ludzie przyglądają się bardziej złożonym problemom”, mówi Ardan Patwardhan, biolog strukturalny w European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute w Hinxton w Wielkiej Brytanii, który kieruje zespołem prowadzącym EMDB.

Henderson spodziewa się, że boom na struktury krio-EM w pewnym momencie zwolni. Jednym z czynników, który może osłabić wzrost, jak mówi, jest wysoki koszt najpotężniejszych mikroskopów, który może przekroczyć 5 milionów funtów (7 milionów dolarów). Ich codzienne użytkowanie kosztuje również tysiące funtów i wymagają one wyspecjalizowanych laboratoriów, które minimalizują wibracje. Henderson prowadzi kampanię mającą na celu przekonanie firm do opracowania tańszych, ale wciąż użytecznych mikroskopów, które mogłyby jeszcze bardziej rozpowszechnić tę technikę. „W tej chwili nie można popełnić błędu, inwestując więcej w krio-EM” – mówi.